Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Литературный обзор 14
1.1. Ацетилхолинэстераза .14
1.1.1. Основная физиологическая функция и локализация АХЭ 14
1.1.2. Структура и каталитический механизм действия АХЭ. 16
1.1.3. Неклассические функции АХЭ 22
1.1.4. Заболевания, связанные с АХЭ 23
1.1.5. Механизм ингибирования АХЭ .25
1.1.6. Токсикологические и фармакологические аспекты ингибирования АХЭ 29
1.2. Бутитилхолинэстераза 35
1.2.1. Физиологическая функция и локализация БХЭ .35
1.2.2. Генетический полиморфизм БХЭ 36
1.2.3. Структура БХЭ .38
1.2.4. Биологическая роль БХЭ 41
1.2.4.1. Роль БХЭ в метаболизме лекарственных препаратов 42
1.2.4.2. Взаимодействие с ФОС: БХЭ как биоскэвенджер и биомаркер воздействия ФОС .43
1.2.4.3. Ингибиторы БХЭ в терапии болезни Альцгеймера 44 1.3. Нейропатичная эстераза .47
1.3.1. Физиологическая роль и локализация НТЭ 47
1.3.2. Структура НТЭ 50
1.3.3. Синдром отставленной нейротокичности, вызываемой ФОС (ОНТФОС) 53
1.3.4. Роль НТЭ в механизме инициирования ОНТФОС 57
1.3.4.1. Ингибирование и «старение» НТЭ 57
1.3.4.2. Оценка нейропатичного потенциала фосфорорганических соединений 62
1.3.4.3. НТЭ как биомаркер воздействия нейропатичных ФОС .63
1.4. Карбоксилэстераза 66
1.4.1. Физиологическая функция и локализация КЭ 66
1.4.2. Изоформы КЭ млекопитающих 66
1.4.3. Структура КЭ .71
1.4.4. Биологическая роль КЭ .76
1.4.4.1. Роль КЭ в метаболизме лекарственных препаратов 76
1.4.4.2. Роль КЭ в метаболизме липидов 77
1.4.4.3. Взаимодействие с ФОС: роль КЭ как биоскэвенджера и биомаркера воздействия ФОС .78
1.5. Параоксоназа 80 1.5.1. Локализация и субстратная специфичность PON1 80
1.5.2. Структура PON1 82
1.5.3. Физиологическая функция PON1 83
1.5.4. Роль PON1 в метаболизме лекарственных средств 84
1.5.5. PON1 и детоксикация ФОС 84
1.5.6. Генетический полиморфизм PON1 86
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 89
2.1. Материалы .89
2.2. Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ фосфорорганическими соединениями 90
2.3. QSAR анализ эстеразного профиля соединений .95
2.4. Приготовление препаратов тканей (мозга и крови) 96
2.5. Определение активности эстераз в препаратах мозга и крови 99
2.6. Определение величин IC50 для ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ исследуемыми соединениями в препаратах мозга и крови 105
2.7. Эксперименты на животных 106
2.8. Статистическая обработка результатов 107
ГЛАВА 3. Обсуждение результатов 108
3.1. Исследование эстеразного профиля новых фосфорорганических соединений для оценки их биологической активности как потенциальных ингибиторов сериновых эстераз 108
3.1.1. Исследование кинетики ингибирования АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ О-фосфорилированными этилтрифторлактатами 109
3.1.2. Анализ эстеразного профиля О-фосфорилированных этилтрифторлактатов 116
3.1.3. Выбор соединений для исследований на тканях и на целом животном 128
3.1.4. Оценка эстеразного профиля О-фосфорилированных гексафторизопропанолов (diEt-PFP, diBu-PFP) и маркерного соединения О,О-дипропил-О-дихлорвинилфосфата (diPr-DClVP) 132
3.2. Исследование активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1
в крови и оценка «эстеразного статуса» человека и грызунов .135
3.2.1. Разработка методов пробоподготовки и оптимизация методик определения активности АХЭ, БХЭ, КЭ, НТЭ и PON1 в цельной крови .135
3.2.2. Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в плазме крови человека и крысы в стандартных условиях .147
3.2.3. Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в цельной крови человека, мыши и крысы .148
3.3. Мыши как модель для биохимической оценки нейропатичного потенциала фосфорорганических оединений 152
3.3.1. Сравнительное исследование чувствительности НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур к действию ФОС с различным эстеразным профилем в экспериментах in vitro .154
3.3.2. Сравнительное исследование ингибирования НТЭ и АХЭ мозга мышей и кур фосфорорганическими соединениями в экспериментах на целом животном 159
3.3.3. Использование НТЭ крови мышей в качестве биохимического маркера отравления нейропатичными ФОС 163
3.4. Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на препаратах мозга и крови мышей in vitro 169
3.4.1. Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз мозга мышей in vitro 169
3.4.2. Ингибиторная активность и селективность diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз крови мышей in vitro 173
3.5. Исследование эффектов фосфорорганических соединений с различным эстеразным профилем на уровне целого организма 179
3.5.1. Ингибирование эстераз мозга мышей при внутрибрюшинном введении ФОС 179
3.5.2. Ингибирование эстераз крови мышей при внутрибрюшинном введении ФОС 183
3.5.2.1. Вклад эстераз-скэвенджеров в формирование токсических эффектов 187
3.5.2.2. Селективные ингибиторы КЭ плазмы крови мышей .189
Выводы 194
Список сокращений 196
Список литературы
- Структура и каталитический механизм действия АХЭ.
