Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I.. Особенности синтеза пептидов, содержащих две и более дисульфидных связей .
1 .Введение. 7
2.Защитные группы тиольной функции цистеина. 8
3. Подходы к синтезу пептидов с двумя дисульфидными связями . 22
4. Подходы к синтезу пептидов с тремя и более дисульфидными связями. 39
5. Проблемы синтеза пептидов содержащих внутри и межмолекулярные дисульфидные связи . - 50
ГЛАВА II. Обсуждение результатов.
1 .Подходы к синтезу а-конотоксинов. 56
2. Выбор последовательностей . 57
3.Синтез а-конотоксинов. 60
4. Исследование взаимосвязи между структурой и биологической активностью а-конотоксинов и их аналогов . 71
ГЛАВА III. Экспериментальная часть. 84
Выводы 99
Список литературы. 100
- Подходы к синтезу пептидов с двумя дисульфидными связями
- Проблемы синтеза пептидов содержащих внутри и межмолекулярные дисульфидные связи
- Выбор последовательностей
- Исследование взаимосвязи между структурой и биологической активностью а-конотоксинов и их аналогов
Введение к работе
Ацетилхолиновый рецептор из электрического органа ската Torpedo californica был одним из первых наиболее полно охарактеризованных мембранных многосубъединичных рецепторов. К настоящему времени проведены различные структурно-функциональные исследования этого белка, известны многие его физические характеристики. Существенный вклад в эти исследования был сделан Институтом биоорганической химии : в течение многих лет никотиновый ацетилхолиновый рецептор изучали здесь прежде всего с использованием а-нейротоксинов змей ( конкурентных антагонистов АХР, узнающих два участка связывания на рецепторе и необратимо блокирующих холинергическую передачу). Однако за два последних десятилетия был выявлен новый класс конкурирующих антагонистов холинорецепторов, действующих примерно на те же участки, что и а-нейротоксины змей - это а-конотоксины.
Альфа-конотоксины, впервые выделенные в 1981 г. из морских улиток семейства Conus - небольшие пептиды, состоящие из 12-18 аминокислотных остатков, конформация которых фиксируется двумя внутримолекулярными дисульфидными связями. Конотоксины, а также их фотоактивируемые и радиоактивные производные, могут служить для определения участка связывания на поверхности рецептора, функционально важного участка, поскольку связывание лиганда с рецептором является основой механизма передачи сигнала от одной клетки к другой. Одновременно, установление трехмерной структуры конотоксинов может прояснить пространственное строение комплементарной поверхности рецептора. Поскольку каждый конотоксин нацелен на специфичный рецепторный белок плазматической мембраны клетки, эти пептиды являются химическими зондами с мощной разрешающей способностью. В настоящее время, конотоксины используются во многих лабораториях для широкого спектра физиологических и фармакологических исследований в нервных системах как позвоночных, так и беспозвоночных. В последнее время ряд конотоксинов предложен для фармацевтического применения, наиболее продвинутое в этом отношении соединение - Зиконотид (Elan Pharmaceuticals)- является синтетическим со-конотоксином MVIIA, который блокирует N-тип кальциевых каналов,
включенных в болевой путь, и рекомендован для применения пациентам с хронической болью. Несмотря на то, что терапевтический индекс этого соединения (отношение терапевтического к побочным эффектам) очень низок, оно является единственным доступным соединением, селективно блокирующим N-тип кальциевых каналов и не вызывающим привыкание, как в случае опиатной терапии . Некоторые другие конотоксины исследуются в настоящее время в качестве лекарств при различных болезненных состояниях : хроническая боль, эпилепсия, кардиовазкулярные болезни, психиатрические расстройства, рак, парилич, расстройства движения. Кроме того, нейромышечные блокирующие агенты (альфа-конотоксины) исследуются как средства анестезии, например, быстрый паралич гортанной мышцы облегчает трахеальное зондирование .
Выделение конотоксинов из яда морских улиток является трудоемкой и непростой задачей,так как яд содержит от 40 до 200 компонентов пептидной природы, и для выделения нескольких микрограммов токсина требуется от 100 до 500 особей улиток. Поэтому прямой химический синтез этого класса соединений является актуальной задачей. Результатом представляемой работы явилась разработка эффективной схемы синтеза конотоксинов, основанной на применении одной защитной группы для всех остатков цистеина и одновременном замыкании двух дисульфидных связей.
