Содержание к диссертации
Введение
1. Эффекторы системы комплемента 7
1.1. Введение. Роль системы комплемента в организме человека 7
1.2. Пути активации системы комплемента 11
1.2.1. Альтернативный путь активации системы комплемента 11
1.2.1.1. Белок СЗ 12
1.2.1.2. Инициирующая СЗ-копвертаза 12
1.2.1.3. Связанная СЗ/С5-коивертаза 13
1.2.1.4. Узнавание и усиление ответа 14
1.2.2. Классический путь активации системы комплемента 15
1.2.2.1. С1. Структура, активация и регуляция 15
1.2.2.2. Образование, структура и регуляция СЗ/С5-конвертазы 17
1.2.3. Пентаксиновый путь активации системы комплемента 18
1.2.4. Пектиновый путь активации системы комплемента 18
1.2.5. Терминальный этап. Мембрано-атакующий комплекс 19
1.2.5.1. С5Ь-7 19
1.2.5.2. С5Ь-8 19
1.2.5.3. С5Ь-9 20
1.2.5.4. ГЇОЛИ-С9 20
1.2.5.5. Регуляция образования МАК 21
1.3. Ингибиторы классического пути 21
1.3.1. Полипептиды 21
1.3.2. Компстатин 23
1.3.3. Полиионы 24
1.3.4. Бензамидины, гуанидины и сульфонилфториды 28
1.3.5. Антранилаты 32
1.3.6. Производные левопимаровой кислоты 33
1.3.7. Фенотиазины 33
1.3.8. Фенилиндандионы 34
1.3.9. Аминокислоты и их производные 35
1.3.10. Диамины.. 38
1.3.11. Производные олеановой кислоты 38
1.3.12. Другие органические соединения различной структуры 39
1.3.13. Неорганические соединения.. 44
1.4. Стимуляторы природного С1-ингибитора 44
1.5. Соединения, которые индуцируют выработку С1-ингибитора 44
1.6. Ингибиторы альтернативного пути 45
1.6.1. Полипептиды 45
1.6.2. Полиионы 46
1.6.3. Аминокислоты и их производные 47
1.6.4. Амидины и гуанидины 47
1.6.5. Другие органические соединения различной структуры 48
1.7. Заключение 50
2. Обсуждение результатов 53
2.1. Синтез производных бисфенола А с различными анионными группами 54
2.2. Синтез дисульфатов бисфеполов, ароматических спиртов и бетулина 56
2.3. Конденсация сс-нафтола с карбонильными соединениями 57
2.4. Получение дисульфатов opmo-замещепных производных бисфенола А 58
2.5. Получение 2-замещенных малоповых кислот 61
2.6. Антигемолитическая активность полученных соединений 62
2.7. Количественная взаимосвязь «структура-активность» (QSAR) 67
2.8. Синтез амфифильного дисульфата бисфенола и изучение его антигемолитической активности в составе липосомных дисперсий 70
2.8.1. Синтез амфифильного дисульфата бисфенола 71
2.8.2. Влияние амфифильного дисульфата бисфенола (34) в составе липосом на гемолитическую систему 73
2.8.3. Зависимость антигемолитической активности липосом с дисульфатом 1,1-ди(4'-гидроксифенил)гексадекана (34) от его доли в бислое 73
2.8.4. Оценка расстояния между парами заряженных групп в липосомах с дисульфатом 1,1-Ди(4'-гидроксифенил)гексадекана(34) в бислое 75
2.9. Оценка влияния синтезированных соединений па систему комплемента 76
3. Экспериментальная часть 80
3.1. Реактивы, растворители, приборы 80
3.2. О-Карбоксиметилбисфенол А (3) и ди-О-карбоксиметилбисфепол А (2) 81
3.3. 2,2-Бис(4'-фосфонооксифенил)пропан (5) 81
3.4. 2,2-Бис(4'-гидрокси-3'-хлорфенил)пропаи (11а) 82
3.5.2,2-Бис(4'-гидрокси-3'-йодфенил)пропан(13а) 82
3.6. 2,2-Бис(3'-аллил-4'-гидроксифенил)пропан (31а) 82
3.7. 2,2-Бис(4'-гидрокси-3'-проііилфепил)пропан (30а) 83
3.8. Трет-бутилировапие бисфенола А 83
3.9 Ацилирование бисфенола А 84
3.9.1. Ди-О-ацетил бисфенол А 84
3.9.2. Перегруппировка ди-О-ацетил бисфенола А в условиях реакции Фриса 84
3.10. Конденсация а-нафтола с ацетоном 85
3.11. Конденсация а-нафтола с пропаналем 85
3.12. 1,1-Ди(4'-гидроксифенил)гексадекаи (34а) 86
3.13. Синтез дисульфатов бисфенолов (7-34), ароматических спиртов (50-52), бстулииа (53), сульфата О-карбоксиметилбисфенола А (4) 86
3.14. 2-Феиилмалоновая кислота (56) 89
3.15. 2-Бензилмалоновая кислота (55) 90