- Ингибирование и «старение» НТЭ
- Приготовление препаратов тканей (мозга и крови)
- Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в цельной крови человека, мыши и крысы
Структура и каталитический механизм действия АХЭ.
Ацетилхолинэстераза (АХЭ, КФ 3.1.1.7) является одним из ключевых ферментов, регулирующих работу нервной системы. Это ключевой компонент холинэргических синапсов центральной нервной системы и нервно-мышечных синапсов. [4, 5 6]. Основная физиологическая функция АХЭ – гидролиз нейротрансмиттера ацетилхолина (АХ) до холина и уксусной кислоты и, как следствие, прекращение передачи нервного импульса [7, 8]. АХЭ считается одним из самых быстрых из известных ферментов [ 9, 10]. Этот фермент имеет высокое число оборотов - &cat/AM—1.6x10 М с [11], что гарантирует быстрое удаление ацетилхолина и обеспечивает готовность синапса к новому циклу передачи возбуждения. Продукты гидролиза, холин и уксусная кислота, активно захватываются пресинаптической частью синапса и используются для повторного синтеза ацетилхолина.
АХЭ обладает довольно узкой субстратной специфичностью, помимо ацетилхолина она способна гидролизовать некоторые другие эфиры холина: ацетилтиохолин, пропионилхолин, пропионилтиохолин [12].
Помимо центральной нервной системы АХЭ локализована в симпатических и парасимпатических ганглиях, моторных окончаниях двигательных нейронов, потовых железах, в лимфатической системе и эмбриональных тканях, сердце, легких, кишечнике, селезенке и эритроцитах. [13]. АХЭ экспрессируется во всех эукариотах, включая растения [14, 15].
Генетический полиморфизм АХЭ
Активность АХЭ является жизненно важной для нейротрансмиссии. В связи с этим предполагалось, что генетические варианты АХЭ будут несовместимыми с жизнью, и поэтому не присутствуют в организме здорового человека. Однако, были описаны четыре примера генетического полиморфизма АХЭ, и два из них имели клинические проявления. Первый из клинически значимых полиморфизмов расположен в дистальном промотере гена АХЭ. Его клинические проявления связаны с высокой чувствительностью этой изоформы АХЭ к антихолинэстеразным соединениям [16, 17] и, возможно, коррелируют с проявлениями синдрома войны в Персидском заливе. Были найдены и другие мутации в кДНК АХЭ, которые подробно охарактеризованы в работе [18], и, как показано, затрагивают нефункциональные области фермента.