Литературный обзор посвящен рассмотрению схем синтеза
дисульфидсодержащих пептидов.
Подходы к синтезу пептидов с двумя дисульфидными связями
Работы по синтезу петидов с двумя дисульфидными мостиками с применением стратегии одновременного замыкания дисульфидных связей немногочисленны и относятся в основном к периоду последних 10 лет. При внешнем разнообразии применяемых методик все синтезы имеют общую стратегию : синтез на полимере линейного пептида, деблокирование и отщепление пептида от полимера, предварительная очистка, реакция образования дисульфидных связей, очистка конечного продукта и доказательство природной структуры дисульфидных связей. Полимерный носитель для синтеза пептида выбирали с учетом двух факторов: используемая система защитных групп аминокислот и вид С-концевой карбоксильной группы в целевом пептиде ( амид или карбоксил). Для получения амида С-концевой аминокислоты с использованием Вос-схемы защитных групп аминокислот в работах [55,56,62,68,69,70] применяли пара-метилбензгидриламино-полимер, если же применяли Fmoc-защищенные аминокислоты, то синтез проводили на более кислотолабильном 4-[(2 ,4 -диметоксифенил)-(Ртос-амино)метил]фенокси-полимере (полимер Ринка) [59,60]. Если С-концевую карбоксильную группу целевого пептида было необходимо получить в свободном виде, то использовали 4-гидроксиметифенилацетамидометильный полимер (РАМ) для Вос-схемы [65,67] или 4-гидроксиметилфеноксиметил-полимер (полимер Ванга) для Fmoc-схемы защитных групп аминокислот [65]. Применение той или иной схемы защитных групп аминокислот в синтезе коротких пептидов, как правило, не оказывает решающего влияния на выход конечного продукта, но при синтезе триптофансодержащих пептидов все же предпочтительнее использовать Fmoc-схему защитных групп, которая обеспечивает более мягкие условия промежуточного деблокирования в процессе наращивания полипептидной цепи и отщепления пептида от полимера, что показано авторами работы [65] на примере синтеза эндотелина-1 и эндотелина -3 (табл. 2). Как правило, в синтезах цистеинсодержащих пептидов для проведения реакции конденсации защищенные аминокислоты активировали либо с помощью тетрафторбората 2 - ( 1 - Н - Бензотриазол - 1 - ил ) - 1, 1,3,3-тетраметилмочевины ( TBTU - метод ) [55,56,59,60,68,69,70], либо гидроксибензотриазол-карбодиимидным методом [62,65,67].
Стандартная методика отщепления пептида от кислотолабильных полимеров с одновременным удалением всех защитных групп приведена в работе [60], посвященной синтезу а-конотоксина EI (табл.2). Пептидил-полимер обрабатывали смесью трифторуксусная кислота: фенол: вода: этандитиол: тиоанизол, 90:7,5:5:2,5:5, v/v в течение 2ч при 25 С. В случае пептидов, синтез которых проводили на бензгидриламино-полимере или РАМ-полимере, для деблокирования и отщепления пептида использовали безводный фтороводород. В подавляющем большинстве случаев пептид обрабатывали смесью фтороводород:анизол или крезол (9:1) в течение Ічаса при 0С [55,65,68,69,70]. В некоторых работах авторы отступали от стандартной методики, например, в ходе синтеза а-конотоксина SI [62] (табл.2) отщепление проводили в два этапа: на первом этапе пептидил-полимер обрабатывали смесью фтороводород:диметилсульфид:п-крезол (25:65:10) в течение 2 часов при 0С, а на втором этапе, продукт обрабатывали смесью фтороводород:п-крезол (9:1) в течение Ічаса при 0С. Обычно двухэтапное деблокирование используют для пептидов, содержащих в своем составе такие аминокислоты как метионин и триптофан, и в случае синтеза а-конотоксина SI не является необходимым. В то же время, применение двухстадийного деблокирования при синтезе 38-членного предшественника эндотелина-1 (табл.2) [67] целесообразно и состояло в обработке пептидил-полимера на первой стадии смесью триметилсилилбромид/тиоанизол/трифторуксусная кислота для удаления формильной защитной группы индольного кольца триптофана, на второй - фтороводородом или смесью триметилсилилтрифторметансульфонат/ Таблица 2. Синтез цистеинсодержащих пептидов с одновременным образованием дисульфидных связей. трифторуксусная кислота для деблокирования