Введение к работе
Актуальность проблемы. Исследования последних лет показали возможность направленного воздействия на нуклеиновые кислоты адресованными олигонуклеотидами и их производными. Основной целью такого воздействия является ген и в пределах этого гена должна быть выбрана последовательность, значимая с точки зрения его Функционирования. Воздействовать на генетический аппарат клетки можно гибридизуя одноцепочечный олигонуклеотид либо с комплементарной последовательностью мРНК или пре-мРНК, либо с последовательностью самого гена. Эти способы генетического контроля, получившие название антисмыслового и антигенного ингибирования, открывают большие возможности для развития биологических Функциональных исследований, диагностики и терапии. Любой из механизмов действия антисмысловых олигонуклеотидов и их производных предполагает гибридизацию с комплементарной последовательностью в составе мишени. Для того, чтобы антисмысловые олигонухлеотиды были инструментом, эффективно воздействующим на генетический аппарат клетки, комплексообразование должно протекать в условиях, обеспечивающих стабильность комплементарного комплекса. Кроме температуры и определенных концентраций одно- и двухвалентных катионов, стабильность комплементарного комплекса определяется нуклеотидным составом и длиной участка связывания, которая зависит в свою очередь от собственной вторичной и третичной структуры отдельных цепей. Исследование количественных характеристик модификации нуклеиновых кислот реакционно способными производными олигонуклеотидов в составе комплементарного комплекса дает информацию о стабильности комплекса олигонуклеотида с соответствующим участком нуклеиновой кислоты, что представляет существенный интерес для практической реализации антисмыслового и антигенного подходов. Кроме того, информация, полученная с помощью метода комплементарно адресованной модификации нуклеиновых кислот в комплементарном комплексе с адресом реагента, позволяет делать выводы относительно особенностей строения этих комплексов и самих полинуклеотидных мишений, а также о влиянии особенностей структуры мишени на эффективность взаимодействия с антиСмысловыми нуклеотидами.
цель работы, целью настоящей работы явилось исследование количественных закономерностей модификации одно- и двуцепочечных ДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов, изучение влияния на эффективность модификации одноцепочечных ДНК таких
параметров, как длина олигонуклеотидной части реагента, длина и структура ДНК-мишени, оценка вклада неспецифической модификации.
Научная новизна. К моменту начала настоящей работы в литературе имелись лишь разрозненные сведения относительно эффективности воздействия на одноцепрчечные нуклеиновые кислоты олигонуклеотидов и их реакционно способных производных. Полностью отсутствовали данные по воздействию реакционно способных производных олигонуклеотидов на двуцепочечные ДНК в составе трехцепочечных комплексов. В настоящей диссертационной работе проведено систематическое исследование количественных закономерностей модификации одно- и двуцепочечных ДНК алкилирующими производными олигонуклеотидов. На серии ДНК-мишеней различной длины и структуры- синтетических олигонуклеотидах, односпиральном и двуспиральных фрагментах ЛНК изучено влияние на эффективность модификации таких параметров, как длина олигонуклеотидного адреса реагента, длина и структура ДНК-мишени, а также условий проведения модификации: температуры, рН, солевого состава среды. На примере модификации олигодезоксирибонуклеотида pd(CCCCTGTTTGGC) алкилирующим производным некомплементарного ему олигонуклеотида pd(TTT)rU выполнена оценка вклада неспецифической модификации для реакций, протекающих в комплексе. Показано, что даже в случае реагентов, обладающих низким сродством к мишени, модификация протекает в комплементарном комплексе с высокой селективностью. Выявлено сильное влияние собственной вторичной структуры мишени на положение точек модификации даже при модификации коротких олигонуклеотидов. На более длинных мишенях показано, что вовлечение участка связывания реагента в формирование вторичной и третичной структуры мишени оказывает сильное влияние на термодинамические параметры образования комплементарного комплекса. Впервые была проведена химическая модификация двойной спирали ДНК в составе тройного комплекса и исследована зависимость степени модификации от рН среды для комплексов состава РуРиРу.
Практическая ценность. Широкое применение в последние годы олигонуклеотидов и их производных для направленного воздействия на нуклеиновые кислоты требует полной характеризации термодинамики процесса комплексообразования. Измерение константы связывания олигонуклеотида с индивидуальным участком связывания в пределах протяженной молекулы ДНК или РНК представляет собой первый шаг на этом пути. Выполненые в диссертации исследования показали, что из
полученных экспериментально кинетических кривых и изотерм модификации с помощью кинетических уравнений, описывающих процесс модификации, могут быть определены кинетические и термодинамические параметры процесса комплексообраэования, а также исследовано влияние на них различных факторов.
Апробация работы. Результаты работы докладывались на II Всесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Новосибирск, 1985), на III Всесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Тбилиси, 1987), на международном симпозиуме "Перспективы терапевтического и диагностического применения олигонуклеотидных производных" (Новосибирск, 1988), на IVВсесоюзном совещании "Органическая химия ДНК-дуплексов" (Киев, 1989), на 19-ом международном симпозиуме FEBS (Рим, Италия, 1989), на международном симпозиуме "Синтетические олигонуклеотиды: проблемы и области практического использования" (Москва, 1991), на 21-ом международном симпозиуме FEBS (Дублин, Ирландия, 1992), на 7-ом международном симпозиуме "Молекулярное узнавание" (Киото, Япония, 1992), на международном симпозиуме "Антисмысловые олигонуклеотиды и рибонуклеаза Н" (Франция, 1992), на международном симпозиуме "Антисмысловые нуклеиновые кислоты -методы специфического ингибирования экспрессии гена и терапевтические приложения" (Гармиш-Партенкирхен, Германия, 1993).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ.
Объем работы. Диссертационная работа изложена на 163 страницах машинописного текста, состоит из 3 глав, введения, выводов, списка цитируемой литературы из 142 наименований и содержит 6 таблиц и 35 рисунков.