АХЭ является эритроцитарным антигеном человека, т.е. экспрессируется на поверхности эритроцитов и определяет группу крови YT [19]. При этом существуют два варианта: нативный YT1 (90% Американской и Европейской популяции) [20] и его полиморфная модификация YT2 (всего 10%), имеющая единичную аминокислотную замену His322Asn. [19, 21]. Было показано, что данная мутация не оказывает никакого влияния ни на каталитические, ни на физические свойства АХЭ, поскольку эта аминокислота находится на периферии белка, не играет существенной роли в его конформационной стабильности и достаточно удалена от активного сайта [21, 22]. В работе [23] показано, что мыши, несущие один дефицитный аллель АХЭ, имеют около 50% нормальной активности АХЭ в головном мозге, мышцах и плазме. Эти (+/–АХЭ) мыши не отличаются от мышей дикого типа по здоровью, фертильности, весу и температуре тела, но проявляют повышенную чувствительность к ФОС [24, 25]. Данные исследования подтверждает мнение, что люди с одним дефицитным аллелем АХЭ здоровы, но будут проявлять повышенную восприимчивость к токсичным ФОС.
Структура и каталитический механизм действия АХЭ Ацетилхолинэстераза - гликопротеин, в котором углеводная часть молекулы составляет около 8% по массе. По механизму действия АХЭ является сериновой гидролазой, структурно она принадлежит к классу /-протеинов. Структура АХЭ
Единственный ген АХЭ человека картирован на 7 хромосоме в локусе 7q22 [26] и состоит из шести экзонов. В результате альтернативного сплайсинга на C-концевом участке получаются три различных полипептида АХЭ, образующих набор изоформ с идентичными каталитическими свойствами. Различия в структуре сказываются на распределении изоформ в тканях и образовании четвертичной структуры. [27, 28]. Образуются следующие формы:
АХЭR – растворимый мономер, участвующий в регуляции нервного сигнала в мозге, и наиболее подробно изученная из всех форм; АХЭH присутствует в основном в эмбриональных тканях и на поверхности гематопоэтических клеток в виде димера; АХЭT – основная форма, играющая важную роль в нервно-мышечном взаимодействии (тетрамерный белок, содержащийся в мозге, мышцах и большинстве тканей).
Первичную структуру фермента образует уникальная последовательность из 537 аминокислотных остатков. Мономер АХЭ представляет собой эллипсоидную молекулу размером 45х60х65 и имеет молекулярную массу порядка 60 кДа. Третичная структура АХЭ представляет собой 12 смешанных -листов, окруженных 14 -спиралями (Рис. 1.1.-2).
Структура ацетилхолинэстеразы (по кристаллографическим данным Рrotein Data Bank (PDB), код 1F8U, www.rcsb.org). На Рисунке 1.1.-3 схематично представлено строение активного центра АХЭ человека, мыши и Torpedo californica. [6]. Порядковые номера гомологичных аминокислотных остатков для АХЭ различных организмов не совпадают. Исторически наиболее распространенной в литературе является нумерация аминокислотных остатков АХЭ Torpedo californica. Показано, что кристаллическая структура активного центра АХЭ мыши фактически идентична АХЭ человека [6, 30]. Поскольку наша работа в целом ориентирована на роль АХЭ в вопросах здоровья человека, мы используем нумерацию аминокислотных остатков АХЭ человека (hАХЭ) [6].
Активный сайт фермента находится на дне каталитической щели на глубине порядка 20 внутри белка (Рис. 1.1.-3). Канал каталитической щели выстилают 14 ароматических аминокислотных остатка, образующих ароматический кластер, который участвует в дополнительной фиксации субстрата путем взаимодействия с его гидрофобной областью и в его продвижении к каталитическому центру фермента [31].
Наложение 3D структур активного центра АХЭ человека, мыши и Torpedo californica. Остатки, которые показывают самые большие отклонения, окрашены красным для человека, синим для мыши и желтым для Torpedo californica. На первом месте указана нумерация аминокислотных остатков АХЭ человека и мыши, в скобках указана нумерация для Torpedo californica. Torpedo californica имеет одну замену: Tyr337 (в случае человека и мыши) заменен на Phe330 [6 ] . В активном центре АХЭ выделяют «эфирную» (эстеразную) и «анионную» области, которые образованы тремя основными группами аминокислотных остатков (Рис. 1.1.-3 и 1.1.-4) - это каталитическая триада (Ser203, His447, Glu334), оксианионный центр (Gly121, Gly122, Ala204) и -анионный сайт (Trp86, Glu202, Tyr337, Gly448). Также выделяют ацильный карман — гидрофобную область внутри каталитической щели (Trp236, Phe295, Phe297, Phe338). Здесь ацетильная группа субстрата взаимодействует с Trp236, расположенным примерно в середине каталитической щели (Рис. 1.1.-3), с образованием катион- связи. Небольшой ацилсвязывающий карман АХЭ идеально подходит для АХ, так что его гидролиз осуществляется максимально эффективно, лимитирующим фактором является диффузия субстрата [32].
