Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
МЕТАЛЛОЗАВИСИМЫХ ДНКАЗ 9
1. Классификация ДНКаз 9
2. Распространённость металлозависимых ДНКаз 12
3. Молекулярная масса и субъединичность металлозависимых ДНКаз 13
4. Изоэлектрическая точка, изоформы металлозависимых ДНКаз . 14
5. Первичная структура и активный центр металлозависимых ДНКаз 15
6. Влияние рН среды и температуры на активность металлозависимых ДНКаз 17
7. Активаторы металлозависимых ДНКаз 18
8. Ингибиторы металлозависимых ДНКаз 22
ГЛАВА II. СПЕЦИФИЧНОСТЬ ДЕЙСТВИЯ МЕТАЛЛОЗАВИСИМЫХ ДНКАЗ 25
1. Величина продуктов гидролиза 25
2. Механизм гидролиза ДНК металлозависимыми
ДЖазами 27
3. Конформация ДНК (субстрата) 31
4. Специфичность металлозависимых ДНКаз к химической природе оснований субстрата 36
5. Специфичность металлозависимых ДНКаз к пространственной структуре субстрата - з ОБСУВДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ 47
ГЛАВА III. ВЫДЕЛЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ШЗИКО-ХИШЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ ДНКАЗЫ 47
1. Выделение Ca,Mg -зависимой ДНКазы 47
2. Характеристика физико-химических свойств Ca.Mg--зависимой ДНКазы 51
ГЛАВА ІV. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ ДНКАЗЫ К ПЕРВИЧНОЙ И ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРАМ СУБСТРАТА 73
ГЛАВА V. ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ
ДНКАЗЫ К ЛОКАЛЬНЫМ ВАРИАЦИЯМ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
СУБСТРАТА 89
1. Действие Ca,Mg -зависимой ДНКазы на двухцепо-чечные полидезоксирибонуклеотиды 90
2. Действие CafMg -зависимой ДНКазы на 47-членный фрагмент ДНК 94
3. Действие Ca,Mg - зависимой ДНКазы на синтетиче ские РНК ДНК и РНК РНК комплексы 103
4. Влияние высокой ионной силы раствора на субстратную специфичность Ca,Mg -зависимой ДНКазы 104
5. Заключение НО
ВЫВОДЫ 125
ЛИТЕРАТУРА 127
- Классификация ДНКаз
- Величина продуктов гидролиза
- Выделение Ca,Mg -зависимой ДНКазы
- ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ ДНКАЗЫ К ПЕРВИЧНОЙ И ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРАМ СУБСТРАТА
- Действие Ca,Mg -зависимой ДНКазы на двухцепо-чечные полидезоксирибонуклеотиды
Введение к работе
Дезоксирибонуклеинат-5 -олигонуклеотидгидролазы-дезоксирибо-нуклеазы (КФЗ.І.4.5) относятся к одной из интенсивно исследуемых групп гидролитических ферментов. Согласно современным представлениям ДНКазы участвуют, как в реакциях деполимеризации нуклеиновых кислот, так и в избирательных расщеплениях связей в молекуле ДНК генома, необходимых для осуществления процессов репликации, репарации, рекомбинации и рестрикции. В последнее время получены многочисленные данные, подтверждающие чрезвычайную гетерогенность ферментов этой группы, а, следовательно, и участие в каждом из этих процессов определённых ДНКаз. Имеющиеся сведения о важной роли ДНКаз во многих генетических процессах у бактерий и фагов, определяют интерес к исследованию свойств, специфичности и механизма действия этих ферментов у эукариот. Кроме того, ДНКазы широко используются как инструменты при исследовании структуры и функции нуклеиновых кислот, организации тонкой структуры нуклеопро-теидных комплексов. В последнее время эти ферменты получили применение в практической медицине в качестве эффективных противовирусных препаратов.