остальных защитных групп и отщепления пептида от полимера. Как линейные пептиды, так и пептиды с дисульфидными связями очищали при помощи ВЭЖХ на обращенной фазе в градиенте ацетонитрила в 0.1% трифторуксусной кислоте [55-59,61-71]. При очистке а-конотоксина EI [60] использовали градиент ацетонитрила в 0.05 М триэтиламинофофсфате при рН2.25. Ключевой стадией синтеза цистеинсодержащих пептидов является реакция образования дисульфидных связей, от правильно подобранных условий реакции зависит успех всего синтеза, поэтому остановимся на рассмотрении этой части синтеза дисульфидсодержащих пептидов подробнее. В ряде исследований [59,68,69,70] реакцию окисления проводили кислородом воздуха в 0.1 М бикарбонате натрия (рН 8.0) при комнатной температуре в течение 24-48 часов. Таким образом были получены: а-конотоксин Ері [59] (табл.2), 16-членный а-конотоксин МП [68] (табл.2), ос-конотоксины PnIA [69] и РпГВ [70] (табл.2). Окисление Ері приводило к одному основному и двум минорным изомерам. Основной продукт окисления был идентичен природному а-конотоксину Ері в опытах по совместному элюированию в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ. Окислительное замыкание дисульфидных мостиков в ходе синтеза а-конотоксина ЕІ [60] было проведено кислородом воздуха в водном растворе, содержащем пептид в низкой концентрации при значении рН 7.5. После завершения реакции смесь содержала три пептидных продукта реакции с относительным содержанием 35:60:5.
Все пептиды обладали одинаковым молекулярным весом и являлись структурными изомерами (различное расположение дисульфидных связей). Основной изомер соответствовал природному а-конотоксину ЕІ. Для установления расположения дисульфидных связей в синтетическом пептиде была использована стратегия частичного восстановления Грея [61], которая заключается в восстановлении пептида трис-(2-карбоксиэтил)фосфином, выделении моноциклических продуктов, модификации последних иодацетамидом и секвенировании пептида для определения положения 8-карбоксиамидометил-Ь-цистеиновых остатков, и, следовательно, положения дисульфидных мостиков. В ходе синтеза [64] эндотелина-1 и ряда аналогов окисление SH-содержащих линейных продуктов проводили в 0.1 М аммоний ацетатном буфере при рН 9.5 в присутствии окисленного и восстановленного глутатионов, взятых в соотношении 1/100/10 (пептид/GSSG /GSH). После окончания реакции основной изомер выделяли с помощью обращенно-фазовой ВЭЖХ. Авторы отмечают, что в случае природной последовательности образовывалось 25% изомера с дисульфидными связями между остатками Cys /Cys11 и Cys3/Cys15, в то же время при окислении Lys-Arg-ET-І получили продукт с природным расположением дисульфидных связей. Авторы высказывают гипотезу, что правильное замыкание дисульфидных связей при синтезе аналога может быть вызвано стабилизацией пространственной структуры за счет образования соли между дополнительно введенным остатком аргинина в положении 2 и остатком аспарагиновой кислоты в положении 8. Результаты предыдущего исследования согласуются с данными, представленными в работах [65,66], в которых окисление эндотелина-1 перекисью водорода при рН 8.5 в 8М мочевине приводило к образованию 75-82% природного изомера, но в ходе синтеза эндотелина-3 окисление в тех же условиях приводило к смеси изомеров. Изменение условий реакции окисления (время, концентрация перекиси водорода, концентрация пептида, рН) позволило авторам подобрать оптимальные условия окисления и сделать вывод о том, что преимущественное образование изомеров природной структуры происходит при увеличении рН до 9-9.5. В ходе синтеза а-конотоксина Iml [55] (табл.2) для замыкания дисульфидных мостиков при помощи окисления кислородом воздуха линейный пептид растворяли в смеси изопропанол:вода (1:1), затем рН раствора доводили до 8-9 добавлением диизопропилэтиламина. Реакция окисления была завершена за 5 дней [55], протекание реакции окисления контролировали при помощи обращенно-фазовой ВЭЖХ и теста Эллмана. При синтезе токсина SI [62] линейный пептид сначала восстанавливали
Проблемы синтеза пептидов содержащих внутри и межмолекулярные дисульфидные связи
