Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 12
1.1. Полиненасыщенньте жирные кислоты: функции и свойства 12
1.2.1. Исследование жирнокислотного состава жира байкальской нерпы, 18
1.3. Сравнительный анализ жирнокислотного состава жира тюленей. 19
14 Сополимеризация жиров, содержащих ненасыщенные жирные кислоты . 23
1.5. Модифицированные олигоэфиры (алкиды). 26
1.6. Поверхностно-активные соединения. 30
1.6.1. Синтез полимерных суспензий с карбоксильными группами на поверхности частиц. 35
1.6.2. Полимерные суспензии для биологических исследований. Иммобилизация белков на поверхность полимерных частиц. 38
2. Обсуждение результатов 42
2.1, Исследование жира нерпы оз, Байкал, 42
2.1 Л. Исследование жирнокислотного состава жира нерпы и проведение сравнительного анализа с составом жиров морских тюленей. 46
2.1.2. Состав хлорорганических соединений в жире байкальской нерпы. 61
2.2. Исследование биологической активности жирных кислот жира байкальской нерпы . 66
2.2.1, Получение и исследование концентрата жирных кислот жира байкальской нерпы, обогащенного полиненасыщенными кислотами. 66
2.2.2. Биологическая активность липосом на основе концентрата полиненасыщенных жирных кислот жира байкальской нерпы. 67
2.3. Синтез и исследование сополимеров на основе жира и жирных кислот жира байкальской нерпы .78
2.4, Синтез и свойства эфиров полиэтиленгликолей и кислот жира байкальской нерпы. 90
2-5. Гетерофазная полимеризация стирола в присутствии жирных кислот, эфиров полиэтиленгликолей, сополимеров жира нерпы и жирных кислот жира с ММА ,98
2.6. Синтез и свойства олигоэфиров (алкидов) на основе жира байкальской нерпы. 105
Экспериментальная часть 111
3.1. Объекты исследования. 111
3.2. Материалы и методы. 111
3.2.1 Экстракция общих лвпидов. 111
3.2.2, Определение основных показателей состава и качества жира. 112
3.2.2. L Определение йодного числа жира по Кауфману 112
3.2.2.2. Определение перекисного числа. 113
3.2.2.3. Определение кислотного числа. 113
3.2.2.4. Определение числа омыления. 114
3.2.3. Анализ химического состава жира. 115
3.2.3.1. Приготовление сорбентов для тонкослойной хроматографии , 115
3.2.3.2. Приготовление пластинок для тонкослойной хроматографии. 116
3.2.3.3. Получение метиловых эфиров жирных кислот по методу Карро иДубак. 116
3.2.3.4. Получение метиловых эфиров жирных кислот с применением 2 н. хлористого водорода в метиловом спирте. 117
3.2.3.5. Очистка метиловых эфиров жирных кислот. 117
3.2.3.6. Разделение метиловых эфиров жирных кислот по степени ненасыщенности. 117
3.2.3.7. Анализ метиловых эфиров жирных кислот. 118
3.2.3.8. Исследование фракционного состава жира байкальской нерпы, 119
.2.4. Синтез соединений на основе жира байкальской нерпы. 120
3.2.4.1. Получение свободных жирных кислот. 120
3.2.4.2. Получение концентрата, обогащенного полиненасыщенными жирными кислотами. 121
3.2.4.3. Получение липосом. 122
3.2.4.4. Выделение и разделение ксантоновых соединений, 123
3.2.4.5. Определение содержания желчных кислот и холестерина в желчи. 123
3.2.4.6. Определение билирубина в желчи. 124
3.2.4.7. Сополимеризация метилметакрилата и жира байкальской нерпы. 124
3.2.4.8, Синтез сополимеров метилметакрилата и жирных кислот жира байкальской нерпы . 125
3.2.4.9. Синтез поверхностно-активных соединений на основе полиэтиленгликолей и миристиновой кислоты. 126
3.2.4.10. Синтез поверхностно-активных соединений на основе полиэтиленгликолей и хлорангидридов кислот жира байкальской нерпы. 128
3.2.4.11. Синтез модифицированных олнгоэфиров (алкидов)и пленок на их основе. 129
3.2.4.12. Физико-химические методы исследования свойств полученных полимеров и
сополимеров. 134
3.2.4.13. Гетерофазная полимеризация стирола. 135
Выводы 139
Литература 141
- Сополимеризация жиров, содержащих ненасыщенные жирные кислоты
- Исследование биологической активности жирных кислот жира байкальской нерпы
- Приготовление сорбентов для тонкослойной хроматографии
- Синтез сополимеров метилметакрилата и жирных кислот жира байкальской нерпы
Введение к работе
Байкальская нерпа является замыкающим звеном в трофической цепи оз. Байкал, оказывает огромное влияние на функционирование экосистемы озера и служит индикатором не только рыбных запасов, но и биоценоза в целом, включая антропогенное воздействие. Важнейшими характеристиками физнолого-биохимической индикации состояния организмов и попу.тяций при различных условиях обитания являются липидные показатели, в том числе жирнокислотный состав, стражающис степень благополучия как отдельных особен, так и популяций в целом. Для исследования путей формирования и выявления основных параметров, влияющих на жирнокислотный состав гидробионтов, актуален поиск новых подходов к исследованию состава липидов гидробионтов и методам интерпретации полученных данных.
