Содержание к диссертации
Введение
I. Литературный обзор 7
1. Полиненасыщенные жирные кислоты и их производные 8
2. Микроскопические грибы как продуценты ГШЖК 15
3. Влияние физико-химических факторов в процессе культивирования на образование липидов и их жирнокислотный состав 21
4. Влияние низкомолекулярных соединений на образование липидов и синтез полиненасыщенных жирных кислот 28
5. Биосинтез жирных кислот у микроорганизмов 37
6. Десатуразы - ферменты биосинтеза полиненасыщенных жирных кислот 39
7. Роль липоксигеназ в метаболизме полиненасыщенных жирных кислот 45
II. Результаты и их обсуждение 56
1. Скрининг микроорганизмов - синтетиков ПНЖК 60
2. Об объекте исследования:... 72
3. Культивирование оомицета Pythium debaryanum на питательных средах с различными источниками азота 75
4. Влияние экзогенных низкомолекулярных регуляторов на рост и липидные характеристики оомицета Pythium debaryanum 77
4.1. Влияние этанола на рост и липидные характеристики оомицета Pythium debaryanum 79
4.2. Влияние синтетического антиоксиданта ионола на рост и липидные характеристики оомицета Pythium debaryanum 81
4.3. Влияние витамина Е и его аналогов на рост и липидные характеристики оомицета Pythium debaryanum 82
4.3.1. Влияние витаминаЕ 85
4.3.2. Влияние аналогов витамина Е - хроманов Сі иСіз 88
4.3.3. Влияние водорастворимой формы витамина Е 92
4.4. Влияние витамина Кі и его аналогов на рост и липидные характеристики оомицета Pythium debaryanum 95
4.4.1. Влияние витамина Ki 98
4.4.2. Влияние аналога витамина Ki - витамина Кз 103
4.4.3. Влияние водорастоворимой формы витамина К] 106
5. Активность витаминов Е и Кь а также их аналогов как регуляторов роста клеток 118
6. Получение концентрата ГШЖК из микробиологических липидов 120
6.1. Культивирование зигомицетаMortierella sp. на питательных средах с различными источниками азота 122
6.2. Низкотемпературная кристаллизация из растворителей 124
6.3. Аддуктивная кристаллизация с мочевиной 126
III. Экспериментальная часть 130
Выводы 156
Список литературы
- Влияние физико-химических факторов в процессе культивирования на образование липидов и их жирнокислотный состав
- Культивирование оомицета Pythium debaryanum на питательных средах с различными источниками азота
- Влияние витамина Е и его аналогов на рост и липидные характеристики оомицета Pythium debaryanum
- Культивирование зигомицетаMortierella sp. на питательных средах с различными источниками азота
Влияние физико-химических факторов в процессе культивирования на образование липидов и их жирнокислотный состав
Также согласно литературным данным, некоторые штаммы родов Entomophthora, Delacroixia, Cohidioblus, Pythium и Phythophtora способны синтезировать относительно высокое количество арахидоновой кислоты [28]. Например, содержание арахидоновой кислоты у Entomophthora exitialis составляет 27.1% от суммы жирных кислот, у E.ignobilis -19.1%, у E.thaxteriana - 18.8%. Так же было показано, что Mortierella alpina ГРО 8568 синтезирует липиды с содержанием арахидоновой кислоты 68.5-78.8% от суммы жирных кислот или около 25% в пересчете на сухой вес [48]. Наиболее перспективными источниками ГШЖК, согласно литературным, данным являются низшие грибы отдела Zygomycota класса Zygomycetes, особенно порядка Mucorales. В синтезе ЭПК особенно активны микроскопические грибы, принадлежащие к этому порядку, а также представители других таксонов низших эукариотных мицелиальных микроорганизмов, а именно классов Chytridomycetes и Oomycetes [50-60].
В результате детального исследования синтеза ГШЖК микроорганизмами, в том числе и микроскопическими грибами, было установлено, что большинство грибов способны синтезировать олеиновую кислоту (18:1) из стеариновой кислоты путем аэробной десатурации. Дальнейшая десатурация олеиновой кислоты через линолевую (18:2) приводит к образованию а- (Сі8:з;шз) или у- (Сі8:з;юб) линоленовой кислоты. У некоторых грибов аэробная десатурация может протекать до образования Cig:4 кислоты (например, у Thamnidium elegans [61]), у других организмов дальнейшая элонгация углеродной цепи с последующей десатурациеи приводит к образованию арахидоновой, эйкозапентаеновой и докозагексановой (22:6) кислот.
