Содержание к диссертации
Введение
1. Список сокращений
2. Введение 6
3. Обзор литературы 8
3.1. Способы получения, биологическая активность и фармакокинентика бетулиновои кислоты 8
3.1.1. Способы получения бетулиновои кислоты 8
3.1.2. Биологическая активность бетулиновои кислоты и ее производных 10
3.1.2.1 Анти-ВИЧ активность 10
3.1.2.2 Противоопухолевая активность 16
3.J.2.3 Противовоспалительная активность 23
3.1.2.4 Другие активности 24
3.1.3. Фармакокинетика 25
3.1.3.1 Распределение 25
3.1.3.2 Метаболизм 27
3.2. Нанодисперси и с высоким соотношением «активное вещество/носитель» 29
3.2.1. Наночастицы из твердых липидов 31
3.2.1.1 Твердые липидные наночастицы (ТЛН, SLN) 31
3.2.1.2 Наносгруктурированные липидные носители (НЛН) 31
3.2.1.3 Коньюгат липид-лекарство (КЛЛ) 33
3.2.1.4 Приготовление твердых липидных наночастиц 33
3.2.1.4.1 Гомогенизация высокого давления 33
3.2.1.4.2 Приготовление ТЛН через микроэмульсии 34
3.2.1.5 Стабильность ТЛН дисперсий 34
3.2.1.6 Модели высвобождения лекарств из ТЛН 36
3.2.2. Наносуспензии 37
3.2.3. Другие структуры 39
4. Результаты работы и их обсуждение 42
4.1. Синтез новых аналогов бетулиновои кислоты 42
4.1.1. Эпимеризация гидроксильной группы в тритерпенах лупайового ряда 42
4.1.2. Синтез циклопропановых производных бетулиновои и бетулоновои кислот 45
4.1.3. Модификация бетулиновои кислоты по с28 положению 48
4.1.3.1 Синтез сульфамидных производных 49
4.1.3.2 Синтез 28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола 53
4.1.3.3 Синтез гомолога бетулиновои кислоты 54
4.2. Исследование биологической активности бетулиновои кислоты и ее производных 57
4.2.1. Солюбилизация бетулиновои кислоты и ее производных 58
4.2.1.1 Липосомные формы бетулиновои кислоты и ее производных 58
4.2.1.2 Наносуспензии бетулиновои кислоты 60
Экспериментальная часть 65
Выводы 85
- Нанодисперси и с высоким соотношением «активное вещество/носитель»
- Другие структуры
- Синтез сульфамидных производных
- Наносуспензии бетулиновои кислоты
Введение к работе
Рост заболеваемости меланомой в России с 1992 по 1999 гг. составил 30%, уступая лишь раку щитовидной и предстательной желез. Следует отметить, что среди всех злокачественньж опухолей кожи меланома занимает особое место. Так, составляя структурно не более 10% от всех форм рака кожи, она ответственна за 80% смертей, приходящихся на группу злокачественных опухолей кожи. На ранней стадии заболевания эффективно хирургическое лечение, но прогноз при метастатической меланоме остается очень плохим. Средняя продолжительность жизни пациентов с метастазами составляет один год [1].
В настоящее время для лечения пациентов с метастатической меланомой широко применяются такие препараты, как дакарбазин, цисплатин, производные нитрозомочевины (кармустин, ломустин, семустин), интерферон-а, интерлейкин-2. Однако клинический ответ препаратов в режиме монохимиотерапии не превышает 20%. В случае комбинированной терапии эффективность лечения достигает 30-50%. Следует отметить, что главной причиной неэффективности лечения является высокая токсичность препаратов [2].
В середине 90 годов прошлого столетия при скрининге более чем 2500 экстрактов на противоопухолевую активность было обнаружено, что БК способна селективно ингибировать рост клеток меланомы человека и ряда других опухолей нейроэктодермального происхождения через индукцию апоптоза [3]. В отличие от большинства современных препаратов, применяемых для лечения метастатической меланомы, БК не токсична для организма (вплоть до 500 мг/кг). Одной из основных проблем при лечении злокачественных образований является развитие резистентности опухолей к применяемым препаратам. Поэтому уникальное свойство БК ингибировать рост опухолевых клеток, устойчивых к таким препаратам как доксорубицин [], открывает новые перспективы для преодоления этой проблемы. Помимо противоопухолевых свойств, БК и ее производные обладают довольно широким спектром активностей: анти-ВИЧ, противовоспалительной, антималярийной, антиангиогенной и др.