3.16. 2-Циклопентилмалоновая кислота (57) 91
3.17. Определение биологической активности 91
3.18. Определение функциональной активности компонентов Clr, Cls методом иммуноферментного анализа 92
3.19. Получение липосом из яФХ с дисульфатом 1,1-Ди(4'-гидроксифенил)гексадекана (34) в бислое 92
3.20. Определение влияния дисульфата 1,1-ди(4'-гидроксифенил)гексадекана (34) в составе липосом на гемолитическую систему '. 93
3.21. Определение ККМ дисульфата 151-ди(4'-гидроксифепил)гексадекана (34) 94
Выводы 95
- Пути активации системы комплемента
- Стимуляторы природного С1-ингибитора
- Синтез амфифильного дисульфата бисфенола и изучение его антигемолитической активности в составе липосомных дисперсий
- 2-Циклопентилмалоновая кислота (57)
Введение к работе
Система комплемента (СК) (набор более 30 белков плазмы крови), появившаяся 600 700 миллионов лет назад, является важнейшей частью иммунной системы. СК обеспечивает связь между врожденным и адаптивным иммунитетами, усиливая гуморальный ответ. Атака комплементом сенсибилизированных антителами клеток приводит к их лизису. При этом выделяются факторы воспаления (СЗа, С5а), которые индуцируют хемотаксис лейкоцитов к очагу воспаления, опсонизируют чужеродные бактерии, способствуя их фагоцитозу. Очищая организм от иммунных комплексов, СК поддерживает внутренний воспалительный гомеостаз. После уничтожения чужеродных тел фагоцитами активация комплемента прекращается. Однако широкий спектр иммунных, аутоиммунных и иммуподефицитных заболеваний, сопровождающихся поражением собственных тканей организма, связан с чрезмерной и/или несвоевременной активацией системы комплемента [1].
К группе острых состояний можно отнести респираторный дистрсссипдром взрослых, ишемические повреждения (инфаркт миокарда, скелетных мышц, легких), сепсис, ожогогсуго, раневую болезнь, астму, повторный (послеоперационный) стеноз сосудов, синдром множественной органной недостаточности, кровотечения, синдром Гийспа-Барре. В группу хронических состояний входят пароксизмальная ночная гемоглобинурия, гломерулонефрит, системная красная волчанка, ревматоидный артрит, болезнь Альцгеймера, отторжение органов при трансплантациях, миастения, рассеянный склероз. Часто активация СК, приводящая к г. осложнениям, возникает из-за неполной биосовместимости материалов в аппаратах для гемодиализа, искусственного сердца и др. Создание ингибиторов комплемента, способных предотвращать его деструктивное действие, - важная задача современной биоорганической химии.
Разрабатываются терапевтические препараты на основе природных и рекомбинантных форм естественных ингибиторов системы комплемента (C1-ING и sCRl) [2]. Привлекательность рекомбинантных белков как терапевтических агентов заключена в уже заложенных биологических свойствах. Однако высокая стоимость рекомбинантных белков и их возможная иммупогенность делают перспективными поиск и создание простых и дешевых низкомолекулярных ингибиторов СК. На сегодняшний день среди противоопухолевых, противовоспалительных, антифибринолитических агентов найдено много ингибиторов активации комплемента in vitro. Однако, одни из известных ингибиторов очень токсичны, другие малоактивны. В настоящеее время не существует препаратов одобренных FDA [3,4]. , Несколько лет назад было обнаружено, что заряженные полимеры и липосомы ингибируют СК, В нашей лаборатории было показано влияние плотности заряда на антигемолитическую активность. Упрощающей модификацией были сконструированы низкомолекулярные заряженные вещества с аналогичными свойствами, и выявлены важнейшие параметры, определяющие эффективность ингибировапмя комплемента: жесткий гидрофобный скелет с отрицательными зарядами на концах [5].