Интересным представляется тот факт, что Zygomycetes имеют уникальную отличительную особенность синтезировать у-линоленовую кислоту - промежуточного представителя в синтезе арахидоновой кислоты, в то время как другие грибы синтезируют главным образом а-линоленовую кислоту. Кроме видов, приведенных в таблице, были изучены и другие представители Phycomycetes. Так в работе [62] в качестве одной из основных жирных кислот полярных липидов Hyphochytrium catenoides, Rhizidiomyces apophysetus, Catenarie arguillulae, Monoblephaulla sp., Allomyces mycrogyrus идентифицирована арахидоновая кислота. В работе [63] показано, что Achlya americana происходит превращение меченной 14С-арахидоновой кислоты до эйкозапентаеновой кислоты. Японские ученые, занимающиеся поиском и разработкой грибов - синтетиков ГШЖК, уделяют особое внимание представителям рода Mortierella - M.elongata в качестве потенциальных источников арахидоновои и эйкозапентаеновой кислот. Интересным представляется тот факт, что арахидоновая кислота является одной из основных жирных кислот грибов-фитопатогенов, таких как Phytium [36,39,40], и Phytophtora [38]. Причем было показано, что в клетках грибов-фитопатогенов ПНЖК, ЭПК и арахидоновая кислота в частности, оказывая токсическое действие на растения, индуцируют ответную эффективную защитную реакцию растений против фитопатогенов [64].
Согласно литературным данным [36] грибы, способные синтезировать ПНЖК и арахидоновую кислоту в том числе, были обнаружены и среди других классов грибов. Так в работе [65] показано, что Trichothecium roseum содержит большое количество ПНЖК. Авторы работы [66] обнаружили, что такие грибы как Penicillium суапеит, P.lalicinum, P.spinolosum, Hormodendrum bordu, Fusarium oxysporum и Cladosporium herbarum способны накапливать различные количества арахидоновои кислоты при культивировании на среде с дополнительным содержанием углеводородов. В работе [67] показано, что грибы Aspergillus versicolor, A.orizae, A.ustus, A.fumigatus, A.niger, Paecilomyces lilacinus, Fusarium sp., F.oxysporum и Penicillium sp. способны использовать в качестве субстратов для превращения до арахидоновои кислоты такие насыщенные жирные кислоты как миристиновую (14:0), пальмитиновую (16:0), стеариновую (18:0) и ненасыщенную олеиновую (18:1) кислоты.
Были предприняты попытки для изучения локализации ПНЖК среди липидных классов грибов. Согласно литературным данным [68] С-20 ПНЖК сосредоточены в полярных липидах, главным образом в фосфолипидах. Кроме того, известно, что и в клетках человека арахидоновая кислота сосредоточена в мембранных фосфолипидах.
Дальнейшие исследования показали, что некоторые грибы способны синтезировать не только ПНЖК - предшественники эйкозаноидов, но и осуществлять дальнейшее превращение простагландинов путем / -окисления [69].
Культивирование оомицета Pythium debaryanum на питательных средах с различными источниками азота
Так как редокс-ингибиторы и хелатобразующие субстраты-ингибиторы, вероятно, обуславливают ряд местных эффектов в опытах in vivo, были предприняты попытки создания веществ с активным сайтом, обладающих свойствами как редокс-ингибиторов, так и свойствами лигандов железа. При изучении активного сайта 5-LOX в качестве потенциального и высоко селективного ингибитора были предложены метоксиалкилтриазолиды [163]. Более детальные исследования соотношения структура/селективность ингибиторов данного типа привело к обнаружению того, что метокситетрагидропиран довольно активны в опытах in vitro, тогда как в опытах in vivo такой эффект не проявлялся [164].
Определенные классы ингибиторов LOXs вероятно обладают различными механизмами действия, как указывалось выше. Так, например, гидроксамовая кислота может выступать, с одной стороны, в качестве хелатирующего агента негемного железа, а с другой стороны, данная кислота может также действовать и как редокс-ингибитор [139]. Подобным образом, катехолы обладают железо-хелатирующими свойствами, но также могут действовать в качестве ловушек свободных радикалов и радикалов-интермедиатов при подходе к активному сайту фермента [139].