БК можно рассматривать как новое родоначальное соединение (lead compound) с антимеланомной активностью. Однако использовать ее в качестве препарата для лечения метастатической меланомы в настоящее время не представляется возможным. Одним из основных факторов, ограничивающим использование БК, является довольно большая терапевтическая доза ( 250 мг/кг) [3]. Весь опыт химии лекарственных веществ говорит о том, что родоначальное соединение очень редко обладает оптимальными терапевтическими характеристиками. Поэтому актуальной задачей является проведение исследований для выявления взаимосвязи структура-активность (SAR), и на основании полученных данных -синтез новых более эффективных производных БК.
Плохая растворимость в воде (по нашим данным 1 мкг/мл) также ограничивает использование БК в качестве антимеланомного препарата. Одним из подходов для преодоления этой проблемы может стать включение БК в состав наночастиц: липосом, нанокристаллов и др. Нанодисперсии по сравнению с водорастворимыми формами лекарств обладают рядом преимуществ. Во-первых, уменьшается токсичность и биодеградация веществ, инкапсулированных в состав наночастиц. Из-за своих малых размеров они могут вводиться в организм внутривенно и не вызывать эмболию, а благодаря эффекту пассивного нацеливания [5], наночастицы имеют тенденцию накапливаться в опухолях, а это, в свою очередь, приводит к желательному повышению концентрации лекарственного вещества в солидных опухолях и очагах воспаления. Все вышесказанное делает очень привлекательным использование наночастиц в качестве носителя для конструирования новых лекарственных форм БК.
Настоящая работа посвящена синтезу новых аналогов БК, разработке методов солюбилизации БК и ее аналогов, а также исследованию их биологической активности.
Нанодисперси и с высоким соотношением «активное вещество/носитель»
В 1960 году впервые для солюбилизации и парентеральной доставки липофильных веществ стала использоваться жировая эмульсия [64], тогда как раньше внутривенно вводили только истинные растворы. Однако главным недостатком жировых эмульсий является их нестабильность, а также невозможность перорального введения (табл. 14). Другим способом солюбилизации и доставки веществ является их включение в состав липосом. Мембрана липосом состоит из природных фосфолипидов, поэтому они нетоксичны и биодеградируемы, могут сливаться с мембраной клетки, что приводит к внутриклеточной доставке их содержимого. Другим достоинством липосомной лекарственной формы является защищенность препарата от воздействия ферментов, что, в свою очередь, увеличивает его эффективность. Из-за своих малых размеров липосомы могут вводиться в организм внутривенно и не вызывать эмболию. Благодаря эффекту пассивного нацеливания [5] они имеют тенденцию накапливаться в опухолях, что приводит к желательному повышению в них концентрации лекарственного вещества. К недостаткам липосомной лекарственной формы можно отнести небольшой срок хранения, невозможность перорального введения, относительно невысокое отношение «активное вещество-носитель», высокая цена (табл. 14). Липосомы, так же как и другие наночастицы, довольно быстро захватываются РЭС, что, в свою очередь, ограничивает время их циркуляции в кровотоке. Происходит это в следствие взаимодействия липосом с белками плазмы - опсонинами, которые делают их мишенями для клеток РЭС. Для решения этой проблемы в середине 90-х годов прошлого столетия поверхность липосом модифицировали полимерами с гибкой гидрофильной цепью, например ПЭГ. Гибкие молекулы ПЭГ создают в примембранной области избыточное осмотическое давление, поэтому липосомы становятся невидимыми для РЭС (stealth liposomes) [65]. Успешными торговыми марками, вышедшими на фармацевтический рынок, являются Ambisome (1990, Европа, 1997, США) - лшгосомный препарат амфотерицина В для лечения грибковых инфекций, и Doxil (1995, США, 1996, Европа), препарат на основе стелс-липосом, предназначенный для лечения саркомы Калоши, первичного рака печени, рака простаты, рецидивирующего рака молочной железы. Еще одним способом для солюбилизации плохорастворимых веществ является получение полимерных наночастиц.
