Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 6
1. ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР 8
ВВЕДЕНИЕ. 8
ПРИМЕРЫ ПРИРОДНЫХ МОДИФИЦИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТ И ИХ ФУНКЦИЙ. 8
1.2. МЕТОДЫ АНАЛИЗА ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТ В БЕЛКАХ И
ПЕПТИДАХ. 18
1.2.1. ЗНАЧЕНИЯ И ВИДЫ ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ БЕЛКОВ И ПЕПТИДОВ. 18
2.2. АНАЛИЗ ФОСФОРИЛГИДРОКСИАМИНОКИСЛОТ, ПРИСУТСТВУЮЩИХ
В ГИДРОЛИЗОВАННЫХКЛЕТОЧНЫХ ЭКСТРАКТАХ. 19
РАЗДЕЛЕНИЕ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ И НЕФОСФОРИЛИРОВАННЫХ ПЕПТИДОВ ОБРАЩЕННО-ФАЗОВОЙ КОЛОНОЧНОЙХРОМА ТОРГРАФИЕЙ21
ВЫДЕЛЕНИЕ ПОЛИФОСФОСЕРИЛ-СОДЕРЖАЩИХПЕПТИДОВ СЕЛЕКТИВНЫМ ОСАЖДЕНИЕМ. 23
ИДЕНТИФИКАЦИЯ ТОЧЕК ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ В БЕЛКАХ. 24
АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХN-ФОСФОРИЛИРОВАННЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ. 29
1.3. МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ ГОМОЦИСТЕИНА. 31
ГОМОЦИСТЕИН, ПРИРОДА, ПУТИ МЕТАБОЛИЧЕСКОГО СИНТЕЗА И КАТАБОЛИЗМА, ПАТОФИЗИОЛОГИЧЕСКИЕ ЭФФЕКТЫ. 31
ВОССТАНОВЛЕНИЕ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ ПРИ ОПРЕДЕЛЕНИИ ГОМОЦИСТЕИНА 35
МЕТОДЫ, НЕ ТРЕБУЮЩИЕДЕРИВАТИЗАЦИИ СВОБОДНЫХ
СУЛЬ ФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП ПРИ АНАЛИЗЕ ГОМОЦИСТЕИНА 36
1.3.4. МЕТОДЫ МОДИФИКАЦИИ СУЛЬФГИДРИЛЬНЫХ ГРУПП ПРИ
АНАЛИЗЕ ГОМОЦИСТЕИНА 38
ДЕРИВАТИЗАЦИЯ ПРИ ФЛУОРОМЕТРИЧЕСКОМ ДЕТЕКТИРОВАНИИ ГОМОЦИСТЕИНА 40
МОДИФИКАЦИЯ ПРИ ФОТОМЕТРИЧЕСКОМ ДЕТЕКТИРОВАНИИ ГОМОЦИСТЕИНА 43
1.3.5. МЕТОДЫ РАЗДЕЛЕНИЯ, ИСПОЛЬЗУЕМЫЕ ПРИ АНАЛИЗЕ
АМИНОТИОЛОВ 45
2. ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 49
2.1 .РЕАКТИВЫ И МАТЕРИАЛЫ. 49
2.2. ПРИБОРЫ И ОБОРУДОВАНИЕ. 50
2.3.СИНТЕЗ ФТГ 1-АМИНОЦИКЛОГЕКСАН-1-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ (ФТГ АК1. РТН АА1), ФТГ 4-АМИНОТЕТРАГИДРОПИРАН-4-КАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ ГФТГ АК2, РТН АА2), ФТГ 1-АМИНОЦИКЛОГЕКСАН-1,4-ДИКАРБОНОВОЙ КИСЛОТЫ
ГФТГ АКЗ, РТН ААЗ). 51
2.4.ПРИГОТОВЛЕНИЕ МОДИФИЦИРУЮЩИХ СМЕСЕЙ. 52
2.5.СИНТЕЗ РТН S-ЭТАНОЛЦИСТЕИНА ИЗ О-ФОСФОСЕРИНА. 52
2.6.СИНТЕЗ ФТГ З-МЕТИЛ-8-ЭТАНОЛЦИСТЕИНА ИЗ О-ФОСФО-ТРЕОНИНА. 53
2.7.СИНТЕЗ ФТГ є-ФЕНИЛТИОКАРБАМОИЛ-5-ГИДРОКСИЛИЗИНА ИЗ 5-
ГИДРОКСИЛИЗИНА. 53
2.8.СИНТЕЗ ФТГ О-ФОСФОТИРОЗИНА. 53
2.9.МОДИФИКАЦИЯ ПЕПТИДА, СОДЕРЖАЩЕГО О-ФОСФОСЕРИН. 53
2.10.ПРИГОТОВЛЕНИЕ ОБРАЗЦОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ. 54