Устойчивая тенденция к более широкому применению в практическом здравоохранении лекарственных препаратов и биологически активных добавок к пище на основе натурального сырья привлекает внимание к жирам рыб и морских млекопитающих, содержащих биологически активные полипепасьгщепные жирные кислоты в том числе с 5 и 6 двойными связями, которых нет ни в животных жирах, ни в растительных маслах [1].
Жиры гидробионтов, как возобновляемые природные ресурсы, перспективны для производства новых защитных покрытий, смазок, уплотнителей, чернил, поверхностно-активных веществ [2].
На протяжении длительного времени ведется меховой промысел байкальской нерпы. Жир, составляющий половину массы туши, до сих пор практически не используется. Жир байкальской нериы содержит большое количество биологически активных полиненасыщенных кислот, в том числе эссенциальных. Поэтому работа, направленная на исследование жирно кислотного состава и поиски новых путей применения жира байкальской нерпы в фармакологии и различных областях химии, актуальна.
Цель работы: Исследование жира байкальской нерпы Phoca (Pusa) Sibirica Gmel и поиски новых путей его применения.
Для достижения цели были поставлены елсдуюшие задачи:
Исследовать жирнокислотный состав жира байкальской нерпы и голомянки - главной кормовой базы нерпы.
Выделить и исследовать концентрат жирных кислот жира байкальской нерпы, обогащенный полиненасыщенными жирными кислотами и разработать на его основе лекарственные препараты в липосомальной форме.
3* Найти пути практического применения жира байкальской нерпы: полечить и исследовать свойства сополимеров, поверхностно-активных соединений и алкидов на основе жира и жирных кислот жира нерпы. Научная новизна:
Исследование жиршкислотного состава жира байкальской нерпы послойно и проведение сравнительного анализа жирнокислотного состава жира байкальской нерпы и жира главной кормовой базы нерпы - голомянки, а также жирнокислотного состава жира близких морских родственников нерпы -кольчатого тюленя (Северное море) и различных морских рыб — кормовой базы кольчатого тюленя, с использованием оттогофакторного анализа принципиальных компонент - principle component analysis (PC-analysis), вьеявило систематические различия процентного содержания жирных кислот в исследованных объектах. Наиденые различия для разных слоев подкожного жира исследованных тюленей больше, чем различия жирнокислотного состава, выявленные для разных видов. Полученные данные раскрывают уникальный состав жирных кислот жира байкальских тюленя и голомяпки3 который отличается от жирнокислотного состава жира морских тюленей и морских рыб. Получен и исследован концентрат полииенасышенпых жирных кислот, выделенных из жира байкальской нерпы, который включает широкий спектр полиненасыщенных кислот, в том числе эссенциальных (ликолевая —
11,8+0,5%, линоленовая - 7,3±0,7%, арахидоновая - 6,2+0,6%, эйкозапентаеновая - 1431±1,%, докозагексаеновая--23,7±4,0%).
Получены сополимеры метил метакри лата и триаци л глицеринов ненасыщенных жирных кислот, а также свободных жирных кислот жира байкальской нерпы с использованием различных соотношений исходных мономеров, изучены их термические, термомеханические и поверхностно-активные свойства- В реакциях гетеро фазной полимеризации стирола с использованием в качестве ПАВ синтезированных сополимеров получены полисгирольные суспензии с узким распределением частиц по размерам, коэффициент полидисперсности у этих суспензий в основном не превышает значения 1,02.