Синтез А- и В-цепей провели с использованием Вое-стратегии защитных групп, деблокирование и отщепление пептида от полимерного носителя осуществили с помощью трифторметансульфокислоты. Для получения активного производного А-цепи [Cys(Acm)6 7,11,Cys(SH)20]А-цепь обработали 2,2-дитиопиридином для введения S-пиридил группы в тиольную функцию Cys . Затем провели реакцию между [Cys(Acm) ,Cys(S-pyr) ]А-цепью и [Cys(Acm)10,Cys(SH)22]B-4enbio для образования межмолекулярной исульфидной связи Cys -Cys822. Две другие дисульфидные связи (CysA6 г л All /- А7 /- ВІОч /— / Cys , Cys -Cys ) были образованы в одну стадию с одновременным удалением Acm-групп обработкой полипептида иодом в 50% уксусной кислоте . Выход целевого продукта, имеющего идентичные хроматографические и биологические свойства с природным бомбиксином-IV, составил 8% в расчете на С-концевую аминокислоту. Тем же коллективом авторов в следующей работе [165] был синтезирован бомбиксин-IV с поэтапным образованием всех дисульфидных связей. Обе полипептидные цепи были синтезированы с применением Fmoc-схемы защитных групп, деблокирование и отщепление пептида от полимера осуществили трифторуксусной кислотой. Для защиты тиольной функции цистеинов использовали три группы: тритильную (кислотолабильная) для CysA6, CysAU и CysB22, трет-бутильную ( стабильную к обработке трифторуксусной кислотой, но лабильную к действию трифторметансульфокислоты) в положении Cys , и ацетамидометильную (кислотостабильную) в положении CysA7 и CysB1 . Первой была образована связь между остатками CysA6 и CysAU при помощи окисления кислородом воздуха, затем трет-бутильную группу Cys отщепляли трифторметансульфокислотой и получали S-пиридилпроизводное по цистеину А20 обработкой 2,2 -дитиопиридином, и получали межмолекулярную связь Cys -Cys . Последней была образована дисульфидная связь CysA/-Cysmu при помощи обработки иодом. В работе [171] описан синтез бомбиксина-П, имеющего то же расположение дисульфидных связей, что и в бомбиксине-Р/. Конечный продукт был получен с помощью окисления кислородом воздуха смеси химически синтезированных А- и В-цепей со свободными сульфгидрильными группами всех цистеиновых остатков.
Выход бомбиксина-П составил 4% в расчете на С-концевую аминокислоту. В работе [166] тем же коллективом авторов был синтезирован бомбиксин-П с использованием стратегии полуселективного образования дисульфидных связей [164,165]. Отличие от синтеза бомбиксина-IV [164,165] состояло в оптимизации условий окисления иодом [166], с целью подавления окислительной деградации остатка триптофана. Первой была образована межмолекулярная дисульфидная связь между Cys -Cys или CysA7-CysB10 с использованием, как и в синтезе бомбиксина-IV, S-пиридил производных А-цепи. Затем для образования двух других дисульфидных связей тетра-Acm пептид был подвергнут обработке иодом в 95% уксусной кислоте, содержащей 13 экв. соляной кислоты по отношению к пептиду. Как и ожидалось, была получена смесь трех изомеров, природный изомер был определен при помощи совместного элюирования с природным бомбиксином-II. Выход бомбиксина-П составил 32%. В ходе синтеза человеческого релаксина (рис.7) [167], аналогов инсулина (рис.8) и бомбиксина-П [168] применяли поэтапное образование дисульфидных связей. Для получения релаксина цепь А синтезировали, используя Fmoc-схему защитных групп и следующие защитные группы тиольной функции цистеинов: тритильная (кислотолабильная) для CysA1 и CysA15, ацетамидометильная (кислотостабильная) для Cys и метилбензильная ( стабильная к действию трифторуксусной кислоты, но лабильная к сильным кислотам) для Cys . После деблокирования и отщепления А цепи от полимера трифторуксусной кислотой первую дисульфидную связь CysAI0-CysA15 получали обработкой иодом в 50% уксусной кислоте, затем моноциклический пептид обрабатывали фтороводородом для отщепления метилбензильной группы (Cys 4). Цепь В релаксина, с Acm-защитой для Cys311 и Npys-защитой для CysB2 была синтезирована с применением Вос-схемы защитных групп и, после деблокирования и отщепления