2.11. ОПРЕДЕЛЕНИЕ ОБЩЕГО ГОМОЦИСТЕИНА, ЦИСТЕИНА И ГЛУТАТИОНА В
ПЛАЗМЕ 54
2.12.ПРИГОТОВЛЕНИЕ КАЛИБРОВОЧНЫХ СТАНДАРТОВ. 55
2.13. ХРОМАТОГРАФИЯ. 55
ОФВЭЖХ РЕАКЦИОННЫХ СМЕСЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФТГ АК, ФТГ АК2ИФТГАКЗ 55
ОФВЭЖХ РЕАКЦИОННЫХ СМЕСЕЙ, СОДЕРЖАЩИХ ФТГS-ЭТАНОЛЦИСТЕИНА, ФТГ З-МЕТИЛ-Б-ЭТАНОЛЦИСТЕИНА И ФТГ О-
ФОСФОТИРОЗИНА 56
2.13.3.0ФВЭЖХРЕАКЦИОННОЙ СМЕСИ, СОДЕРЖАЩЕЙ ФТГ є-
ФЕНИЛТИОКАРБАМОИЛ-5-ГИДРОКСИЛИЗИНА 56
2.13.4. ОФВЭЖХ ПЕПТИДОВ, СОДЕРЖАЩИХ МОДИФИЦИРОВАННЫЕ И
НЕКОДИРУЕМЫЕ АМИНОКИСЛОТНЫЕ ОСТАТКИ. 57
ОФВЭЖХ ФОСФОРИЛИРОВАННОГО И НЕФОСФОРИЛИРОВАННОГО ПЕПТИДОВ 57
ОФВЭЖХ РЕАКЦИОННОЙ МАССЫ, СОДЕРЖАЩЕЙ S-ЭТАНОЛЦИСТЕИНИЛПЕПТИД ПОСЛЕ МОДИФИКАЦИИ ОСТА ТКА О-ФОСФОСЕРИНА 57
ВЫДЕЛЕНИЕ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ БИОЛОГИЧЕСКИ
АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ МОРСКИХ ПОЛИХЕТ МЕТОДОМ ОФВЭЖХ. 57
2.13.6. ОФВЭЖХАМИНОТИОЛОВ 58
ОФВЭЖХ АНАЛИЗ РЕАКЦИОННОЙ МАССЫ НА ЭТАПЕ ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙ ПРОВЕДЕНИЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ ДИСУЛЬФИДНЫХ СВЯЗЕЙ ИАЛКИЛИРОВАНИЯ ТИОЛОВ. 58
ОФВЭЖХ АНАЛИЗ АМИНОТИОЛОВ В ПЛАЗМЕ КРОВИ НА ЭТАПЕ ОПТИМИЗАЦИИ УСЛОВИЙПРОБОПОДГОТОВКИ. 58
ОФВЭЖХ АНАЛИЗ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ 59
2.13.6.4. ОФВЭЖХ АНАЛИЗ ФТГ АК, ОТЩЕПЛЁННЫХ ПРИ
СЕКВЕНИРОВАНИИ ПЕПТИДОВ ИЛИ СИНТЕЗИРОВАННЫХ В КА ЧЕСТВЕ
СТАНДАРТОВ 60
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ. 60
ВЫСОКОЭФФЕКТИВНЫЙ КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ (ВЭКЭ). .61
ВЭКЭ СИНТЕЗИРОВАННЫХ ФТГ АК. 61
ВЭКЭ АНАЛИЗ ПЕПТИДОВ. 61
ВЭКЭ АНАЛИЗ ПЛАЗМЫ КРОВИ. 61
2.16.СЕКВЕНИРОВАНИЕ ПЕПТИДОВ 62
2.17. СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА РЕЗУЛЬТАТОВ ОПРЕДЕЛЕНИЯ
ОБЩЕГО СОДЕРЖАНИЯ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ В
ПЛАЗМЕ КРОВИ. 62
3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 64
3.1. АНАЛИЗ НЕКОДИРУЕМЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ В
СИНТЕТИЧЕСКИХ ПЕПТИДАХ 64
3.2. АНАЛИЗ ФОСФОРИЛИРОВАННЫХ АМИНОКИСЛОТНЫХ ОСТАТКОВ. 75
3.3. СТРУКТУРНЫЙ АНАЛИЗ БИОЛОГИЧЕСКИ АКТИВНЫХ ПЕПТИДОВ,
ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ МОРСКИХ ПОЛИХЕТ. 81
АНАЛИЗ ГОМОЦИСТЕИНА И ДРУГИХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ. 86
АНАЛИЗ ГОМОЦИСТЕИНА И ДРУГИХ НИЗКОМОЛЕКУЛЯРНЫХ АМИНОТИОЛОВ ПЛАЗМЫ КРОВИ МЕТОДОМ ВЭКЭ. 99
4.ВЫВОДЫ 104
5. СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ И ОБОЗНАЧЕНИЙ.