Практическая ценность:
Липосомальные средства на основе концентрата полиненасыщенных жирных кислот, вы де ленного из жира байкальской нерпы, обладают иммуннобиологической и гспатозащитной активностью. Так, полученные препараты обладают иммунномоделирующим действием в отношении макрофагального и гуморального звеньев иммунного ответа на фоне введения в организм иммунодепресанта азатиоприна. Липосомы с включением природных ксаптонов повышают скорость секреции желчи, экскрецию холестерина и выделение билирубина, стимулируют синтез желчных кислот,
Полистирольные суспензии с узким распределением частиц, полученные в присутствии жира байкальской нерпы, смеси жирных кислот жира нерпы, а также синтезированных сополимеров (жнра и метилметакрилата, жирных кислот жира нерпы и метилметакрилатат диэфиров полизтиленггоіколей-600, -2000 и жирных кислот жира нерпы, моноэфиров метилполиэтиленгликолей-550, -1900 и жирных кислот жира нерпы) могут быть рекомендованы в качестве носителей биолигандов а иммунохишческих исследованиях.
Апробация работы: Результаты работы докладывались на научно-практической конференции "Проблемы охраны здоровья рыб в аквакультуре"
(Москва, 2000 г), Всероссийской научно-практической конференции и выставки с международным участием "Достижения науки и техники -развктию сибирских регионов" (Красноярск, 1999 г.), 1-ой и 2-ой международной конференции молодых ученых и студентов "Актуальные проблемы современной науки" (Самара, 2000, 2001 гг.), 1-ой и 2-ой школах-семинарах молодых ученых России "Проблемы устойчивого развития региона" {Улан-Удэ, 1999, 2001 тт.), всероссийской конференции с международным участием "Современные проблемы химии высокомолекулярных соединений: высокоэффективные и экологически безопасные процессы синтеза природных и синтетических полимеров и материалов на их основе" (Улан-Удэ, 2002 гг.), втором международном симпозиуме "Экологически эквивалентные и экзотические виды гидробиоптов в великих и больших озерах мира" (Улан-Удэ, 2002 гг.).
Об актуальности работы сэидетельствует поддержка данных исследований грантами:
"Проведение экспедиционных исследований эндемиков оз. Байкал как биоиндикаторов его экосистемы" (Федеральная целевая программа "Интеграция", 2001 г.).
"Научные исследования высшей школы по приоритетным направлениям науки и техники" (Федеральная научно-техническая программа, подпрограмма "Химия и химические продукты", код проекта 203,02.06.012).
"Разработка рекомендаций по использованию нетрадиционных индикаторов в практике государственного экологического контроля и мониторинга окружающей среды на основе анализа влияния загрязнений озера Байкал тга состояние особо пенных биологических компонентов экосистем11 (ФЦП "Экология и природные ресурсы России", подпрограмма "Охрана озера Байкал и Байкальской природной территории", 2002 г.).
"Направленный поиск биологически активных соединений и разработка научных основ создания лекарственных препаратов" (Междисциплинарный интеграционный проект СО РАН, 2000 -2002 гг.).
"Проведение экспедиционных исследований эндемиков оз. Байкал" (Международный экспедиционный проект СО РАН, 2002 г.),
"Государственная поддержка интеграции высшего образования и фундаментальной науки " (ФЦП "Интеграция", "Использование потенциала ведущих научных центров страны для стажировки молодых исследователей, аспирантов и докторантов высших учебных заведений1', 2001,2003 гг.),
"Поддержка совместных программ и проектов, а также научных и образовательных организаций по разработке и производству наукоемкой продукции» формированию совместных инновационных структур" (ФЦП "Интеїрации", направление 1.3,2002,2003 гг.).