Среди ДНКаз большую группу с разнообразными свойствами составляют металлоактивируемые ДНКазы эндо-типа действия, которые широко распространены в ядрах клеток различных животных. Тесная связь этих ферментов с белками хроматина и способность активировать синтез ДНК позволяют предположить важную роль этих ферментов в процессах репликации ядерной ДНК. Тем не менее вопрос о функции этих ферментов ещё далёк от окончательного выяснения.
Несмотря на значительное количество работ, посвященных ме-таллозависимым ДНКазам, систематизация этого материала до сих пор не проводилась. Большинство исследователей до последнего времени ограничивалось констатацией некоторых свойств ДНКаз и выяснением особенностей их действия на различные субстраты.
Наиболее изученный представитель этой группы ферментов -панкреатическая ДНКаза I, широко используется для исследования структуры хроматина, выделения мининуклеосом и для избирательного расщепления транскрипционноактивных участков хроматина. Кроме этого ДНКаза I применяется для получения фрагментов определённой величины при сиквенировании ДНК, определения периодичности двойной спирали В-ДНК в растворе и локальных флуктуации в структуре ДНК, зависящих от нуклеотидной последовательности. Интерес к эукариоти-ческим металлозависимым ДНКазам значительно возрос в последнее время в связи с активным поиском новых высокоспецифичных ДНКаз как инструментов для структурно-функциональных исследований нуклеиновых кислот.
В то же время стало очевидным, что для структурных исследований и решения задач генной инженерии необходимо использование высокоочищенных ферментов с установленными физико-химическими свойствами. Без знания специфичности и механизма действия ферментов практически невозможно исследование их роли в различных генетических процессах. Удобной моделью для выяснения функции ДНКаз в метаболизме ДНК в клетках эукариот являются дифференцирующие клетки эмбрионов морского ежа.
Именно эти проблемы определили задачи данной работы, которые были сформулированы следующим образом:
Выделить из клеток эмбрионов морского ежа s,intermedins гомогенный препарат Ca,Mg -зависимой ДНКазы.
Определить основные физико-химические свойства фермента.
Изучить влияние двухвалентных ионов металлов и различных реагентов на активность фермента.
Исследовать специфичность фермента к химической природе оснований субстратов.
Исследовать специфичность фермента к пространственной структуре субстратов.
Проведённые исследования показали, что в клетках эмбрионов морского ежа Strongylocentrotus intermedius находится несколько ДНКаз эндо-типа действия. Наиболее высокой удельной активностью обладает Са,% - зависимая ДНКаза.
На первом этапе работы впервые из морских организмов был выделен гомогенный препарат Ca,Mg - зависимой ДНКазы из эмбрионов морского ежа и охарактеризованы его основные физико-химические свойства.
В связи с тем, что на механизм действия и специфичность металлозависимых ДНКаз существенное влияние оказывают ионы двухвалентных металлов, было изучено влияние этих катионов и их сочетаний на ферментативную активность Ca,Mg - зависимой ДНКазы. Полученные данные позволили подойти к исследованию специфичности фермента к химической природе оснований и пространственной структуре полимерного субстрата с учётом локальных флуктуации в структуре спирали.
Показано, узнавание локальной конформации сахарофосфатного остова ДНК лежит в основе специфичности Ca,Mg - зависимой ДНКазы. На основе экспериментальных данных предположено, что фермент гидролизует В-ДНК в местах обладающих гладкой структурой классической В-конформации или тяготеющих к А-конформации.
Знание свойств и специфичности Ca,Mg - зависимой ДНКазы открывают возможности использования фермента для структурно-функ- циональных исследований нуклеиновых кислот и нуклеопротеидных комплексов. Необычное свойство ДНКазы-проявление активности в растворах с высокой ионной силой-позволяет предположить, что фермент может найти применение в практической медицине при лечении ран с использованием гипертонических растворов, а также как противовирусный препарат.