Главные достоинства этих структур заключаются в их высокой стабильности в организме, высокой загрузки систем активным веществом, возможности перорального введения, стерилизации паром, а также в низкой себестоимости. Однако токсичность полимеров [66] после интернализации частиц в клетки является главным фактором, ограничивающим их использование (табл. 14). В конце 90-х годов стали исследоваться новые типы липидных систем для доставки лекарств - наносуспензии (нанокристаллы), а также твердые липидные наночастицы (табл. 14) [67, 68]. ТЛН - это частицы, состоящие из твердых липидов (т.е. липидов твердых при комнатной температуре и при температуре тела) и стабилизированные ПАВ. Достоинством ТЛН является их физическая стабильность, защита включенных в их состав лабильных лекарств от биодеградации, постепенное высвобождение активного вещества, пассивное нацеливание, возможность внутривенного и перорального введения. К недостаткам можно отнести относительно невысокую загрузку таких систем активным веществом (около 25% по отношению к липидному матриксу), а также высокое содержание воды в дисперсиях (70-99.9 %) [70, 71]. Невысокая загрузка обычных ТЛН связана с ограниченной растворимостью активного вещества в липидном расплаве и со структурой твердого липидного матрикса. Если линидный матрикс состоит из одинаковых молекул (например, тристеарин или трипальмитин), то образуется совершенная кристаллическая структура с небольшими дефектами. А поскольку активное вещество располагается между цепями жирных кислот, между липидными слоями и также в дефектах кристалла, высокоорганизованная кристаллическая решетка препятствует включению большого количества активного вещества. Такую структуру можно сравнить с плотностью блоков в кирпичной стене, в которой практически нет дефектов (рис. 3. А.). Поэтому увеличить загрузку вещества в подобные системы возможно при использовании смесей нескольких липидов (моно-, ДИ-, триглицериды с различной длиной жирных цепей) или, другими словами, использовать «не идеальные» камни для построения стены, в которой будут дефекты (рис. 3. Б.). А. ТЛН, полученные из тристеарина Б. ТЛН, полученные из смеси различных липидов Рис. 3. Схематичное изображение структуры ТЛН, составленных из одинаковых и различных липидов На основании вышеизложенных соображений, была предложена модификация таких структур - «наноструктурированные липидные носители» (НЛН) [72, 73]. В свою очередь, среди НЛН вьщеляют три группы: «несовершенный тип», «сложный тип» и «аморфный тип». Отличительной чертой «несовершенного типа» НЛН является использование липидов, имеющих разные размеры и форму (например, глицеридов с различными жирнокислотными цепями). Смесь таких липидов дает дефекты в кристалле, а это приводит к дополнительному пространству в липидных частицах для распределения в них активного вещества и, как следствие, к большей загрузке (рис. 4). Если смешивать жидкие липиды с твердыми, образуется другой тип наноструктур, в которых в твердом липидном матриксе ненасыщенные липиды образуют масляные компартменты [74, 75]. Такие структуры хорошо подходят для жирорастворимых веществ.
Этот тип НЛН был назван «сложным типом НЛН» и может рассматриваться как аналог эмульсий вода/масло/вода (рис. 5). Для замедления кристаллизации активного вещества в НЛН, ведущей к разрушению таких структур, был предложен третий тип систем - «аморфный тип НЛН» (рис. 6) [74, 75]. Кристаллизации в твердых липидных наночастицах удается избежать при использовании смесей специальных липидов, которые находятся в липидном матриксе в аморфном состоянии (например, смесь гидроксиэйкозонилгидроксистеарата с изопропилмиристатом). Все вышеописанные модификации ТЛН подходят только для включения в их состав липофильных веществ. Для инкапсулирования в такие частицы полярных лекарств, их требуется перевести в жирорастворимую форму. Для этого было предложено получать соли с жирной кислотой, а также ковалентно связывать активное вещество с жирной кислотой через сложноэфирную связь. Такой тип ТЛН был назван «коньюгат липид-лекарство (КЛЛ)», Следует отметить, что процент включения активного вещества в такие системы, по сравнению с обычными ТЛН, увеличился и достигает 33% [76, 71]. Существует два основных метода приготовления твердых липидных наночастиц: гомогенизация высокого давления (ГВД) [77] и приготовление ТЛН через микроэмульсии [78]. ГВД метод, разработанный Мюллером и сотр. [77], подходит для приготовления различных липидных наносистем (ТЛН, НЛН и ЛЛК) и имеет две модификации: ГВД при повышенной температуре («горячая» ГВД) и ГВД при (или ниже) комнатной температуры («холодная» ГВД). При «горячей» ГВД липиды и активное вещество сплавляют при температуре примерно на 5 С выше точки плавления липида и эмульгируют в водном растворе ПАВ при нагревании. Горячую первичную эмульсию подвергают гомогенизации при высоком давлении при той же температуре. Обычно проводят три цикла при давлении 500 бар. Далее наноэмульсию охлаждают, в результате чего происходит затвердевание полученных наночастиц. Метод «холодной» ГВД применяют для приготовления наночастиц с температуролабильными и гидрофильными лекарствами. Липиды и лекарство сплавляют, затем измельчают в жидком азоте. При этом образуются твердые липидные микрочастицы. Первичную эмульсию получают при высокоскоростном перемешивании полученных частиц в холодном водном растворе ПАВ. Далее эмульсию подвергают гомогенизации высокого давления (5 циклов при давлении 500 бар) при температуре равной (или ниже) комнатной.