Сополимеризация жиров, содержащих ненасыщенные жирные кислоты
Жир байкальской нерпы, как типичный представитель "морского" жира имеет триглицеридную структуру с высокой степенью ненасыщенности кислотных цепей. Эта высокая ненасыщенность обуславливает внимание к жирам гидробионтов как потенциальному сырью для полимеризации и сополимеризации. Продукты реакции термической полимеризации жиров представляют собой ди- и тримеры триацилглицеринов, однако структура их сильно отличается от олигомеров, полученных при оксидировании масел. Основное отличие состоит в том, что в олигомерах, являющихся продуктами термической полимеризации масел, молекулы триацилглицеринов связаны между собой главным образом связями -С-С-, а не кислородсодержащими мостиками [58]. В процессе термической полимеризации вначале происходит изомеризация изолированных двойных связей в сопряженные (по обычной схеме под действием свободных радикалов). Эти радикалы могут образоваться за счет введения инициаторов радикального типа, при участии следов молекулярного кислорода или (что более вероятно в условиях жесткого температурного режима) за счет гомолитического расщепления С-Н- связей а-метиленовых групп. Образовавшиеся сопряженные двойные связи вступают в реакцию диенового синтеза Дильса-Альдера с оставшимися изолированными двойными связями других молекул триглицеридов, в результате чего получаются ди- и тримеры, содержащие шестичленные циклы. Циклизация протекает как 1,4-присоединение [59]. Схему этого процесса можно представить следующим образом. Изомеризация: R- сн=сн- сн2— CH=CHR! R- сн2— СН= СН-СН=CHR При сополимеризации масел с сопряженными двойными связями димеры образуются по реакции диенового синтеза с участием двух систем сопряженных связей, причем присоединение одной из них идет в 1,2 положение, а другой - в 1,4-положение. Необходимо отметить и другой путь, приводящий к димерам при термической полимеризации - рекомбинация алкильных радикалов, образующихся при отщеплении водорода от а-метиленовых групп. Схема процесса может быть представлена следующим образом:
Таким образом, химической основой высокотемпературной обработки масел в отсутствие кислорода (термической полимеризации масел) являются реакции диенового синтеза, изомеризации двойных связей и свободнорадикальные реакции присоединения и рекомбинации, которые в основном приводят к образованию димеров. Образование димеров и изомеризация двойных связей при термической обработке имеют существенное значение для последующего пленкообразования масел. Известно использование "морских" жиров, в частности жиров рыб, в качестве мономеров при сополимеризации с малеиновым ангидридом при производстве соответствующих малеатов для промышленного использования в качестве высыхающих масел, жаростойких лаков и пластификаторов [60].Гомополимеризацию жиров рыб проводят при 300С в запаянных ампулах в инертной атмосфере или вакууме. Образующиеся в результате гомополимеризации вязкие масла применяются в консервной промышленности, при производстве лаков и детергентов [61]. Полимеры, полученные при катионной сополимеризации рыбьего жира с дивинилбензолом, норборнодиеном и дициклопентадиеном, имеют широкий спектр применения: от резин до твердых пластиков. Синтез таких сополимеров проводился в присутствии инициатора катионной полимеризации (BF3-OEt2) в две стадии: при 24С и 110С в инертной атмосфере с последующей экстракцией метиленхлоридом.
Результаты анализов (ЯМР, ДСК, ТМА, ТГА) позволяют охарактеризовать полученные соединения как типичные термостойкие полимеры с плотно сшитой структурой. Плотность таких полимерных материалов составляет около 1000 кг/м3, температура стеклования 50-150С. Термостабильность этих материалов зависит от количества не прореагировавшего жира в полимере. Эти термостойкие полимеры могут представлять альтернативу полимерам на нефтяной основе в качестве структурных материалов и добавок для материалов, подвергающихся стрессовым нагрузкам [61, 62]. Таким образом, способность жиров гидробионтов к образованию полимеров и сополимеров открывает широкие перспективы их использования в химической технологии. Наиболее распространенным типом пленкообразующих веществ, применяемых в лакокрасочной промышленности, являются модифицированные олигоэфиры. Это обусловлено сочетанием комплекса ценных свойств покрытий на основе этих олигомеров с наличием обширной и разнообразной сырьевой базы для их получения. При производстве модифицированных олигоэфиров наиболее полно реализуются условия широкого и направленного варьирования свойств лакокрасочных материалов. На основе модифицированных олигоэфиров получают эластичные атмосферостойкие покрытия с высокой механической стойкостью, способные в большинстве случаев отверждаться на воздухе. Благодаря хорошим технологическим свойствам и высокому качеству покрытий эти материалы составляют значительную долю всей синтетической лакокрасочной продукции [63, 64]. Алкиды представляют собой олигомеры сложной разнозвенной структуры с Мп от 1200 до 3000-5000. Они имеют исключительно широкое молекулярно-массовое распределение: степень полидисперсности может достигать даже 100. Такие структурные характеристики алкидов обусловлены специфическими условиями их синтеза, представляющего собой систему большого числа последовательно-параллельных равновесных реакций, осложненных целым рядом побочных процессов, и в первую очередь -реакциями межцепного обмена, причем доля большинства побочных синтезов возрастает с увеличением температуры синтеза. В то же время процесс синтеза алкидов подчиняется всем основным закономерностям, характерным для реакции поликонденсации.