Предполагали, что природные антиоксиданты, действующие как ловушки свободных радикалов, могут быть и ингибиторами LOXs [156, 165-167], так как в ходе реакций, протекающих с участием данных ферментов, происходит образование свободных радикалов. Однако согласно литературным данным, для большинства изоформ LOXs, природные антиоксиданты являются неэффективными ингибиторами, поскольку подавляющее большинство радикальных интермедиатов остаются фермент-связанными и, таким образом, они не могут взаимодействовать с молекулами антиоксидантов [139]. Однако, несмотря на то, что природные антиоксиданты сами по себе не подавляют реакции, протекающие с участием LOXs, данные соединения способны взаимодействовать с пероксииндуцированными, промежуточными свободными радикалами вторичных реакций и, таким образом, они могут предотвращать окислительную модификацию других клеточных компонентов.
На рубеже веков химический синтез продемонстрировал множество важных достижений. Однако в некоторых случаях химический синтез может уступать место биохимическому синтезу ряда соединений, используемых в различных областях человеческой деятельности. Примерами преимущества в использовании биосинтеза для получения ценных соединений может служить витамин В12 (активно синтезирующийся пропиокислыми бактериями и стрептомицетами), -каротин (синтезируется микроскопическим грибом Blakeslea trispora).
Анализ литературных данных указывает на то, что синтез липидов с использованием микроорганизмов (микробиологический синтез) давно привлекает внимание исследователей как перспективный источник получения жиров, пригодных для использования в пищу. За последние годы в мировой науке интерес к липидам микроорганизмов возрос в связи со способностью ряда микроорганизмов, в частности мицелиальньгх грибов, синтезировать эссенциальные, эйкозаполиеновые жирные кислоты (у-линоленовую, арахидоновую, эйкозапентаеновую кислоты), представляющие ценность для медицины. Такое повышение внимания к вопросам о составе липидов и активности липогенеза живых организмов обусловлено сегодня, с одной стороны, научным интересом, связанным с изучением процессов метаболизма липидов (и жирных кислот в частности). С другой стороны, практическим интересом по использованию регулируемого липидного синтеза микробными продуцентами, поскольку детальное знание липидного состава того или иного микроорганизма позволяет направленно влиять в процессе роста данного организма на повышение содержания того или иного интересующего нас липидного компонента, что в свою очередь представляет несомненный практический интерес.
Анализ литературных данных свидетельствует о том, что микроорганизмы и в частности низшие эукариотные микромицеты, являются весьма перспективными источниками липидов и существует возможность регулирования липидного состава с целью повышения выхода целевого продукта.
Влияние витамина Е и его аналогов на рост и липидные характеристики оомицета Pythium debaryanum
Природные хиноновые соединения, относимые к жирорастворимым витаминам группы К, обладают высокой биологической активностью, являются компонентами биомембран, выполняют функцию переносчиков электронов в важнейших окислительно-восстановительных процессах жизнедеятельности в клетках эукариотных и прокариотных организмов. Эти соединения обладают антиоксидантной активностью (АОА), которая, как известно, регулирует процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) в клеточных мембранах. Сведения об АОА хиноновых соединений и механизмах их участия в окислительных процессах можно найти в обзорных и экспериментальных публикациях, где изложены результаты исследований in vitro [193-195].
О биологическом эффекте экзогенного витамина К і и его синтетических аналогов в экспериментах in vivo сведений мало [196]. Можно полагать, что биологический эффект этих соединений в клетках оомицета включает ингибирование процессов ПОЛ, возможно и их влияние на ферменты, ответственные за образование полиненасыщенных жирных кислот (ПНЖК); последнее было показано при изучении действия антиокислителей фенольной природы [83, 93].
Целью данного этапа работы было изучение влияния экзогенного витамина Ki и его функциональных синтетических аналогов: витамина К3 (менадиона), а также водорастворимой формы витамина К] на рост и процессы липогенеза оомицета Pythium debaryanum, липиды которого содержат ЭПК. В качестве испытуемых экзогенных соединений использовали витамин Ki (филлохинон, 2-метил-3-фитил-1,4-нафтохинон - рис.11, формула I) и его синтетические аналоги: витамин К3 (менадион, 2-метил-1,4-нафтохинон -формула II) и водорастворимую форму витамина Ki (тетранатриевая соль 1,4-дифосфата дигидровитамина К] — формула III).