Ингибирование и «старение» НТЭ
Общая схема гидролиза ацетилхолина в активном сайте АХЭ и ключевая роль в нем серина и гистидина были известны еще до определения кристаллографической структуры АХЭ [37, 38, 39]. Полная схема многократно описана [32]. Реакция идет в 2 стадии — ацилирование и деацилирование, и включает в себя образование двух тетраэдрических интермедиатов (Рис. 1.1.-5).
На начальной стадии гидролиза (ацилирование) происходит нуклеофильная атака кислорода Ser203 по карбонильному атому углерода субстрата. Одновременно с этим происходит протонирование His447, играющего роль основания в данном процессе. Протонированный гистидин стабилизируется при взаимодействии с глутаматом Glu334. Эти два кислотных остатка, His447–Glu334, составляют так называемую систему переноса заряда (charge-relay system), активирующую серин. Итак, в результате всех этих процессов, Стадия 1, происходит образование первого тетраэдрического интермедиата, стабилизированного двумя водородными связями с водородами пептидных связей между глицинами оксианионного центра (Gly121, Gly122). На Стадии 2 первый тетраэдрический интермедиат быстро распадается под действием протонированного гистидина, выступающего в качестве кислоты, с образованием ацилферментного комплекса. На Стадия 3 происходит удаление спиртовой компоненты сложного эфира - холина. Стадия 4 - деацилирование ацилферментного комплекса. Ацилфермент подвергается нуклеофильной атаке молекулой воды, связанной водородной связью с имидазольным кольцом гистидина, в результате образуется второй тетраэдрический интермедиат. Одновременно с этим на Стадии 5 происходит протонирование His447, который способствует быстрому распаду отрицательно заряженного тетраэдрического интермедиата с освобождением серина и образованием молекулы уксусной кислоты, Стадия 6.
Неклассические функции АХЭ Одной из неклассических функций АХЭ является ее роль в росте аксонов и формировании синапсов [40, 41], а также в росте злокачественных опухолей [42, 43, 44]. На примере Helobdella triserialis [45] было установлено, что АХЭ в эмбриональном развитии появляется до развития холинэргической системы передачи нервного импульса, что указывает на некаталитическую роль АХЭ в клеточном развитии и росте нейронов. Предполагают, что на стадии эмбрионального развития АХЭ участвует в процессе регуляции дифференциации нервных клеток [46].
В связи с присутствием АХЭ в кроветворных клетках высказывается предположение о ее кроветворной активности у позвоночных [47, 48].
Было показано, что АХЭ принимает участие в процессе апоптоза – программируемой смерти клетки. Предполагается, что АХЭ участвует в разрушении ядерной оболочки в процессе апоптоза [49].
В работе [50] сообщается, что активность АХЭ является чувствительным индикатором дисфункции печени. Низкая активность этого фермента была обнаружена у пациентов, страдающих тяжелыми заболеваниями печени, такими как острый гепатит и цирроз.
Постоянный мониторинг активности АХЭ необходим для людей, у которых диагностирована фенилкетонурия. В работе [51] было показано, что концентрация фенилаланина и активность АХЭ в крови находятся в обратной зависимости. Авторы предполагают, что это может быть связано либо с непосредственным ингибированием АХЭ фенилаланином, либо с тем, что увеличение концентрации фенилаланина косвенно вызывает нарушения в микросреде липидного бислоя мембраны клеток и, как следствие, изменения состояния фермента.