Другие структуры
В последние годы накапливаются сведения о том, что комплексы полярных липидов с амфифильными субстанциями могут организовываться в более замысловатые ансамбли, чем сферы (диски, трубки, кохлиты, стержни, ленты и др.). Эти комплексы, как правило, получаются при соотношениях активное вещество/липид, близком к единице (по крайней мере два коммерческих препарата амфотерицина В существуют в подобном виде: Amhpocil (диски, сульфат холестерина/амфотерицин В (1:1) и Ambelcet (ленты, На электронных микрофотографиях видно, что при увеличении соотношения активное вещество/носитель меняются структуры частиц. Если в отсутствии амфотерицина В в растворе (рис. 13а.) наблюдаются только липосомы, то при увеличении его количества появляются ленты. При соотношениях активное вещество/носитель, равным 1, можно видеть только ленты (рис. 13d.). Структуры образующихся агрегатов зависит и от способов приготовления. На рис. 14 представлены микрофотографии наноансамблей, образующихся при впрыскивании спиртового раствора липидов и амфотерицина В в воду [89]. При соотношении ДМФХ/ДМФГ/амфотерицин В (7:3:5) получаются диски толщиной 2.9 нм (рис. 14с), что меньше толщины бислоя. При замораживании-скалывании агрегаты удаляются полностью, что свидетельствует об отсутствии бислоя (рис. 14Ь). Авторы предполагают, что диски организованы в виде монослоя взаимопроникающих (interdigitated) липидов и антибиотика. На основании анализа данных о взаимосвязи «структура-активность» производных, а также родственных соединений БК были предложены структуры, которые по нашему мнению должны обладать большей активностью: Эпи-бетулиновая кислота. Производных БК с увеличенным объемом в области изопропенильной группы, без значительного уменьшения гидрофобности. Аналоги БК с биоизостерической заменой карбоксильной группы. Ранее в нашей лаборатории было показано, что бетулоновая кислота (7) обладает в 18 раз большей цитотоксичностью по отношению к клеткам меланомы MS, чем бетулиновая кислота (10Ь). Проведенный нами анализ литературных данных о взаимосвязи «структура-активность» ряда тритерпенов показал, что биологическая активность, как правило, увеличивается при переходе от Зр-гидрокси- к 3-кетогруппе, а затем к За-гидроксигруппе.
Увеличение активности Рис.15. Предполагаемое увеличение активности в ряду лупановых производных Мы предположили, что и для антимеланомной активности в ряду бетулиновой кислоты эта закономерность также может соблюдаться, то есть эпи-бетулиновая кислота может проявлять большую активность. Для проверки данной гипотезы необходимо было разработать удобный метод получения эпи-бетулиновой кислоты (10а). К настоящему времени известна только одна работа, в которой авторы выделяли эпибетулиновую кислоту (10а) экстракцией из коры кустарника Picramnia pentandra SW., произрастающего в США, при этом из 0.9 кг коры было выделено 0.8 г эпи-бетулиновой кислоты (10а). Здесь и далее нумерация соединений отличается от нумерации в предыдущих разделах Были исследованы два пути получения эпи-бетулиновой кислоты (10а): 1) эпимеризация соединений Зр-ряда; 2) стереоспецифическое восстановление бетулоновой кислоты (7). Для эпимеризации исследовали две реакции эффективные в случае холестан-Зр-ола: замещение тозилокси- на формилоксигруппу и замещение НО-группы на бензоилоксигруппу по Мицунобу. В нашем случае оба метода привели почти целиком к продуктам Д2,3-элиминирования (схема 5; табл. 16). Из 3-О-тозиллупеола (3) образовался 3-дезокси-2,3-дегидролупеол (6); из бетулина (1) 3-дезокси-2,3-дегидробетулин (4) и бензоат 3-дезокси-2,3-дегидробетулина (5). В Н-ЯМР-спектрах соединений наблюдались сигналы протонов дополнительной двойной связи в районе 6 5.39-5.28 м.д. и отсутствовал сигнал протона CHOR1. В спектре же соединения (5) сигналы метиленових протонов СН20 сдвинулись в более слабое поле на 0.65 и 0.75 м.д. по сравнению с соответствующими сигналами в исходном бетулине (1), что говорит о замещении первичного гидроксила при С28 на бензоилоксигруппу. Кольцо А у соединений лупанового ряда, в отличие от веществ холестанового ряда, содержит гем-диметильную группировку при С4. Стерические и электронные эффекты, обусловленные этой структурной особенностью, делают более вероятными реакции элиминирования и препятствуют реакции бимолекулярного замещения. В связи с этим, вероятно, любые варианты бимолекулярного замещения в положении 3 лупанового ряда малоперспективны.