Так, средняя величина молекулярной массы алкида определяется соотношением и характером исходных веществ (рецептура алкида), которые в конечном счете определяют среднюю функциональность системы, а также степенью завершения реакции [65]. Наиболее часто при синтезе алкидов используют глицерин или пентаэритрит в сочетании с фталевым ангидридом - глифтали или пентафтали. Модификация достигается в основном за счет использования кислотных модификаторов, представляющих собой различные монокарбоновые кислоты и их производные: растительные масла (или их жирные кислоты), синтетические жирные кислоты с линейной или разветвленной цепью, канифоль, ароматические монокарбоновые кислоты, талловое масло. Основными из приведенных модификаторов являются растительные масла, которые вводятся в состав алкидов в количестве от 30 до 70 % масс. Применение других модификаторов вызвано прежде всего стремлением к экономии масел [66]. Различная химическая природа модификаторов (свободные монокарбоновые кислоты, растительные масла или их смеси) определяет выбор метода синтеза алкидного олигомера [67]. В настоящее время основными известными методами синтеза алкидов являются глицеридный, жирнокислотный и комбинированный. При получении алкидов, модифицированных маслами, используется глицеридный метод. По этому методу процесс проводится в две стадии. Первая стадия - алкоголиз растительных масел (переэтерификация), в результате которого образуются неполные эфиры полиатомных спиртов.
Исследование биологической активности жирных кислот жира байкальской нерпы
Как было рассмотрено выше, в составе жира байкальской нерпы 25-35 % составляют полиненасыщенные жирные кислоты, высокая биологическая активность которых обуславливает перспективность получения концентратов с повышенным содержанием полиненасыщенных жирных кислот. Нами был получен концентрат жирных кислот жира байкальской нерпы обогащенный полиненасыщенными жирными кислотами методом комплексообразования свободных жирных кислот, выделенных из жира нерпы с мочевиной [117,118]. Для определения качества концентрата жира байкальской нерпы определяли йодное и перекисное числа. Результаты исследования представлены в таблице 2.6. Низкие значения перекисных чисел свидетельствуют о хорошем качестве жира и концентрата полиненасыщенных жирных кислот, высокие значения йодных чисел - о высокой ненасыщенности исследованных объектов. Исследование жирнокислотного состава концентрата полиненасыщенных жирных кислот методом газохроматомасс-спектрометрии выявило большое разнообразие ненасыщенных жирных кислот в концентрате (табл, 2,7). Таким образом, повышенное содержание полиненасыщенных жирных кислот, в том числе эссенциальных, в концентрате позволяет предположить высокую биологическую активность полученного продукта. полиненасыщенных жирных кислот жира байкальской нерпы. Ценность липосом основана на их способности взаимодействовать с клетками, перенося содержимое тем или иным способом через барьер плазматической мембраны клетки в цитоплазму или даже в лизосомы [119, 120].
Липосомы широко применяются в клеточной биологии для изучения ряда механизмов межклеточных взаимодействий; фармакологии - для обычного и направленного транспорта лекарственных соединений в организме. Липосомы используются для транспорта лекарств в область мишени, что признано перспективным методом улучшения селективности действия лекарственных препаратов. Способность липосом включать в себя самые разные вещества практически без каких-либо ограничений в отношении их химической природы, свойств и размера молекул дает поистине уникальные возможности для решения некоторых медицинских проблем [121, 122]. Для повышения эффективности лекарственных средств желчегонного и гепатопротекторного действия на основе ксантонов перспективно использование их в липосомальной форме, что снизит токсичность и улучшит селективность действия препаратов. Введение в липосомы концентрата, содержащего большое количество полиненасыщенных жирных кислот позволит увеличить биологическую активность указанных препаратов. Известна желчегонная активность ксантонов, выделенных из горечавника бородатого и галении рогатой [123]: Липосомы получали по стандартной методике из фосфолипидов яичного желтка с включением концентрата жирных кислот жира байкальской нерпы в соотношении 2:3. Мангиферин и ксантоновый агликон вводили в липосомы в терапевтической дозе, которая составляет 5 мг/кг. В эксперименте участвовало 4 группы животных: 1. Контрольная группа; 2.