ЛИТЕРАТУРНЫЙ ОБЗОР
МЕТАЛЛОЗАВИСИМЫЕ ЭНД0ДЕ30КСИРИБ0НУКЛЕАЗЫ ЭУКАРИОТ
Литературный обзор освещает круг вопросов, исследуемых автором в представляемой экспериментальной работе. Данные о метал-лозависимых ДНКазах эукариот приведены в обзоре М.Ласковского (1967 г.) /I/ и в монографии В.С.Шалота (1968г.) /2/. Биологическая роль нуклеаз освещена в обзоре Р.И.Татарской (1976г.) /3/ и сборнике обзоров "Нуклеазы" (1982г.) /4/. В настоящем обзоре использованы литературные данные, опубликованные в отечественных и основных зарубежных изданиях до 1984 года.
class1 РАСПРОСТРАНЁННОСТЬ И ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
МЕТАЛЛОЗАВИСИМЫХ ДНКАЗ class1
Классификация ДНКаз
Дезоксирибонуклеазы - ферменты, катализирующие гидролитическое расщепление фосфодиэфирных связей в дезоксирибонуклеиновых кислотах. Для классификации разнообразных дезоксирибонуклеаз в соответствии с их физико-химическими свойствами, специфичностью и механизмом действия Ласковский /1,4/ предложил использовать следующие критерии.
1. Способ действия фермента на нуклеиновую кислоту. На основании этого критерия ДНКазы делятся на две группы. Эндонуклеазы - ферменты, вносящие разрывы на всём протяжении полинуклеоти-дной цепи не ближе, чем на расстоянии двух-трёх нуклеотидов от конца цепи, и экзонуклеазы, осуществляющие ступенчатое отщепление мононуклеотидов от конца полинуклеотидной цепи.
2. Расщепление межнуклеотидных связей в З -р или р положении с образованием продуктов гидролиза соответственно с 5-или 3 -концевыми фосфатами. По этому признаку ферменты делятся строго на две группы.
3. Специфичность к химической природе оснований, прилегающих к гидролизуемым фосфодиэфирным связям. В соответствии с этим критерием выделяется три группы ферментов: ДНКазы, обладающие строгой специфичностью к определенной нуклеотидной последовательности; ДНКазы, предпочитающие те или иные межнуклеотидные связи и ДНКазы не обладающие специфичностью к природе оснований,
4. По специфичности ко вторичной структуре субстрата ДНКазы делятся на три группы: гидролизующие только двухцепочечные ДНК, гидролизующие только одноцепочечные ДНК и не обладающие специфичностью ко вторичной структуре.
5. Способность ДНКаз атаковать собственную ДНК.
6. По механизму эндонуклеолитического расщепления двухце-почечного субстрата ДНКазы делятся на два типа. Ферменты с од-ноударным механизмом действия расщепляют обе нити ДНК в одном и том же месте. Ферменты с двуударным механизмом расщепляют одну нить в разных участках ДНК таким образом, что двухцепочечная макромолекула разрывается только после совпадения двух одноце-почечных разрывов. Такая классификация в значительной мере облегчает систематизацию и обобщение имеющихся сведений о свойствах и специфичности ДНКаз.
Величина продуктов гидролиза
Одной из важных характеристик деполимеризующих ферментов является глубина превращения субстрата в процессе гидролиза и характер образуемых фрагментов. На основании величины продуктов исчерпывающего гидролиза субстрата ферментом ДНКазы условно делятся на мелкощепящие и крупнощепящие.
Существовавшие ранее методы исследования нуклеиновых кислот и, следовательно, методы тестирования ферментативных активностей ДНКаз ограничивали возможности подробного изучения продуктов ферментативного гидролиза рассмотрением коротких фрагментов ДНК. Вследствии этого, основная масса информации посвящена изучению продуктов исчерпывающего гидролиза мелкощепящих ДНКаз, образующих фрагменты с длиной цепи более 5 нуклеотидов (средний размер равен 8-Ю мономерным звеньям)/16, 18, 20, 31, 36, 41, 42, 54, 60, 61, 74, 90/.