Каталитическое гидрирование бетулоновой кислоты (7) над никелем Ренея приводило к восстановлению лишь двойной связи изопропенильной группы с образованием 20,29-дигидробетулоновой кислоты (8). В Н-ЯМР-спектре данного соединения наблюдаются два характерных дублета метильных протонов при С30 (0.88 м.д.) и С29 (0.76 м.д). В тоже время сигнал от протона при СЗ не появился. При использовании более активного катализатора, 5% Ru/C образовывалась смесь а- и -эпимеров 20,29-дигидробетулиновой кислоты (9a, 9Ь) в соотношении 60:40 (по данным Н-ЯМР-спектра) (схема 6; табл. 16). О восстановлении кето-группы бетулоновой кислоты говорит появление в ИК-спектре характерного сигнала ОН-группы (3430 см ]). Кроме того, в Н-ЯМР-спекгре вещества наблюдались сигналы протонов изопропильной группы, и протонов при СЗ, соответствующих а- и }-эпимеру: 3.29 м.д., 3.15 м.д., а сигналы протонов двойной связи исчезали. Проведенный нами анализ взаимосвязи «структура-активность» ряда тритерпенов, обладающих противоопухолевым и противовоспалительным действием, показал, что увеличение объема без значительного уменьшения гидрофобное в области изопропенильной группы может привести к получению производных бетулиновой кислоты с большей противоопухолевой активностью. Наиболее простым способом увеличения объема в области изопропенильной группы без значительного уменьшения гидрофобности является присоединение малополярных групп. Для этой цели нами было выбрано циклопропанирование. Для исключения побочных реакций при присоединении карбенов, которые могут протекать по обоим гидроксилам бету лина (1), исходным соединением нами был выбран диацетат бетупина (11). Синтез проводили с помощью стандартных методик дихлор- и дибромциклопропанирования олефинов по методу Макоши, с использованием в качестве источника карбена трихлорацетата натрия или бромоформа, и катализатора межфазного переноса ТЭБА. Для получения дихлор- и дибромпроизводных бетулина (17) и (13) соответствующие циклопропановые производные диацетата бетулина (16) и (12) без очистки дезацетилировали щелочным гидролизом. В спектрах Н-ЯМР обоих циклопропановых производных бетулина (17) и (13) отсутствуют сигналы олефиновых протонов S 4.67 М-Д. и б 4.57 м.д., присутствующие в исходном диацетате бетулина (11) (рис. 17). Соединение (20) было получено из производного бетулина (17) под действием лития в mpew-бутиловом спирте. После перекристаллизации полученного соединения из изопропилового спирта в области сильного поля (5 0.24 м.д.) Н-ЯМР спектра появился мулътиплет четырех протонов циклопропанового кольца (рис. 17).
Синтез сульфамидных производных
Сульфамидные производные планировалось получать через 28-аминолупеол (29), Для его синтеза был предложен путь, изображенный на схеме 8. Исходный бету лин (1) региоселективно окисляли до бетулинальдегида (27) стерически затрудненным окислителем, оксоаммониевой солью ТЕМПО. В качестве первичного окислителя использовали перманганат калия с катализатором межфазного переноса дибензо-18-краун-6. На второй стадии из бетулинальдегида (27) получали нитрил бетулиновой кислоты (28) кипячением с гидрохлоридом гидроксиламина в этаноле в присутствии конц НС1. Строение нитрила (28) подтверждали данными Н-ЯМР-, масс- и ИК-спектроскопии, а также данными элементного анализа. В Н-ЯМР-спектре отсутствовал сигнал альдегидного протона 9.65 м.д., кроме того, сигнал протона при С19 смещался на 0.2 м.д. в более сильное поле по сравнению с исходным альдегидом (27). В масс-спектре наблюдался молекулярный ион 437 [М] , а в ИК-спектре появлялась характерная полоса нитрильной группы (2225 см"1) и не наблюдалась полоса поглощения карбонильной группы (1700 см"1). Для получения 28-аминолупеола (29) из нитрила (28) нами было опробовано как каталитическое гидрирование, так и восстановление гидридами. Но ни один из способов, приведенных на схеме, не привел к восстановлению нитрильной группы до соответствующего амина. Подобный результат мы связываем со стерическими затруднениями, обусловленными наличием в а положении к нитрильному углероду (С28) четвертичного атома углерода. Другая схема синтеза сульфамидных производных (схема 9), основанная на восстановлении оксима оказалась эффективной. Свободная гидроксильная группа бетулинальдегида (27) блокировалась бензоильным остатком. Из полученного З-О-бензоилбетулинальдегида (30) синтезировали соответствующий З-О-бензоилбетулинальдегидоксим (31) кипячением с гидрохлоридом гидроксиламина в этаноле. А для восстановления оксима (31) до 28-амино-З-О-бензоиллупеола (32) использовали NaBH3CN с 10% водным раствором ТіСЬ. Полученный амин (32) был превращен в З-О-бензоил-28-мезиламинолупеол (33) и З-Обензоил-28-тозиламинолупеол (35) ацилированием соответствующими хлорангидридами.