Снижение эффективности или нарушение механизма нейропередачи, посредником которой служит ацетилхолин, является одним из факторов развития таких тяжелых заболеваний, как болезнь Альцгеймера, бульбоспинальный паралич (myasthenia gravis) и др., которые характеризуются снижением когнитивных способностей и/или деградацией нервно-мышечных функций организма. Болезнь Альцгеймера
Болезнь Альцгеймера (БА) относится к первично-дегенеративным деменциям и характеризуется прогрессирующим снижением когнитивных функций, в первую очередь памяти, а также развитием поведенческих расстройств. Основными нейропатологическими признаками болезни Альцгеймера является разрушение холинергической системы регуляции передачи нервного сигнала Развитие этой болезни связывают, в частности, с низкой активностью фермента, ответственного за синтез ацетилхолина, ацетилхолинтрансферазы, в результате чего происходит снижение концентрации ацетилхолина в синапсах. Основным методом терапии этого заболевания является использование препаратов, способных ингибировать АХЭ (такрин, ривастигмин и др.), что приводит к возрастанию концентрации ацетилхолина в синапсе и продлению его воздействия на рецептор, тем самым восстанавливая баланс в холинэргической системе [52].
Ингибиторы АХЭ были предложены для лечения БА около 20 лет назад и в настоящее время являются основными применяемыми на практике препаратами. Следует отметить, однако, что антихолинэстеразные препараты являются лишь симптоматическими и не останавливают развитие заболевания, а лишь замедляют его прогрессирование и поддерживают качество жизни пациента, продлевая период до наступления полной инвалидизации. В настоящее время разрабатываются препараты, ориентированные на различные механизмы БА [53].
На тяжелых стадиях болезни Альцгеймера наблюдается снижение активности АХЭ, в то же время активность БХЭ повышается, и она частично берет на себя функции АХЭ по гидролизу ацетилхолина. [54-61]. В связи с этим, помимо ингибиторов, селективных для АХЭ, в качестве перспективных терапевтических агентов для лечения БА рассматриваются ингибиторы, селективные как в отношении БХЭ, так и действующие на обе холинэстеразы [56-65]. Более подробно различные типы ингибиторов АХЭ и их терапевтическое применение будут рассмотрены ниже.
Миастенический синдром При миастеническом синдроме (myasthenia gravis) ослабевает тонус и способность к сокращению скелетных мышцах [66]. Одна из возможных причин — снижение плотности рецепторов ацетилхолина субсинаптической мембраны, что приводит к тому, что потенциал концевой пластинки может не достигать порогового уровня, необходимого для возбуждения мышцы. В этом случае перспективным представляется применение ингибиторов АХЭ, позволяющих увеличить время взаимодействия ацетилхолина с рецептором, и таким образом достичь достаточной деполяризации.
Типы ингибиторов АХЭ Антихолинэстеразные соединения, в первую очередь, фосфорорганические соединения (ФОС), пролонгируют действие ацетилхолина и действуют как нейротоксины. К таким соединениям относятся боевые отравляющие вещества (БОВ), фосфорорганические пестициды, производные сульфоновой кислоты (например, C6H3CH2SO2F), карбаматы (например, эзерин) и четвертичные аммониевые основания. Ингибированная АХЭ может восстановить свою активность с помощью реактиваторов (например, оксимов) [11].
Ингибиторы АХЭ связываются, как с активным центром фермента: БОВ, фосфорорганические пестициды, карбаматы, в том числе лекарственные препараты - ривастигмин, физостигмин, (такрин, галантамин), обратимые ингибиторы такрин, галантамин, так и с периферическим анионным сайтом (например, гуперзин, донепезил, пропидий, этидий, афлатоксин В1, декаметоний) [67, 68].
Приготовление препаратов тканей (мозга и крови)
Для анализа эстеразного профиля TFL использованы величины их ингибиторной активности в отношении 4-х эстераз (Табл. 3.1.-2) и величины ингибиторных селективностей (S), рассчитанные как отношения соответствующих ki (М-1мин-1): селективность соединения в отношении эстеразы X в сравнении с эстеразой Y определяли как SX/Y = ki(EX)/ki(EY) (Табл. 3.1.-3). В сумме это дает для моделирования 9 параметров, каждый из которых важен для определенных аспектов результирующего фармакологического профиля соединений.
Так, отношения ki(БХЭ)/ki(АХЭ) и ki(КЭ)/ki(АХЭ) характеризуют селективность соединений в отношении БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ, и, как мы полагаем, могут рассматриваться в качестве характеристики вкладов БХЭ и КЭ как вторичных мишеней-скэвенджеров в формирование острой холинергической токсичности соединения [455, 473-475]. Аналогично отношения ki(БХЭ)/ki(НТЭ) и ki(КЭ)/ki(НТЭ) характеризуют вклад БХЭ и КЭ в формирование отставленной нейротоксичности соединения.