фтороводородом, [Cys(Acm) Cys(Npys) ]В-цепь была использована для образования межмолекулярной связи Cys -Cys . Третья дисульфидная связь между CysA11 и CysBU была образована с одновременным удалением Аст-защитны групп цистеинов АН и В11 при помощи обработки иодом в 70% уксусной кислоте. Выходы конечных продуктов составили 1-2% в расчете на С-концевую аминокислоту. Два абсолютно разных подхода к синтезу инсулина были продемонстрированы авторами работ [18,169]. В работе [169] для получения инсулина был применен синтез в растворе и окисление иодом как основной метод создания дисульфидных связей. Чтобы добиться селективного образования трех дисульфидных связей был синтезирован фрагмент 14-21 А-цепи инсулина и фрагмент 17-30 В-цепи инсулина, которые были связаны между собой дисульфидной связью Cys 20-CysB19. Далее проводили селективное удаление защитной группы с сс-аминофункции остатка 17 В-цепи и завершали построение В-цепи присоединением фрагмента 1-16. На следующей стадии проводили удаление защитной группы с а-аминофункции остатка 14 А-цепи и завершали построение А-цепи присоединением фрагмента 1-13, содержащего дисульфидную связь CysA6 - CysA". Затем были удалены все защитные группы боковых цепей аминокислот, кроме Acm-защит остатков цистеина 7 А-цепи и 7 В-цепи. На последней стадии синтеза проводили образование дисульфидной связи между остатками CysA7 и CysB7 обработкой иодом. При проведении синтеза по этой
Выбор последовательностей
В качестве базовых последовательностей для синтеза были выбраны два а-конотоксина, различающие два участка связывания в молекуле АХР мышечного типа: а-конотоксины GI и Ml ("мышечные" а-конотоксины) (табл.4), а также два а-конотоксина, взаимодействующие по литературным данным только с одним участком мышечного рецептора: а-конотоксины SIA и EI (табл.4). Для работы с нейрональным АХР был синтезирован а-конотоксин Iml ( "нейрональный" а-конотоксин), с высокой специфичностью действующий на а7 подтип ацетилхолинового рецептора. анее в качестве одного из подходов к изучению топографии лиганд-связывающих центров холинорецепторов применяли метод фотоафинной модификации с использованием фотоактивируемых аналогов а-нейротоксинов яда змей. Нам показалось целесообразным применить для этой цели а-конотоксины. Если в а-нейротоксины фотометки можно было вводить только с помощью химической модификации по имеющимся аминокислотным остаткам белка, то в случае а-конотоксинов был использован не только метод химической модификации, но и введение фотоактивируемых групп в виде аминокислотных остатков L-бензоилфенилаланина с помощью твердофазного пептидного синтеза. Для получения фотоактивируемых аналогов а-конотоксина GI ([Bpa4]GI, [Bpa ]GI, [Bpan]GI, [Bpa12]GI) в ходе пептидного синтеза на остаток L-бензоилфенилаланина заменяли те аминокислотные остатки природного GI, которые по литературным данным являлись не существенными для его биологической активности. Введение ароматических аминокислотных остатков (Вра, Туг) в небольшие молекулы а-конотоксинов позволило также оценить влияние гидрофобных аминокислотных остатков на биологическую активность. Для оценки влияния заряженных групп на активность а-конотоксинов был предпринят синтез ряда аналогов а-конотоксинов GI, Ml и SLA. ([Lys5]MI, [Lys7]MI, [Lysn]MI, [Lys13]MI, [Lys,2]GI, [Asp12]GI, [Lys12]SIA), содержащих остатки Lys и Asp в различных положениях молекул. При этом удалось получить соединения, активность которых превышала таковую исходных природных пептидов. Исследование структурных основ высокой специфичности а-конотоксина GI, действующего на мышечные АХР, и а-конотоксина Iml, связывающегося только с нейрональными а7 холинорецептором, было проведено с использованием двух химерных пептидов, несущих в себе черты обоих а-конотоксинов. Один из них, (GI[2-6]ImI[8-12]), состоял из N-концевой части а-конотоксина GI (аминокислотные остатки 2-6) и С-концевой части а-конотоксина Iml (а.о. 8-12). Для оценки структурной роли петли а-конотоксина Iml, ограниченной остатками Cys и Cys , был синтезирован аналог Iml ([Ser12,Cys13]Imi) с петлей, увеличенной на 1 а.о.