Для целей генной инженерии и молекулярной биологии наибольший интерес представляют ДНКазы, образующие дискретные фрагменты большой молекулярной массы, т.е. ферменты, аналогичные рестрикта-зам прокариот. Поиск и исследование свойств ферментов такого типа стал возможен после разработки более чувствительного, специфичного для регистрации активности эндонуклеаз метода, основанного на изменении электрофоретической подвижности в агарозном и ПМ гелях полинуклеотидов различной длины и фаговых ДНК различных форм. Так, при одном одноцепочечном разрыве суперкольцевая замкнутая молекула ДНК (форма I) переходит в открытую кольцевую форму (П), характеризующуюся гораздо более низкой электрофоретической подвижностью. Полноразмерные линейные молекулы (форма Ш) образуются как в результате двухцепочечного разрыва, так и путём накопления одно-цепочечных разрывов в открытой кольцевой форме.
В последнее время обнаружены и интенсивно исследуются так называемые крупнощепящие металлозавиеимые ДНКазы, которые образуют устойчивые к дальнейшему гидролизу фрагменты большой молекулярной массы. В клетках дрожжей /64-66, 91/ обнаружен новый класс эндодезоксирибонуклеаз, характер действия которых подобен рестри-ктазам П типа из прокариот /92/. Примечательной особенностью этих ферментов является образование набора дискретных фрагментов большой молекулярной массы при гидролизе суперкольцевых фаговых ДНК.
ДНКаза из семенников обезъяны /33/ при действии на ДНК из млекопитающих, имеющие какие-либо повторяющиеся элементы в структуре, образует дискретные фрагменты, не являющиеся конечными продуктами; со временем происходит их дальнейшая деградация с образованием гетерогенных фрагментов длиной около 120 нуклеотидных пар.
ДНКазы, индуцируемые вирусами /56, 58/, ДНКазы из ооцитов лягушки /147/,яйцеклеток вьюна /50, 51/ и меланомы клеток мыши /37/ в определённых условиях вызывают одноцепочечный разрыв в суперкольцевой фаговой ДНК и превращают её в кольцевую и линейную формы, без дальнейшей деградации субстрата. При оптимальных условиях гидролиза специфичность к местам разрывов у ДНКаз исчезает, скорость расщепления ДНК резко увеличивается, в результате чего образуются высокомолекулярные гетерогенные фрагменты.
class3 ВЫДЕЛЕНИЕ И НЕКОТОРЫЕ ШЗИКО-ХИШЧЕСКИЕ СВОЙСТВА
Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ ДНКАЗЫ class3
Выделение Ca,Mg -зависимой ДНКазы
Определение молекулярной массы фермента. Молекулярную массу Ca,Mg -зависимой ДНКазы определяли на основании результатов поведения белка при гель-фильтрации на сефадексе G -100 (рис. 6). Вычисленная на основании относительного положения белков маркеров молекулярная масса фермента составляет 45000 Д. При электрофорезе фермента в денатурирующих условиях в присутствии ДЦС также проявляется единственная полоса белка. Молекулярную массу ДНКазы (44000 Д) определили сравнением положения белков маркеров с положением фермента. Проявление Ca,Mg -зависимой ДНКазы при электрофорезе в виде одной белковой полосы и практически одинаковые величины молекулярной массы в нативных условиях гельфиль-трации и денатурирующих условиях электрофореза указывают, что фермент из одной полипептидной цепи.
Таким образом показано, что Ca,Mg-зависимая ДНКаза состоит из одной полипептидной цепи, имеет молекулярную массу 45000 Д, изоточку равную 4,4 подобно другим металлозависимым ДНКазам эукариот , в частности, ДНКазам I, выделенным из различных источников
Температурный оптимум и термостабильность фермента. Исследование влияния температуры на активность фермента проводили в стандартной инкубационной смеси. Ca,Mg -зависимая ДНКаза полностью сохраняет активность при повышении температуры до 40 в течение часа. Прогревание при 50 I час снижает активность фермента на 40$, а прогревание при 60 приводит к полной потере активности .