АК - аминокислота, аминокислотный
AT - аминотиол, аминотиольный
АТЗ - 2-анлино-5-тиазолинон
ВЭЖХ - высокоэффективная жидкостная хроматография, высокоэффективный
жидкостно-хроматографический
ВЭКЭ - высокоэффективный капиллярный электрофорез, высокоэффективный
капиллярно-электрофоретический
ЭОП - электроосмотический поток
МЭКХ - мицеллярная электрофоретическая капиллярная хроматография
МС - масс-спектрометрия, масс-спектрометрический
ОФВЭЖХ- обращённо-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография,
обращённо-фазовый высокоэффективный жидкостно-хроматографический
ТГФ - тетрагидрофуран
ТФУК - трифторуксусная кислота
ТХУ - трихлоруксусная кислота
ФИТЦ - фенилизотиоцианат
ФТГ - З-фенил-2-тиогидантоин
ФТК - фенилтиокарбамоил
АА - аминокислота, аминокислотный
АА1 - 1-аминоциклогексан-1-карбоновая кислота
АА2 - 4-аминотетрагидропиран-4-карбоновая кислота
ААЗ - 1-аминоциклогексан-1,4-дикарбоновая кислота
AU - единицы абсорбции
AUFS - относительные единицы абсорбции
DMSO - диметилсульфоксид
EDTA - динатриевая соль этилендиаминтетрауксусной кислоты
GSH - глутатион восстановленный
GSSG - глутатион окисленный
Нсу - гомоцистеин
MB - монобиман
МВгВ - монобромобиман
PTH - З-фенил-2-тиогидантоин
RUF - относительные единицы флуоресценции
tHcy - общее содержание гомоцистеина
t0 - время достижения детектора маркером электроосмотического потока (ЭОП,
EOF)
tmc - время достижения детектора мицеллами
Введение к работе
Определение аминокислотного состава и аминокислотной последовательности пептидов и белков являются необходимыми стадиями структурно-функциональных исследований. Первичная структура в значительной мере определяет физиологическую активность и физико-химические свойства пептидов и белков. Свободные аминокислоты, входящие в состав физиологических жидкостей, имеют важное функциональное значение, изменение их концентраций часто является маркером метаболических нарушений. Помимо двадцати «обычных» белковых аминокислот, существует множество соединений этого класса, отличающихся от «обычных» аминокислот структурой радикала боковой цепи, либо пространственной конфигурацией, либо способом включения в полипептидный остов. В основном, модифицированные аминокислоты являются продуктами либо посттрансляционных модификаций аминокислотных остатков в составе пептидов и белков, кодируемых геномами организмов, либо метаболических ферментативных превращений, в том числе, из свободных природных «обычных» аминокислот. Посттрансляционная модификация аминокислотных остатков пептидов и белков - важное явление, встречающееся в различных живых организмах - от вирусов до млекопитающих. Другой тип «необычных» аминокислот - некодируемые аминокислоты, - синтетические аналоги, не встречающиеся ни в природных пептидах и белках, ни в свободном виде. Синтетические пептиды, содержащие такие аминокислоты, представляют большой интерес как аналоги биологически активных природных пептидов с изменёнными свойствами, необходимые для исследования механизмов ферментативных реакций и межклеточных взаимодействий. До сих пор идентификация модифицированных и некодируемых аминокислот остаётся одним из наиболее сложных этапов структурных исследований. Условия реакций, используемые в классических методах аминокислотного анализа и пептидно-белкового секвениро-вания могут изменять или разрушать ковалентно модифицированные остатки, либо являются недостаточно чувствительными и селективными для идентификации упомянутых аминокислот, присутствующих в природных источниках в низких концентрациях. Кроме того, идентификация свободных аминокислот и аминокислотных остатков пептидов обычно основана на известных хроматографических подвижно-стях двадцати генетически кодируемых аминокислот, и «необычные» аминокисло-
ты могут быть не узнаны или утеряны. Таким образом, в настоящее время существует проблема высокочувствительного надёжного определения некодируемых и модифицированных аминокислот в свободном виде и в составе пептидов и белков для решения как структурных задач, так и для клинико-диагностических целей.
Эта работа посвящена разработке комплекса инструментальных высокочувствительных методов идентификации и анализа различных некодируемых и модифицированных (фосфорилированных, гидроксилированных) аминокислот как в природных и синтетических пептидах, так и в свободном виде (гомоцистеина) в плазме крови.