Наконец, несколько недавно выделенных и пока еще недостаточно охарактеризованных а-конотоксинов (МП, АиЮ) были синтезированы по просьбе коллег из лабораторий, проводящих исследования нейрональных АХР. Все синтезы а-конотоксинов в рамках данной работы объединяет подход к образованию дисульфидных связей. Обе дисульфидные связи получали одновременно при помощи окисления тиольных групп остатков цистеина кислородом воздуха в водно-органическом растворе. Такая стратегия образования S-S мостиков подразумевает применение для блокирования тиольных групп всех остатков цистеина одной защитной группы (тритильной, метоксибензильной, трет-бутилтио), которую удаляют при финальном деблокировании и отщеплении пептида от полимера. Кроме общей стратегии, все синтезы объединяет несколько методических подходов, которые оставались неизменными. Так как все а-конотоксины амидированы по С-концевой карбоксильной группе, то для синтеза выбирали полимер (метилбензгидриламино полимер или полимер Ринка), при присоединении к которому стартовой аминокислоты получали амидную связь. Во всех синтезах (кроме синтеза EI) использовали следующий протокол наращивания полипептидной цепи, который содержит меньшее число стадий чем стандартные [185]: Активацию защищенной аминокислоты проводили с помощью TBTU или HOBT-DIPCDI-метода. В случае TBTU метода к смеси 1 эквивалента аминокислоты и 1 эквивалента TBTU в DMF добавляли 1.2 эквивалента диизопропилэтиламина и после перемешивания в течение 5 мин реакционную смесь добавляли к пептидил-полимеру; в другом варианте к аминокислоте и НОВТ (1:1) в DMF добавляли 1 эквивалент DIPCDI и через 10 мин смесь объединяли с пептидилполимером. В реакции конденсации использовали 3-5-кратные избытки активированной аминокислоты. Линейные предшественники а-конотоксинов окисляли при помощи кислорода воздуха в растворе изопропанол:вода (1:1). Этот метод, выбранный на основании серии экспериментов (см. раздел 3.1), является оптимальным для окисления а-конотоксинов. Для проведения реакции окислительного замыкания двух S-S связей пептиды были использованы без дополнительной очистки. значении рН 9-9.5 при синтезе эндотелина-1 [65,66], содержащего две дисульфидные связи. Увеличение значения рН позволило уменьшить время реакции с 36-72 [55] до 18-35 ч, при этом в качестве основного продукта синтеза получали пептид с природным расположением дисульфидных связей. Процесс окисления контролировали при помощи теста Эллмана. Полученные а-конотоксины очищали с использованием препаративной ВЭЖХ. Все синтезированные соединения были охарактеризованы при помощи аналитической ВЭЖХ и масс-спектрометрии (табл.5). Индивидуальные особенности синтеза конкретных сс-конотоксинов рассмотрены в следующих разделах.
Исследование взаимосвязи между структурой и биологической активностью а-конотоксинов и их аналогов
Биологическую активность а-конотоксинов GI, MI, SIA, EI и их производных определяли по их способности взаимодействовать с мембраносвязанным никотиновым ацетилхолиновым рецептором Torpedo californica (табл.6). Такую проверку, не вводя дополнительных модификаций в исследуемые соединения, можно осуществить методом конкурентного радиолигандного анализа по их способности подавлять связывание радиоактивного а-конотоксина с препаратами АХР4. Для этой цели было синтезировано радиоактивное производное а-конотоксина GI с введенным в остаток Туг радиоактивным изотопом иода. Подобная модификация не оказывала существенного влияния на биологическую активность а-конотоксина GI [74,174]. В работе было использовано только моно-[ Циодированное производное а-конотоксина GI. Ингибирующая активность всех полученных аналогов «мышечных» а-конотоксинов в концентрации и 0.1 мМ представлена в Табл.6. За исключением [Bpa4]GI, все они обладали в той или иной степени способностью подавлять связывание [125I]GI с АХР Torpedo californica. В ряде случаев данный тест служил основанием для выбора пептида с правильным замыканием дисульфидных связей из нескольких изомеров, полученных после окисления линейного продукта, поскольку, известно, что неправильное замыкание дисульфидных связей ведет к понижению биологической активности [73,186]. Так были выявлены природные изомеры а-конотоксинов S1A и EI, a также изомер с природным расположением дисульфидных связей для аналога [Asp12]GI. В случае с [Bpa12]GI, когда два изомера были получены практически в одинаковом количестве и при этом оба имели достаточно высокую активность, пептид с природным расположением дисульфидных связей был определен с помощью ЯМР спектрометриии в лаборатории спектрального анализа ИБХ. Этому изомеру отвечает и более высокая (100%) активность. Биологическая активность а-конотоксина Iml и трех его аналогов: [Ser12,Cys13]ImI, GI(2-6)ImI(8-12), [Bpa10]ImI также оценивалась конкурентным радиолигандным анализом, но с использованием экспрессированного в Е. coli экстрацеллюлярного домена а7 субъединицы «нейронального» АХР крысы [187] и [ I]иодированного производного а-бунгаротоксина ([ I]Bgt) в качестве радиолиганда (Табл. 6).