Отношение ki(НТЭ)/ki(АХЭ) = RIP (Relative Inhibitor Potency) – относительная ингибиторная активность соединений в отношении ферментов-мишеней отставленной (НТЭ) и острой (АХЭ) нейротоксичности. Это отношение коррелирует с отношением между LD50 и минимальной нейропатичной дозой, и для соединений, которые в соответствии со своей структурой способных стареть, используется в качестве индекса, характеризующего нейропатичный потенциал соединения [223, 224, 226]. Величина RIP 1 указывают на то, что доза, необходимая для инициирования ОНТФОС данным соединением, будет меньше LD50, тогда как при RIP 1 ОНТФОС может инициироваться при дозах, больших LD50 [79, 262, 296, 299, 309, 476, 477].
Как следует из Таблиц 3.1.-2 и 3.1.-3, исследуемые соединения являются слабыми или средней силы ингибиторами АХЭ и более эффективно ингибируют БХЭ в сравнении с АХЭ, особенно при увеличении гидрофобности алкильных радикалов. Для соединений с R Pr характерна также повышенная селективность в отношении КЭ в сравнении с АХЭ.
Довольно низкая анти-АХЭ активность TFL наряду с более эффективным связыванием соединений с БХЭ и КЭ по сравнению с АХЭ, особенно при увеличении гидрофобности алкильных радикалов, позволили предположить невысокую острую токсичность соединений. Действительно, при определении острой токсичности на мышах (в/бр, 24 часа) были получены низкие величины LD50: для diEtFL - 720 (623 817) мг/кг и для diBuFL - 1560 (1350 1780) мг/кг.
Анализ величин RIP = ki(НТЭ)/ki(АХЭ), характеризующих нейро-патичный потенциал соединений [223, 226], показывает, что TFL с короткими R (Me, Et) значительно сильнее ингибируют АХЭ, чем НТЭ (RIP = 0.038 и 0.046, соответственно), в то время как соединения с длинными радикалами (Bu и Pent) в большей степени подавляют НТЭ (RIP = 2.15 и 4.04; Табл. 3.1.-3). Т.е. избирательность действия TFL в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ, возрастает с увеличением длины и, соответственно, гидрофобности алкильных радикалов.
Как подробно обсуждалось в Литературном обзоре диссертации, необходимым условием инициирования ОНТФОС является старение фосфорилированной НТЭ - деалкилирование алкоксигруппы, связанной с атомом фосфора в фосфорилированном по остатку серина ферменте [223, 226]. В структуре TFL присутствуют алкоксильные группы, т.е. фосфорилированный этими соединениями фермент способен «стареть». В связи с этим, высокие величины RIP для TFL с R = Bu и Pent (2.15 и 4.04, соответственно) позволяют предположить [223, 262], что эти соединения могут вызывать ОНТФОС в дозах, меньших LD50. Полученные результаты согласуются с представленными в литературе данными о высокой нейропатичности фосфорорганических соединений с длинными алкоксильными радикалами [79, 190, 249, 282].
Анализ эстеразного профиля исследуемых соединений проводили с помощью количественного анализа связи структура - ингибиторная активность и структура - ингибиторная селективность (QSAR) с построением моделей Хэнча [460]. Cвязь между структурой и антиферментативной активностью/селективностью соединений анализировали с использованием множественной линейной регрессии. При этом, учитывая характер зависимостей lgki от гидрофобности (Рис. 3.1.-4), мы использовали модели «гидрофобность - ингибиторная активность» с включением в них стерических факторов. Ранее было показано, что при анализе структура – активность в гомологичных рядах фосфатов и фосфонатов не удается выявить влияния электронных свойств заместителей на ингибиторную способность соединений [455, 478-480]. В качестве физико-химических дескрипторов мы использовали константы гидрофобности Хэнча (CH2 = 0.5) и стерические константы Чартона (Esv ) для алкильных и алкоксильных заместителей [460].
Определение активности АХЭ, БХЭ, КЭ и PON1 в цельной крови человека, мыши и крысы
Результаты показывают, что в эксперименте на целом животном diBu-PFP и diPr-DClVP проявляют наибольшую селективность в отношении КЭ по сравнению с АХЭ, селективность БХЭ/АХЭ ниже, что хорошо согласуется с результатами анализа эстеразного профиля данных соединений. Также наблюдается выраженная селективность соединений в отношении КЭ по сравнению с НТЭ, соответствующая результатам in vitro.