Последующее деблокирование гидроксильных групп позволило получить искомые 28-мезиламинолупеол (34) и 28-тозиламинолупеол (36). Строение полученных производных было подтверждено данными Н-ЯМР спектроскопии, а также элементного анализа. Анализ Н-ЯМР спектров показьшает появление сигналов амидных протонов: с б 4.39 м.д. для 28-тозиламинолупеола (36) и 5 4.11 м.д. для 28-мезиламинолупеола (34). Кроме того, о появлении сульфамидного заместителя в молекуле свидетельствует расщепление метиленовых протонов при С28 на амидном протоне: для 28-тозиламинолупеола (36) сигналы от этих протонов резонируют при 2.98 м.д. и при 2.57 м.д., а для 28-мезиламинолупеола (34) сдвигаются в более слабое поле (3.28 м.д. и 2.78 м.д) (рис. 20). Наиболее распространенный метод получения тетразолов заключается в присоединении азид ионов к нитрилам. Такие реакции, как правило, требуют довольно жестких условий (нагревание свыше 100С в полярных апротонных растворителях в течение 24 ч). В нашем случае нагревание азида натрия (с добавлением хлорида аммония для увеличения растворимости азида) в ДМФА вплоть до 140С в течение нескольких дней не привело к образованию каких-либо других продуктов. Механизм данной реакции заключается в нуклеофильной атаке азид ионом положительно заряженного углерода в нитрильнои группе с последующим замыканием тетразольного кольца. Очевидно, что величина заряда на углероде в нитрильнои группе имеет решающее влияние на скорость реакции. Часто в этой реакции в качестве катализаторов используются кислоты Льюиса или Брэнстеда. Координация кислот Льюиса или протона с нитрильным азотом увеличивает положительный заряд на углероде и облегчает нуклеофильную атаку азид ионом. Однако в этой реакции добавление кислот не привело к получению тетразола (24). Подобный результат, скорее всего, связан (также как и в случае восстановления нитрила (28) до амина (29)) со стерическими затруднениями в данной области молекулы. Схема 10. Синтез 28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола Поскольку обычные методы построения тетразольного цикла оказались не эффективными, для получения тетразола (24) мы использовали новую методику для стерически затрудненных нитрилов - микроволновое облучение с использованием TMSN, Bu2SnO в диоксане (схема 10)2.
В жестких условиях (нагрев до 165С) через 8 ч по ТСХ было Синтез 28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола (24) в условиях микроволнового облучения проводился сотрудником фирмы Хембридж И.В. Близнецом. обнаружено два более гидрофобных продукта, которые после выделения были идентифицирован как нитрил (37) и тетразол (38). Деблокирование гидроксильной группы производного (38) кислотным метанолизом привело к получению 28-дезметил-28-(5-тетразолил)лупеола (24) с выходом 21.8%. Строение производного (24) подтверждали данными масс- и Н-ЯМР спектроскопии. В Н-ЯМР спектре наблюдали появление в слабом поле (13.20 м.д.) уширенного сигнала протона тетразольного кольца. Для синтеза гомолога БК (26) был наработан по схеме 11 З-О-ацетшг-28-О-мезилбетулин (40), из которого реакцией с NaCN в ДМФА планировалось получить нитрил (41). Данные реакции, как правило, не требуют высоких температур и для них характерны высокие выходы. Однако, в обсуждаемом случае в плоть до 90С новых продуктов не наблюдалось. При достижении 90С на ТСХ было обнаружено новое более гидрофобное вещество, которое после хроматографического выделения было идентифицировано как продукт перегруппировки с расширением цикла (42). В Н-ЯМР спектре соединения (42) исчезают сигналы метиленовых протонов при С28 и появляется новый сигнал протона при двойной связи 5.34 м.д. Также наблюдается влияние перегруппировки на сигналы других протонов. Так, сигналы от протонов при двойной связи смещаются в более слабое поле на 0.05 м.д. В масс-спектре был обнаружен молекулярный ион 467 [М]+ соответствующий молекулярной массе вещества (42). Подобную перегруппировку мы также наблюдали при замещении первичного гидроксила при C2S моноацетатабетулина (39) на галоген (схема 12). В случае замещения на хлор, судя по ]Н-ЯМР спектру, основного продукта (43) в реакционной смеси было 80%, а продукта перегруппировки (42) 20%. При замещении на бром картина менялась только количественно. Содержание основного продукта (44) в реакции было 25%, а продукта перегруппировки (42) 75%. Известно, что реакции нуклеофильного замещения могут осложняться другими превращениями. Они происходят при появлении в качестве переходного состояния карбкатиона. В этом случае кроме реакций SNI могут происходить элиминирование и перегруппировки. Причем, вероятность последних возрастает при наличии соседнего четвертичного атома углерода (схема 13). Недавно вышла публикация, в которой описано производное (42). Его получали кипячением моноацетатабетулина (39) в пиридине с РОСГ? [90]. Н-ЯМР-спектр этого соединения идентичен нашему