Исследование специфичности ca,mg -зависимой днказы к первичной и вторичной структурам субстрата
Одной из основных характеристик, определяющих специфичность металлозависимых ДНКаз, является способность с разной скоростью гидролизовать нативную и денатурированную ДНК. Показано также, что от природы активирующего катиона зависит не только эффективность гидролиза субстрата ферментом, но и специфичность в узнавании нуклеотидной последовательности ДНК /36, 56, 58, 112/.
Поэтому, для выяснения специфичности Ca9Mg -зависимой ДНКазы исследовали её действие на нативную и денатурированную ДНК, одноцепочечные и двухцепочечные ДНК фагов, синтетические поли- и олигонуклеотиды различного состава и последовательности. Также исследовали влияние природы двухвалентных катионов на состав продуктов гидролиза.
Анализируя скорости накопления кислоторастворимых продуктов при действии фермента на нативную и денатурированную ДНК из лосося в присутствии ионов Са2+ и Mg2+ обнаружили, что на-тивная ДНК гидролизуется в 1,3 раза быстрее, чем денатурированная (рис. 12). Более однозначная информация о специфичности Са, Mg -зависимой ДНКазы к вторичной структуре субстрата получена при исследовании деградации двухцепочечной ДНК фага Т7 и одно-цепочечной кольцевой ДНК фага MI3.
На начальных стадиях деполимеризации ДНК фага Т7 в присутствии ионов Са и Mg появляются олигонуклеотиды и полинук-леотиды разной длины (рис. I3A). Продукты исчерпывающего гидролиза состоят, в основном, из фрагментов величиной от моно- до 15-20 нуклеотидов (которые являются кислоторастворимыми продуктами) и небольшого количества полинуклеотидов (рис. ІЗБ).
class4 ИССЛЕДОВАНИЕ СПЕЦИФИЧНОСТИ Ca,Mg -ЗАВИСИМОЙ
ДНКАЗЫ К ЛОКАЛЬНЫМ ВАРИАЦИЯМ ВТОРИЧНОЙ СТРУКТУРЫ
СУБСТРАТА class4
Действие Ca,Mg -зависимой ДНКазы на двухцепо-чечные полидезоксирибонуклеотиды
Для выяснения вопроса о влиянии особенностей конфирмации сахарофосфатного остова на активность Са,1%-зависимой ДНКазы, исследовали скорости гидролиза природных и синтетических двухцепо-чечных субстратов с разным нуклеотидным составом и последовательностью .
При исследовании кинетики гидролиза двух цепочечных полиде-зоксинуклеотидов Ca,Mg -зависимой ДНКазой проявились различия в скорости реакции и высоте плато, т.е. количестве связей в субстрате, доступных для фермента (рис. 20 А). Среди исследованных синтетических полидезоксинуклеотидов фермент снаибольшей скоростью гидролизует двухцепочечный чередующийся сополимер poly (dA-dT)«poly(dA-dT) . Двухцепочечный полимер poly(dA)« poly(dT) расщепляется ферментом со скоростью в два раза меньшей. Одноцепочечный полимер poly(dA,dT) расщепляется ферментом в несколько раз медленнее, чем соответствующий двухцепочечный полимер. С высокой эффективностью фермент расщепляет чередующийся сополимер другой группы пурин-пиримидиновых двух цепочечных комплексов poly(dG-dOpoly(dG-dC),
Для того, чтобы проанализировать частоту распределения 5-концевых нуклеотидов в продуктах гидролиза чередующихся сополимеров, олигонуклеотиды, после исчерпывающего гидролиза чередующихся сополимеров ферментом, дефосфорилировали, обрабатывая фосфата-зой E.coli , и гидролизовали избытком фосфодиэстеразы змеиного.