Ингибиторная селективность diPr-DClVP и diBu-PFP в отношении НТЭ по сравнению с АХЭ в крови, ED50(АХЭ)/ED50(НТЭ), подтверждает нейропатичную опасность соединений, предсказанную при анализе их эстеразного профиля, и соответствует величинам RIP (Табл. 3.5.-4). diEt-PFP при в/бр введении проявляет слабую ингибиторную активность по отношению к АХЭ и особенно НТЭ в крови (Табл. 3.5.-3), что подтверждает его безопасность в плане развития отставленной нейропатии и соответствует низким величинам RIP = 0.07.
Наблюдаются хорошие корреляции между величинами ингибиторной селективности diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении эстераз крови мышей, полученными в эксперименте in vivo, и величинами ингибиторной селективности, полученными из анализа эстеразного профиля соединений (Рис. 3.5.-3).
Корреляции между ингибиторной селективностью diBu-PFP – (А) и diPr-DClVP – (Б) в отношении АХЭ, БХЭ, КЭ и НТЭ согласно эстеразному профилю соединений (lgS in vitro) и селективностью в отношении эстераз крови мышей при в/бр введении соединений (lgS in vivo). Результаты представлены как lg соответствующей величины селект ивности (S).
Таким образом, в результате проведенного исследования показано хорошее соответствие ингибиторной активности и ингибиторной селективности diEt-PFP, diBu-PFP и diPr-DClVP в отношении АХЭ, НТЭ, БХЭ и КЭ в крови мышей на уровне целого организма эстеразному профилю данных соединений.
На основании результатов, полученных в предыдущем эксперименте, мы оценили вклад эстераз-скэвенджеров, БХЭ и КЭ, в формирование острой и отставленной нейротоксичности при в/бр введении мышам diBu-PFP и diEt-PFP, которые отличаются степенью гидрофобности алкильных радикалов.
Для гидрофобного diBu-PFP наблюдаются высокие величины селективности в отношении эстераз-скэвенджеров по сравнению с АХЭ in vivo: ED50(КЭ)/ED50(АХЭ) = 49.7 и ED50(БХЭ)/ED50(АХЭ) = 6.1 (Табл. 3.5.–4), что свидетельствует о высоком защитном эффекте эстераз-скэвенджеров в отношении формирования острой токсичности и хорошо согласуется с низкой острой токсичностью соединения (LD50 2000 мг/кг).
При этом ингибиторная селективность diBu-PFP в отношении КЭ и БХЭ по сравнению с НТЭ, т.е. защитный эффект от ОНТФОС, существенно ниже: ED50(КЭ)/ED50(НТЭ) = 11.7 и ED50(БХЭ)/ED50(НТЭ) = 1.44. Учитывая высокий нейропатичный потенциал diBu-PFP, можно ожидать высокой вероятности развития ОНТФОС при отравлении этим соединением.
Для менее гидрофобного diEt-PFP величины селективности in vivo в отношении эстераз-скэвенджеров по сравнению с АХЭ ниже, чем для diBu-PFP: ED50(КЭ)/ED50(АХЭ) 8 и ED50(БХЭ)/ED50(АХЭ) 4. Это свидетельствует о более низком защитном эффекте эстераз-скэвенджеров в отношении формирования острой токсичности в случае diEt-PFP, что отражается на величине LD50 (200 мг/кг). Острая токсичность diEt-PFP значительно выше, чем у diBu-PFP (LD50 2000 мг/кг), несмотря на его существенно более низкую анти-АХЭ активность в сравнении с diBu-PFP: ki=(1.80±0.11)103 и (8.44±0.34)104 M-1мин-1 соответственно (по данным эстеразного профиля, Табл. 3.1.- 5).