Наносуспензии бетулиновои кислоты
Существуют лекарственные формы более эффективные, с точки зрения отношения активное вещество/носитель, чем липосомы - наносуспензии. Они представляют собой нанокристаллы активного вещества, стабилизированные ПАВ. Наносуспензии БК получали впрыскиванием к перемешиваемому раствору БК с яФХ в ТГФ 25-50 кратного избытка воды с последующим концентрированием на роторном испарителе. Полученную суспензию озвучивали на ультразвуковой бане в течение 3 мин. Для оценки размера частиц использовали турбодиметрию. Оказалось, что их наименьший средний размер (316 нм) достигается при соотношении яФХ/БК (1/1) (рис. 23). После продавливания через ядерный фильтр с порами 400 нм наносуспензии БК структура частиц изменилась: на электронной микрофотографии обнаружены очень вытянутые эллипсы с длиной от 50 до 350 нм и с диаметром около 30 нм. Рис. 25. Электронная микрофотография наносуспензии БК, стабилизированной яФХ (яФХ/БК 1:1), после озвучивания в течение 3 мин. на ультразвуковой бане и продавливания через ядерный фильтр 400 нм Полученные структуры, скорее всего, не являются нанокристаллами БК, стабилизированными яФХ. По нашим расчетам, для стабилизации нанокристаллов БК представленного размера требуется в 3-4 раза меньше. Следовательно, в описанных условиях приготовления наносуспензии должны образовываться значительное количество липосом,, чего не видно на электронных микрофотографиях. Можно предположить, что данные структуры получаются путем чередования липидов с БК. В научной литературе описаны подобные образования. Галактозилцерамиды,, содержащие cis мононасыщенные ацильные цепи, в воде самоорганизуются в замысловатые наноструктуры. Так, 24:IА15 галактозилцерамиды образуют нанотрубки диаметром 25-30 нм (рис. 26). На рис 28 представлены два способа образования нанотрубок. Стрелки показывают угол наклона и направление липидных молекул. Способ, показанный в правой стороне рисунка, иллюстрирует разделение доменов полосы вьшуклой формы вдоль их границ с получением лент скрученных по спирали, которые затем уплотняются с образованием цилиндрических трубок.
В левой стороне рисунка представлен механизм образования нанотрубок, который свойственен 22:1 галактозилцерамиду (рис. 27). В этом случае полосе доменов не нужно проходить через стадию спирали перед образованием трубки - она может просто сворачиваться в нанотрубку маленького диаметра. В работе использованы диизопропилазодикарабоксилат и L-Селектрид (три-втор-бутилборгидрид лития) (Aldrich), остальные реактивы отечественного производства квалификации не ниже хч. Спектры Н-ЯМР регистрировали на спектрометре Bruker DPX-300 (Германия) в CDCb при рабочей частоте 300 МГц. Химические сдвиги (5, м.д.) приведены относительно МедЗі. ИК-спектры регистрировали на приборе Hitachi 270-30 data processor (Япония) в области 800-3600 см-1 в вазелиновом масле. Масс-спектры снимали на приборе KRATOS MS890 (EI 70 эВ, 250С). Элементный анализ проводили на элементном анализаторе CHNS ЕА 1112 (Thermo Finigan, Италия). Температуру плавления определяли на приборе ПТП(М) ОАО «Химлаборприбор». Оптическую плотность измеряли на сканирующих спектрометрах Multiskan МСС/340 (LabSystem, Финляндия) и ULTROSPEC 4050 (LKB Biochrom). ВЭЖХ проводили на хроматографе Knauer (Германия), оснащенном насосом "Knauer", УФ-детектором с переменной длиной волны "Knauer", инжектором "Knauer" и интегратором "Chromatopack C-R3A" (Shimadzu, Япония). Колонка: Separon S6xCig (3.3x150 мм), элюент СНзСМ:МеОН:Н20:НзР04 (60/30/10/0.06 мл), расход 0.5 мл/мин, детекция по поглощению при 210 нм, объем петли 20 мкл. Дегазирование растворителей для ВЭЖХ проводили на ультразвуковой бане ТК52 (Sonorex, Германия). Моноламеллярные липосомы получали с помощью экструдера LiposoFast Basic фирмы Avestin Inc. (Канада). Электронные микрофотографии получали негативным контрастированием с 1% водным раствором уранилацетата с помощью электронного микроскопа Joel 100СХ (Япония) при инструментальном увеличении 10, 20 тыс. ТСХ осуществляли на пластинках "Сорбтон Диол" (Хромдет-Экология, Россия) в системах: хлороформ (А), хлороформ-метанол-муравьиная кислота (100:2:0.5) (Б), хлороформ-метанол-аммиак 30% (40:1:0.1) (В), хлороформ-метанол (10:0.2) (Г), хлороформ-метанол (10:0.5) (Д), хлороформ-метанол (10:0.1) (Е), хлороформ-гексан (2:1) (Ж), гексан-этилацетат (3:1) (3). Тритерпены обнаруживали на пластинках 50% серной кислотой с последующим нагреванием. Колоночную хроматографию проводили на силикагеле L 60/100 мкм (Merck, Германия).
