Введение к работе
Актуальность проблемы. Олигонуклеотиды, их производные и аналоги находят широкое применение для создания на их основе молекулярных инструментов исследования НК-зависимых процессов, терапевтических препаратов для подавления экспрессии определенных генов, диагностики вирусных и наследственных заболеваний и т.д. Однако с тех пор как было показано, что олигонуклеотиды, благодаря своему уникальному и универсальному сродству к нуклеиновым кислотам, могут служить адресующей частью реагентов для направленной модификации НК [Belikova et al., 1967], конструирование олигонуклеотидных производных остается одной из основных проблем биоорганической химии из-за того, что требования, предъявляемые к таким олигонуклеотидным конструкциям - одновременное сайт-специфичное, селективное и эффективное взаимодействие их с нуклеиновыми кислотами, япляются частично взаимоисключающими друг друга. Эффективность и сайт-специфичность узнавания олигонуклеотидами определенных последовательностей в НК зависит от их комплексообразующей способности - чем больше нуклеотидных пар образуется при взаимодействии олигонуклеотидов с НК, тем эффективнее их связывание и ниже вероятность встречаемости комплементарных им сайтов в протяженных НК. Однако для повышения селективности связывания необходимо, напротив, использовать более короткие олигонуклеотиды, образующие с НК менее прочные комплексы, для которых появление одного нуклеотидного несоответствия в сайте связывания должно приводить при физиологических температурах к резкому падению их сродства к НК. Компромиссным вариантом решения этой комплексной проблемы могут быть тандемные системы на основе коротких олигонуклеотидов (эффектор+оли-гонуклеотид+эффектор), суммарная последовательность которых эквивалентна оптимальной длине олигонуклеотида, необходимой для сайт-специфичного связывания с НК.
Цель работы состояла в исследовании возможности повышения селективности взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-мишенью при физиологических условиях путем замены протяженных олигомеров на тандемы коротких олигонуклеотидов. Для ответа на вопрос, возможно ли селективное взаимодействие НК-мишеней с короткими олигонуклеотидами или их производными в составе тандемов, необходимо выяснить, а) как влияют эффекторы на комплексообразование олигонуклеотида в составе тандема при снижении гибридизационной способности олигомера за счет сокращения длины или введения в его структуру однонуклеотидного несоответствия с сайтом связывания в НК-мишени и б) какими должны быть компоненты тандема для осуществления селективного воздействия на НК в условиях, приближенных к физиологическим. Для решения поставленной задачи было проведено сравнительное исследование взаимодействия олигонуклеотидов с ДНК-мишенью в тандемных комплексах различного состава путем установления закономерностей влияния эффекторов на термостабильность олигонуклеотидных комплексов и особенностей алкилирования мишени олигонуклеотидными
реагентами в правильных и несовершенных комплексах олигонуклеотид ДНК-мишень.
Научная новизна работы. Работа представляет собой систематическое исследование взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с ДНК-мишенью в тандемных комплексах различного состава при формировании правильных и несовершенных комплексов мишень олигонуклеотид. В результате проведенного термодинамического анализа образования тандемных комплексов с суммарной длиной в 16-20 нуклеотидных пар и изучения особенностей модификации ДНК-мишени алкилирующими производными олигонуклеотидов с различной комплексообразующей способностью в составе тандемов предложен новый подход к повышению селективности взаимодействия олигонуклеотидов и их производных с ДНК-мишенью, основанный на использовании тандемов коротких олигонуклеотидов состава октануклетид+тетрануклеотид+октануклеотид, где тетрануклеотид и октамеры-эффекторы могут содержать, в зависимости от требований и условий, различные функциональные группировки.
Практическая ценность работы. На основании результатов исследования предложены и созданы тандемы коротких олигонуклеотидов, обладающих способностью подавлять экспрессию ВИЧ-1 в клеточных культурах (заявка на патент № 97108812 от 22.05.97), разработан новый метод выявления точечных мутаций в геномных ДНК методом лигирования тандемов трех коротких олигонуклеотидов (PCT/RU9600087 от 11.04.1996). Предложенный в работе подход может быть использован для создания терапевтических препаратов ген-направленного действия, для диагностики наследственных и вирусных заболеваний, для разработки методов секвенирования нуклеиновых кислот. Апробация работы. Результаты работы были представлены на 3-м Международном симпозиуме по биоорганической химии ШРАС (Россия, 1995), Международном симпозиуме «Нуклеиновые кислоты и родственные макромолекулы: синтез, структура, функции и применение» (Германия, 1997), 4-м Международном симпозиуме по биоорганической химии ГОРАС (Франция, 1997), международной конференции «Детекция мутаций-97» (Чехия, 1997), международной конференции «Олигонуклеотидный синтез» (США, 1998). Публикации. По материалам диссертации опубликовано 7 статей. Объем работы. Диссертационная работа изложена на 152 страницах, состоит из 3-х глав, введения, выводов, списка литературы из 214 наименований, приложения и содержит 9 таблиц и 29 рисунков.