Отсутствие ингибирования НТЭ in vivo, характеризующее diEt-PFP как безопасное соединение с точки зрения ОНТФОС, может быть связано как с довольно низкой собственной анти-НТЭ активностью diEt-PFP in vitro: ki = (1.31±0.08)102 M-1мин-1 (Табл. 3.1.-7.), так и с высоким защитным эффектом эстераз-скэвенджеров, обусловленным высокой ингибиторной селективностью соединения в отношении БХЭ и особенно КЭ и in vitro: ki (БХЭ)/ki (НТЭ)=34.6, ki(КЭ)/ki(НТЭ)=779 (Табл. 3.1.-7), а также довольно высокой ингибиторной активностью соединения в отношении БХЭ и КЭ in vivo: ED50(БХЭ) = 46.8 ± 1.5; ED50(КЭ)= 25.0 ± 1.0 (Табл. 3.5.-3).
Таким образом, результаты эксперимента на целом животном полностью подтверждают высказанную нами гипотезу о различном вкладе эстераз-скэвенджеров – КЭ и БХЭ, в формирование острой и отставленной нейротоксичности ФОС при увеличении гидрофобности соединения, сделанные на основании анализа эстеразного профиля. А именно: для более гидрофобного diBu-PFP наблюдается выраженный защитный эффект КЭ и БХЭ в отношении развития острой токсичности и снижение данного эффекта в отношении развития ОНТФОС; в то время как для менее гидрофобного diEt-PFP наоборот: защитный эффект эстераз-скэвенджеров выше в отношении ОНТФОС по сравнению с острой токсичностью. Селективные ингибиторы КЭ плазмы крови мышей Известно, что карбоксилэстеразы являются детерминантой в фармакокинетике большинства терапевтических средств, содержащих сложноэфирную или амидную группировку.
Литературные данные и полученные нами результаты, показывают, что для грызунов свойственна высокая активность КЭ плазмы (ES1), в то время как у человека активность КЭ в плазме практически отсутствует [173], что осложняет экстраполяцию результатов с животных на человека при доклинических, в том числе фармакокинетических исследованиях потенциальных лекарственных средств, содержащих сложноэфирные или амидные группы, а также при токсикологических исследованиях. Это обусловливает потребность в селективных ингибиторах КЭ для проведения исследований на плазме мышей и на целом животном. В последнем случае ингибиторы КЭ плазмы мышей должны также обладать низкой острой токсичностью.
Основываясь на результатах экспериментов, проведенных в настоящей работе, мы оценили возможность использования diBu-PFP и diEt-PFP в качестве селективных ингибиторов КЭ плазмы мышей в исследованиях на препаратах крови in vitro и на уровне целого организма.
Анализ эстеразного профиля diEt-PFP и diBu-PFP (Глава 3.1.4., Табл. 3.1.-5 и 3.1.-7) показал выраженную ингибиторную селективность соединений в отношении КЭ по сравнению с АХЭ и БХЭ: для diEt-PFP ki(КЭ)/ki(АХЭ) = 56.6 и ki(КЭ)/ki(БХЭ) = 22.7; для diBu-PFP ki(КЭ)/ki(АХЭ) = 129 и ki(КЭ)/ki(БХЭ) =
При этом diBu-PFP является в 100 раз более эффективным ингибитором КЭ по сравнению с diEt-PFP: константы ингибирования КЭ составляют (1.09 ± 0.08)107 и (1.02 ± 0.04)105 M-1мин-1, соответственно (Табл. 3.1.-5).
Результаты экспериментов in vitro на препаратах крови мышей (Глава 3.4.2., Табл. 3.4.-3 и Табл. 3.4.-4) продемонстрировали выраженную селективность данных соединений в отношении КЭ крови по сравнению с БХЭ и особенно с АХЭ: для diEt-PFP IC50(КЭ)/IC50(АХЭ) = 47.5, IC50(КЭ)/IC50(БХЭ) = 15, для diBu-PFP IC50(КЭ)/IC50(АХЭ) = 65 и IC50(КЭ)/IC50(БХЭ) = 7. При этом diBu-PFP в 80 раз более эффективно ингибирует КЭ крови по сравнению с diEt-PFP: величины IC50 (при 20 минутной инкубации с ингибиторами) составляют (2.4 ± 0.13)10-8 и (1.89 ± 0.11)10-6 М, соответственно (Табл. 3.4.-3). Рисунок 3.5.-4 демонстрирует более высокую ингибиторную активность diEt-PFP и diBu-PFP в отношении КЭ по сравнению с АХЭ и БХЭ на препаратах крови мышей.