Первые два аналога, несущие в себе как черты а-конотоксина GI, действующего на мышечные АХР, так и а-конотоксина Iml, взаимодействующего только с нейрональным а7 подтипом холинорецептора, были получены для выяснения структурной основы "мышечности" или "нейрональности" а-конотоксинов. Наименее активным в этой серии оказался [Ser12,Cys13]ImI аналог; второй химерный аналог GI(2-6)ImI(8-12), а также фотоактивируемое производное Iml, по своей эффективности оказались близки природному а-конотоксину Iml. Следует отметить, что использование в радиолигандном тесте фрагмента субъединицы холинорецептора, обладающего существенно меньшим сродством к своим лигандам по сравнению с полноразмерным рецептором, привело к необходимости использовать большие концентрации вытеснителей. Помимо данного теста активность природного а-конотоксина Iml и его [Tyr10]ImI аналога была также исследована на полноразмерном а7 АХР крысы, экспрессированном в ооцитах Xenopus (работа выполнена д-ром К.Метфесселем, Байер, Леверкузен). В данном случае регистрировали подавление исследуемыми конотоксинами электрических токов, индуцируемых ацетилхолином. Этот подход позволил выявить изомер [Туг1 ]ImI с правильным замыканием дисульфидных связей, поскольку только один из двух получившихся изомеров (изомер II, см. рис.11) ингибировал индуцируемые ацетилхолином токи практически с такой же эффективностью, что и нативный а-конотоксин Iml, тогда как активность изомера I была, как минимум, на порядок ниже [173]. ля изучения влияния заряженных а.о. на биологическую активность а-конотоксинов синтезирован ряд аналогов, в которых заряд либо убирали, вводя нейтральный а.о., либо заменяли на противоположный, либо вводили вместо нейтрального а.о. Так, удаление отрицательного заряда в N-концевой части молекулы (аналог [Ser ]GI) в 3 раза уменьшило сродство этого аналога к рецептору по сравнению с таковым для нативного а-конотоксина GI (значения IC50= 9.4 и 2.8 цМ, соответственно) (рис.14). Литературные данные свидетельствуют о том, что положительно заряженные остатки играют важную роль в активности а-конотоксинов, действующих на АХР мышечного типа.
Так, остаток Arg9 в а-конотоксине GI необходим для высокоаффинного связывания и для способности различать два центра связывания [63,78]. Следует, однако, отметить, что в а-конотоксине Ml, который даже несколько более активен, чем GI, остаток Arg9 отсутствует, а в гомологичном положении имеется остаток Lys. Однако ацилирование этого остатка Lys, так же, как и а-аминогруппы N-концевого Gly1, слабо сказывается на эффективности связывания с рецептором [175,188]. При этом в а-конотоксине Ml имеется остаток Arg2, который, по-видимому, выполняет ту же роль, что и Arg9 в а-конотоксине GI. Из этого можно предположить, что важно наличие положительного заряда, а нахождение его в определенном фиксированном положении аминокислотной последовательности (положение 2 в Ml или 9 в GI) менее существенно. Можно было ожидать, что перемещение положительно заряженных остатков вдоль аминокислотной последовательности заметно не повлияет на активность а-конотоксинов. Однако, введение остатка лизина в положение 12 а-конотоксина GI (вместо Ser), привело к аналогу (рис.14), который оказался в два раза активнее природного продукта (IC50 = 1.3 цМ). Введение отрицательной группы в это положение ([Asp ]GI) на порядок уменьшило эффективность взаимодействия аналога с рецептором (IC50 = 30 (лМ), тогда как введение объемного остатка бензоилфенилаланина в это положение оказало меньший эффект.