Липосомальная группа (Лип); 3. Липосомы + ксантоновый агликон (ЛипА); 4- Липосомы + ксантоновый гликозид (ЛипГ); Препарат вводили энтерально и парэнтерально с целью выяснения наиболее оптимального введения. Сравнительная оценка желчегонной активности средств была проведена по общепринятой методике Н.П. Скакуна и А.Н. Олейника [124]. Животные находились на протяжении 5 часов под наркозом при комнатной температуре. Желчь собирали с помощью специальной канюли, вставленной в общий желчный проток, через каждый час. О степени желчегонной активности исследуемых средств судили по скорости секреции желчи, общему ее объему, а так же по количеству выделенных в каждой часовой порции желчи холестерина, билирубина и желчных кислот. Результаты исследования приведены в таблицах 2.8-2Л1. При энтеральном введении липосом белым крысам скорость секреции желчи повышается на 12% (табл. 2.8). На этом фоне в желчи крыс ускоряется экскреция билирубина в 2 раза и холестерина на 18%. Кроме того, липосомы стимулируют синтез и выделение общих желчных кислот. Концентрация холатов в желчи животных возрастает на 37%. Внутрибрюшинное введение липосом сопровождается достоверным возрастанием скорости секреции желчи через 1, 2» 3, 4 часа соответственно на 58%, 29%, 25% и 14% (табл. 2.8).
Одновременно общее количество выделенной желчи увеличивалось на 32% по сравнению с контролем. На этом фоне в желчи крыс уровень общих холатов возрастает в 2 раза. Отмечается тенденция к повышению билирубиновыделения с желчью животных. При внутривенном введении животным липосом скорость секреции желчи возрастает через 1 час на 22%, через 2 часа - на 35%, через 3 часа - на 34%, через 4 часа - на 14% по сравнению с контролем (табл. 2.8). Одновременно увеличивается общее количество выделенной желчи на 26%. Внутривенное введение животным липосом сопровождается и изменением биохимического состава желчи. Так, в желчи повышается концентрация желчных кислот в 1,5 раза, возрастает билирубиновыделение на 13% и экскреция холестерина - в 2 раза по сравнению с контролем. При энтеральном введении липосом с включением ксантонового гликозида белым крысам скорость секреции желчи через 1 час возрастает на 28% (табл. 2.9). При этом холеретическая реакция у крыс сохраняется в течение всего эксперимента. Так, скорость секреции желчи через 2-4 часа возрастает на 13%-16% с одновременным увеличением общего количества выделенной желчи на 18%. На этом фоне в желчи крыс повышается уровень общих холатов на 11%, а также ускорялось выделение холестерина в 3 раза и экскреции билирубина в 2 раза. При внутрибрюшинном введении крысам липосом+гликозид скорость секреции животных возрастала через 1, 2, 3, 4 часа на 66%, 42%, 27% и 23% соответственно (Табл. 2.10). Одновременно увеличивалось общее количество выделенной желчи на 41%. Концентрация общих холатов в желчи возрастала на 82%, экскреция билирубина ускорялась на 40%, холестерина — на 25%. Липосомы+гликозид при внутривенном введении повышали скорость секреции желчи через 1, 2, 3, 4 часа соответственно на 34%, 46%, 23% и 9% (табл. 2.11). Общее количество выделенной желчи увеличилось на 29%. При этом, в желчи крыс повышался уровень общих холатов на 92%, билирубина - в 1,5 раза и холестерина - на 25%. Липосомы с включеним ксантонового агликона при энтеральном пути введения увеличивают скорость секреции желчи через час после его введения на 28% с одновременным повышением общего количества выделенной желчи
Приготовление сорбентов для тонкослойной хроматографии
Сорбент для ТСХ и колоночной хроматографии был приготовлен, как описано у Светашева и Васьковского [129]. Исходный силикагель КСК на шаровой мельнице перемололи, затем суспендировали в воде из расчета 1 л дистиллированной воды на 50 г силикагеля. Суспензию тщательно перемешали и выдерживали 10 мин. Надосадочную суспензию сливали в другой стакан и снова отстаивали в течение 2 ч. Полученный осадок отделяли от надосадочной суспензии. Полученная фракция использовалась для ТСХ (размеры частиц 2-7 мкм). Далее, к данной фракции добавляли равный объём 5%-ного раствора кремниевой кислоты. Эта суспензию хранили не менее 1-2 месяцев и использовали при приготовлении пластинок для ТСХ. Стеклянные пластинки (6x6 см) тщательно отмывали с детергентом, омывали водой и помещали на 10 мин в нагретый 1 н раствор NaOH для обезжиривания. После этого пластинки вновь мыли водой и сушили. Перед нанесением на пластинки силикагель тщательно взмучивали и 10 мл суспензии переносили в 50 мл стакан. При постоянном перемешивании на магнитной мешалке на одну пластинку (6x6 см) наносили 1 мл суспензии, равномерно распределяли суспензию по всей поверхности пластинки. Пластинки со слоем сорбента сушили и перед использованием, в случае необходимости, активировали в сушильном шкафу при 100 С 10 мин [125]. Дубак [130]. К аликвоте общих липидов в бензоле (25-50 мг в 0.5 мл) добавляли 0.5 мл 1%-ного раствора метилата натрия. Омыление проводили 30 мин. при 60 С. Затем к этой смеси добавляли 0.5 мл 5%-ного раствора НС1 в метаноле и выдерживали на водяной бане 30 мин при температуре 60 С. К реакционной смеси добавляли 2 мл дистиллированной воды и 2 мл гексана. Верхний слой гексана отделяли и процедуру экстракции повторяли троекратно.