В данной серии экспериментов исследовали влияние различных концентраций рассматриваемых соединений при двух вариантах времени внесения экзогенных соединений к среде культивирования оомицета как до засева питательной среды, так и к активно растущей культуре, т.е. на 20-й час после засева инокулята. Концентрации витамина Кь а также и его аналогов, время внесения указанных добавок к среде культивирования указаны в каждом случае отдельно.
Результаты экспериментов представлены на рис.12-15, где приведены данные о величинах биомассы (г/л), содержании липидов в мицелии (%), содержании ПНЖК (%) в сумме жирных кислот. Данные по содержанию индивидуальных жирных кислот, а также данные о соотношениях определенных групп жирных кислот представлены в табл.20-27 экспериментальной части. Влияние витамина Kj.
При изучении влияния витамина Ki (рис.11, формула I) на рост и липидные показатели оомицета в процессе его развития были испытаны три концентрации данного соединения: 4.93ХІ0"5, 9.86ХІ0"4 и 1.97ХІ0"3 М и два варианта времени внесения добавок: до засева и к активно растущей культуре.
При сравнении влияния различных концентраций витамина Кь вносимого в среду культивирования P.debaryanum одновременно с инокулятом, была выявлена стимуляция величины биомассы, что можно видеть на рис.12. При рассмотрении влияния витамина Кь взятого в концентрации 4.93x10"5 М, отмечена стимуляция ростовых процессов в фазе экспоненциального роста культуры (72 часа, рис.12): превышение величины биомассы опытного варианта по сравнению с контрольной величиной составил 14.6%. При увеличении содержания витамина Ki в питательной среде до 9.86x10 М наблюдается увеличение количества биомассы по сравнению с контролем на 19.8%; при концентрации витамина Ki 1.97x10"3 М - на 29.2% (рис. 12).
Таким образом, наблюдается прямая зависимость активности ростовых процессов P.debaryanum от концентрации экзогенного витамина К].
Во всех вариантах контроля и опытных образцах не наблюдалось высокой липогенной активности исследованной культуры. Содержание липидов в процессе развития культуры оомицета на средах в отсутствии и в присутствии витамина Ki составляло соответственно от 9.5% до 11.2%, а в опытных вариантах несколько выше - от 10.1 % до 15.8%.
Из полученных результатов о содержании индивидуальных ГШЖК в составе липидов оомицета, выращенного на среде в присутствии различных концентраций витамина Ki видно, что в составе липидов во всех вариантах преобладающими являются длинноцепочечные кислоты с длиной углеродной цепи от 18 до 20 атомов углерода, из которых около половины составляют полиненасыщенные жирные кислоты (ПНЖК).
Культивирование зигомицетаMortierella sp. на питательных средах с различными источниками азота
При рассмотрении эффекта водорастворимой формы витамина К і (формула III, рис.11), представляющей собой тетранатриевую соль 1,4-дифосфата дигидровитамина К і, на рост и липогенную активность гриба нами были испытаны три концентрации данного вещества 9.86х10"5, 9.86ХІ0"4 и 1.97хЮ"3М.
В случае с водорастворимой формой витамина Кь взятой в концентрации 9.86x10"5 М, не отмечено заметной стимуляции роста, как в случае с гидрофобной формой витамина, хотя, максимальная величина биомассы была несколько выше контрольной цифры (14.6 и 13.5 г/л соответственно, рис.15). Уровень липидного пула к 4-м суткам культивирования остался на уровне контроля. Содержание ЭПК в липидах остается также практически на уровне контроля (рис.15).
Увеличение концентрации водорастворимой формы витамина К і до 9.86x10 М вызывало заметное замедление ростовых процессов, особенно на ранней стадии развития культуры (24 - 36 часов), на 4-е сутки подавление роста составило около 9.6% (рис.15). Аналогичные данные были получены и при дальнейшем увеличении концентрации до 1.97x10" М: задержка роста на начальной стадии роста и уменьшение величины биомассы на 4-е сутки составило 13.3% (рис.15). Надо отметить, что такое снижение величины биомассы как в случае с 9.86x10 М, так и с 1.97x10" М концентрациями водорастворимой формы витамина Кі сопровождалось значительным усилением синтеза липидов: максимальные величины липидного пула в контроле и опытных вариантах для концентрации 9.86x10"4 М и 1.97xlO"J М составили соответственно 14.47, 29.46 и 34.04%.