Цитотоксичность производных бетулиновой кислоты определяли в НИИ Экспериментальной Диагностики и Терапии Опухолей ОНЦ РАМН им. Н.Н.Блохина на культурах клеток опухолей человека: меланомы (линии MS, С0І0З8, BRO) и карциномы яичника (CaOv). Импрегнирование пластинок для ТСХ нитратом серебра. Пластинку для ТСХ замачивали в 2% AgN03 в ацетонитриле в течение 5 минут. Далее нагревали в сушильном шкафу при 100С в течение 40 минут. Выделение бетулина (1) и лулеола (2) из коры березы. Кору березы измельчали до размера 1 4 мм, отсеивали через сито для удаления от пыли. Измельченную кору (80 г) помещали в аппарат Сокслета и экстрагировали 800 мл 95% ацетоном (5 циклов). Полученный экстракт пропускали через стеклянный фильтр, заполненный слоем основного оксида алюминия (2-3 см) для удаления полярных примесей. Фильтрат упаривали и перекристаллизовывали 2 раза из хлороформа. Получали 6.4 г (8% от массы коры) бетулина (1) в виде белых кристаллов; т. пл. 258-260С (лит. данные т.пл. 26ГС [92]); ,-0.14 (А). ИК: 3470 (ОН), 1640 (С=С). ]Н-ЯМР (CDC13): 4.67, (1 Н, д, =СН2), 4.57 (1 Н, д, =СН2), 3.78 (1 Н, м, Н28), 3.31 (1 Н, м, Н28), 3.17 (1 Н, м, НЗ), 2.36 (1 Н, м, Н19), 1.66, 1.23, 0.96, 0.94,0.80, 0.74 (все 3 Н, с, СН3). 5.00 г остатка, полученного при упаривании маточника от кристаллизации бетулина (1), хроматографировали на силикагеле, элюируя хлороформом. Получили 3.15 г (63%) лупеола (2) в виде белого порошка; т. пл. 214-216С (лит. данные т.пл. 215-216С [93]); Л/0.27 (А). Н-ЯМР (CDCh): 4.66, (1 Н, д, =СН2), 4.56 (1 Н, д, =СН2), 3.17 (1 Н, м, НЗ), 2.31 (1 Н, м, Н19), 1.66, 1.23, 0.96, 0.94, 0.92, 0.80, 0.74 (все 3 Н, с, СН3). Бетулоновая кислота (7). 15 г (34 ммоль) бетулина (2) смешивали с 600 мл 85% уксусной кислоты и помещали на водяную баню с температурой 15-20С. К смеси одной порцией прибавляли раствор 15 г (150 ммоль) СгОз в 26 мл уксусной кислоты и 22 мл воды при перемешивании и постоянной температуре. При этом весь бетулин растворялся. Через 10 мин к реакционной смеси прибавляли 600 мл 10% раствора NaCl. Продукты реакции экстрагировали эфиром (2x600 мл). Эфирный экстракт промывали (4x500 мл) 10% раствором NaCl. К эфирному экстракту прибавляли 500 мл 10% раствора NaCl и 300 мл 4 н. раствора NaOH. При слабом встряхивании выпадал хлопьевидный осадок на границе раздела фаз (натриевая соль бетулоновой кислоты). Через 1 ч водный слой удаляли, эфирный раствор декантировали, и к оставшемуся осадку в делительную воронку прибавляли по 600 мл эфира и столько же 10% раствора NaCl, смесь тщательно встряхивали, давали разделиться эфирному и водному слоям. Водный, эфирный и промежуточный слои разделяли и каждый фильтровали. Осадки объединяли и сушили в вакууме в присутствии пятиокиси фосфора. Затем кристаллы растворяли в 400 мл метанола, фильтровали через слой силикагеля (толщиной 2 см) для удаления следов соединений хрома, и фильтрат упаривали. Получали 9.53 г (59%) натриевой соли бетулоновой кислоты (7).