Фракции гексана объединяли, упаривали и перерастворяли в минимальном объеме гексана. К аликвоте общих липидов (0.5-1.0 мг.) добавляли 1 мл раствора 2 н хлористого водорода в метиловом спирте. Омыление проводили 2 ч. При температуре 90 С. Полученный раствор упаривали током аргона. К реакционной смеси добавляли 0,5 мл дистиллированной воды и 1 мл гексана. Верхний слой гексана отделяли и процедуру экстракции повторяли троекратно. Фракции гексана объединяли, упаривали и перерастворяли в минимальном объеме гексана. МЭЖК были очищены микро-ТСХ, используя в качестве растворителя бензол (Rf - 0.65-0.7)] [133]. Зону, содержащую МЭЖК, снимали с пластинки шпателем и на микроколонке элюировали хлороформом. Хлороформ упаривали, пробу перерастворяли в гексане. Очистку некоторых проб МЭЖК проводили методом твердофазной экстракции на микроколонках Supelclean LC-18 (объем 1 мл). МЭЖК, растворенные в гексане, наносили на микроколонку Supelclean LC-18. После впитывания пробы в слой сорбента элюирование проводили гексаном (4 объема микроколонки). Регенерацию микроколонки проводили следующим образом: МеОН - 1 мл, затем СНСЬ — 1 мл, дистиллированная вода — 1 мл. По степени ненасыщенности МЭЖК разделяли на силикагеле, импрегнированном азотнокислым серебром (AgNCb). г 1. Приготовление силикагеля, импрегнированного AgNC 3. Азотнокислое серебро растворяли в воде до насыщения и помещали на магнитную мешалку, добавляли 1 мл водного раствора и 9 мл метанола. После смешивания двух растворов добавляли силикагель для колоночной хроматографии (Silica Woelm 100-200 цт) по весу к азотнокислому серебру из расчета 9:1. Смесь перемешивали на магнитной мешалке 20 мин, далее упаривали на водяной бане при температуре 90С. После того, как силикагель становился сыпучим, его активировали в сушильном шкафу 20 мин при температуре 90С. 2. Для насыщения слоя силикагеля микро-ТСХ пластинку с нанесенным сорбентом помещали в насыщенный раствор азотнокислого серебра в метаноле. Процедуру повторяли 2 раза для более полного насыщения слоя сорбента азотнокислым серебром. Пластинку высушивали и активировали. МЭЖК в гексане наносили на пластинку полоской 3—4 см.
Рядом на той же пластинке наносили точкой стандартную смесь МЭЖК с известным составом, например, МЭЖК растительного масла и хроматографировали в системах, приведенных у Кейтса [133, 134] или бензолом. Обнаружение проводили опрыскиванием края пластинки после хроматографии 5%-ным раствором серной кислоты в метаноле, с последующим нагреванием до 120С. МЭЖК проявлялись в виде темных полос или пятен. Зоны, соответствующие зонам стандартов, снимали с пластинки, элюировали хлороформом, упаривали и переводили в гексан для последующего анализа на ГЖХ.