Интенсивный синтез липидов сопровождался заметным снижением (почти в два раза) содержания ЭПК в составе липидов, что, как уже ранее отмечалось, может быть связано с преимущественным накоплением триацилглицеридов (так называемых «запасных» липидов), в то время, как ПНЖК являются главным образом составной частью мембранных липидов.
Таким образом, внесение экзогенной водорастворимой формы витамина Ki в среду культивирования P.debaryanum, в малой концентрации 9.86х10"5 М практически не влияет на показатели количества биомассы, липидов и ЭПК -все данные показатели находятся на уровне величин контроля. Увеличение концентрации этой формы витамина К] до 1.97x10" М вызывает замедление ростовых процессов, главным образом, в течение первых 24-36 часов культивирования. Отмечен значительный стимулирующий эффект данной концентрации водорастворимой формы витамина Кі на накопление липидов.
При проведении опыта с двумя концентрациями водорастворимой формы витамина Ki - 9.86х1(Ґ и 1.97х10 3 М, в которых исследуемое вещество вносилось к активно растущей культуре P.debaryanum, как и в опытах с одновременным внесением инокулята и испытуемого соединения, было отмечено подавление роста биомассы по сравнению с контролем на 18.5 и 19.0% для концентраций 9.86ХІ0"4 и 1.97х10"3 М соответственно (рис.15).
На фоне снижения количества биомассы было отмечено почти двукратное повышение содержания липидов в мицелии. При этом увеличение содержания липидов сопровождалось довольно низким содержанием ЭПК (рис.15).
Можно полагать, что отмеченное угнетение роста культуры, наблюдаемое в присутствии водорастворимой формы витамина Кь наибольшее при максимальной концентрации данной добавки, вызывает активизацию липогеннои активности, приводящей к заметному увеличению липидного пула клеток. Максимальное увеличение липидного пула по сравнению с контролем составило 135%, снижение же веса биомассы при этом - 13%. Можно сказать, что отмеченное увеличение липидного пула неадекватно наблюдаемому снижению активности ростовых процессов, т.е. можно предполагать, что гидрофильная форма витамина К і оказывает специфическое воздействие на ферменты синтеза липидов.
Понимание основ липогенности (олеогенности) весьма важно, так как оно дает возможность разумного влияния на организм либо путем метаболического, либо генетического управления.
Ряд ферментов, которые вовлечены или возможно вовлечены в биохимические процессы у олеогенных микроорганизмов, активно изучаются и эти ферменты можно разделить на группы: к первой относятся ферменты непосредственно биосинтеза липидов такие как: АСС (ацетил-СоА карбоксилаза), FAS (синтаза или синтетаза жирных кислот), DAGAT (диацилглицерид ацил-трансфераза); ко второй - фермент ACL (АТР-зависимая цитрат-лиаза), который вовлечен в получение цитозольного ацетил-СоА; и к третьей - ряд потенциальных участников в процессах генерации NADPH для синтеза жирных кислот - ME (КАОР+-зависимая малат-дегидрогеназа), G-6-PDH (глюкозо-6-фосфат дегидрогеназа), 6-PGDH (6-фосфоглюконат-дегидрогеназа) и NADP+:ICDH (КАБР+-зависимая изоцитратдегидрогеназа).
Как видно из схемы 7, пируват, образующийся на предпоследней стадии гликолиза, поступает в митохондрию, где в результате окислительного декарбоксилирования превращается в ацетил-КоА. Ацетил-КоА не может диффундировать в цитоплазму клетки, так как митохондриальная мембрана непроницаема для данного субстрата и поэтому внутримитохондриальный ацетил-КоА взаимодействует с оксалацетатом в результате образуется цитрат. Образовавшийся цитрат переносится через внутреннюю мембрану митохондрии в цитозоль клетки при помощи специальной трикарбоксилат-транспортирующей системы. Далее в цитозоле цитрат при действии АТР-зависимой цитрат-лиазы (ACL) распадается на ацетил-КоА и оксалоацетат. Полученный ацетил-КоА служит строительным блоком для синтеза жирных кислот в цитозоле клетки, превращаясь в малонил-КоА при действии ацетил-СоА карбоксилазы (АСС). Оксалоацетат же в цитозоле при участии цитозольной малат-дегидогеназы (MDC) восстанавливается до малага. Последний при помощи дикарбоксилат-транспортирующеи системы возвращается в митохондриальный матрикс, где окисляется до оксалоацетата,
Похожие диссертации на Получение полиненасыщенных жирных кислот с использованием микроскопических грибов