Синтез сополимеров метилметакрилата и жирных кислот жира байкальской нерпы
Сополимеризацию ММА и жирных кислот жира байкальской нерпы проводили в соотношениях 1:10, 1:5,1:3. Исходные реагенты: ММА, жирные кислоты, ДАК — 1.5 % от общей массы реакционной смеси. Синтез проводили в запаянной ампуле, в среде аргона, при нагревании в две стадии: Полученный продукт экстрагировали гексаном в аппарате Сокслета 6 часов, после чего продукт сушили в вакуумном шкафу при температуре 60С. Молекулярные сита (МС) марки ЗА0 производства Франции и ГДР прокаливали в вакууме при 1,6 гПа в течение 5 — 6 часов при температуре 200С. После этого МС выдерживали в вакууме до их полного остывания и заполняли аргоном сосуд с МС, После прокаливания вес МС уменьшался на 15 - 17 % от первоначального за счёт удаления сорбционной воды. До использования сита хранили в герметически закрытой ёмкости при комнатной температуре. Триэтиламин очищали по следующей методике: к 100 см3 третичного амина добавляли 2 см хлористого бензоила, реакционную смесь энергично встряхивали в течение 20 минут, выпавший осадок отфильтровывали, фильтрат кипятили в течение 2 часов, вновь отфильтровывали осадок и фильтрат перегоняли. Затем триэтиламин кипятили в токе аргона над NaH в течение 8 часов и перегоняли над новой порцией NaH (Ткип.= 89С) [143]. Тионилхлорид дважды перегоняли в вакууме при 30С, после чего характеристики тионилхлорида соответствовали литературным данным [144]. Дихлорэтан промывали 8% раствором NaOH, затем многократно промывали водой до нейтральной реакции, высушивали 20 часов над Р2О5 и перегоняли со свежей порцией Р2О5, отбирая фракцию при 83 - 84С. После осушки над молекулярными ситами ЗА0 содержание воды составило 0,001% [146].
Полиэтиленгликоль: после осушки над молекулярными ситами содержание воды составило 0,01%. Синтез миристинового хлорангидрида проводили при температуре кипения хлористого тионила (76С) в течение 3 ч. Для более полного протекания реакции брали избыток хлористого тионила, необходимого для растворения навески миристиновой кислоты. Далее из полученной смеси отгоняли избыток хлористого тионила. Полученный хлорангидрид перегоняли в вакууме (1 мм. рт. ст.) при температуре 117С в атмосфере аргона, Синтез проводился с использованием полиэтиленгликолей с молекулярными массами 600 и 2000. Мольное соотношение исходных реагентов: (полиэтиленгликоль : хлорангидрид миристиновой кислоты : триэтиламин): (1:2:2,1). Синтез проводили по следующей методике: к полиэтиленгликолю приливали растворитель дихлорэтан, а затем, при энергичном перемешивании, добавляли триэтиламин и хлорангидрид миристиновой кислоты. Реакцию вели в течение Зч. в токе аргона. После прохождения реакции полученную смесь отфильтровывали от выпавшего в осадок солянокислого ТЭА и затем упаривали при комнатной температуре в течение суток и в вакуумном шкафу при Т=40 С. Синтез проводился с использованием монометиловых эфиров полиэтиленгликолей с молекулярными массами 550 и 1900. Мольное соотношение исходных реагентов: (полиэтиленгликоль : хлорангидрид миристиновой кислоты : триэтиламин): (1:1:1,1).
Синтез проводили по следующей методике: к полиэтиленгликолю приливали растворитель дихлорэтан, а затем, при энергичном перемешивании, добавляли триэтиламин и хлорангидрид миристиновой кислоты. Реакцию вели в течение 3 ч. в токе аргона. После прохождения реакции смесь отфильтровывали от выпавшего в осадок солянокислого ТЭА и затем упаривали при комнатной температуре в течение суток и в вакуумном шкафу при Т=40 С. Синтез хлорангидридов кислот жира байкальской нерпы проводили при температуре 76 С в течение 3 ч. Для более полного протекания реакции брали избыток хлористого тионила, необходимого для растворения навески миристиновой кислоты. Далее из полученной смеси отгоняли избыток хлористого тионила. К полученным хлорангидрам жирных кислот приливали дихлорэтан. Затем при энергичном перемешивании добавляли полиэтиленгликоль и триэтиламин. Мольное соотношение исходных реагентов такое же, как и при синтезе ди- и моноэфиров полиэтиленгликолей и хлорангидрида миристиновой кислоты. Реакцию вели в течение 3 ч. в токе аргона. После прохождения реакции реакционную смесь отфильтровывали от выпавшего в осадок солянокислого ТЭА, и затем упаривали при комнатной температуре в течение суток. Водный раствор ПАВ (20 %-ный) поместили в делительную воронку, нагрели выше точки помутнения, дали отстояться до разделения фаз и удалили водную фазу. Оставшуюся жидкость, обогащенную ПАВ, снова растворили в воде и этот процесс повторяли несколько раз [59]. В четырёхгорлую колбу загрузили катализатор, ПЭТ, подсолнечное масло, жир нерпы. Нагрев до 200С проводили в две стадии : быстрый нагрев до 180С и медленный нагрев от 180С до 200С (нагрев со скоростью 1С в минуту). Контроль реакции проводили по изменению сопротивления (табл. ЗЛ).