Данная работа посвящена поиску новых ингибиторов системы комплемента и исследованию структурных критериев взаимодействия СК с пизкомолекулярными соединениями для установления количественной взаимосвязи «структура - активность» на основе классического метода QSAR.
Пути активации системы комплемента
Альтернативный путь является гуморальным компонентом естественной защиты организма против инфекции, функционирующий без участия антител. Шесть белков альтернативного пути (СЗ, факторы В, D, Н, I и пропердин) обеспечивают инициацию, узнавание и усиление ответа, которые приводят к образованию связаной с активатором СЗ/С5-конвертазы [13]. Активаторами альтернативного пути являются некоторые полисахариды, клеточные стенки грибов и бактерий, различные вирусы, а также отдельные клетки млекопитающих и агрегированные иммуноглобулины [14]. До сих пор в точности не установлены общие структурные особенности активаторов, приводящие к их распознаванию, но ясно, что в этом процессе участвует СЗЬ [15]. В зависимости от микроокружения СЗЬ, связывающегося с активатором, зависит, будет ли он связываться с фактором В и активировать альтернативный путь, или с фактором Н, что прекращает дальнейшую реакцию [16]. Было показано, что шести упомянутых белков достаточно, чтобы проявлять вес описанные для альтернативного пути функции. Инкубирование активаторов со смесью этих белков в присутствии ионов Mg + приводило к связыванию активного СЗЬ с поверхностью частиц-активаторов [17]. Это не наблюдалось с человеческими эритроцитами, которые не являются активаторами альтернативного пути, Также наблюдалось быстрое растворение иммунных комплексов [18]. Добавление к этим шести белкам пяти канал-формирующих белков комплемента приводило к появлению цитолитической и бактерицидной активности альтернативного пути. Это было подтверждено лизисом эритроцитов кролика, уничтожением Раджи-клеток и грам-отрицательных бактерий [19]. 1.2.1.1. Белок СЗ Исходная молекула СЗ не имеет специфических активных центров для физиологических лигандов и поэтому не проявляет биологическую активность. Для проявления активных центров, скрытых внутри исходной молекулы, требуется протеолитическая активация и процессинг. При процессииге СЗ подвергается глубоким конформациопным изменениям [20]. Активация СЗ, осуществляемая СЗ-конвертазой, приводит к образованию фрагментов СЗа (9.1 кДа) и СЗЬ (180 кДа). СЗа обладает анафилатоксической активностью. СЗЬ, выполняющий распознавательные функции в альтернативном пути, является как субъединицей для СЗ/С5-конвертаз и лигандом для CR1, так и усиливает антителозависимый фагоцитоз. После протеолитического отщепления СЗа от СЗ открывается мембрапо-связывающий сайт в СЗЬ.
Он претерпевает быструю конформационную перегруппировку, которая делает доступной тиоэфирную связь в d-домене [21]. Ее карбонильная группа может после этого образовывать сложноэфирную связь или амидную связь. Таким образом, СЗЬ ковалентно связывается с атакуемой мишенью. Период полужизни активированного сайта в метастабилыюм СЗЬ составляет 60 мкс [22]. Не успевший прореагировать с мишенью СЗЬ взаимодействует с водой и остается в жидкой фазе в виде неактивной конформационно устойчивой молекулы. Как в мембраносвязаином, так и в жидкофазном состоянии СЗЬ сохраняет сайты связывания для факторов В и II, пропердина, С5 и CR1. 1.2,1.2. Инициирующая СЗчсонвсртаза Инициирование альтернативного пути может самопроизвольно протекать без участия ферментов или антител. Существует два возможных механизма активации альтернативного пути. По первому механизму инициация происходит вследствие спонтанного гидролиза внутримолекулярной тиоэфирной связи в СЗ. При этом СЗ претерпевает конформационные изменения, в результате чего он принимает СЗЬ-по-добную конформацию и проявляет СЗЬ-подобпые свойства [13, 14]. Гидролизоваипый СЗ, называемый СЗ(Н20), при Mg2+-зависимом связывании с фактором В образует проферментный комплекс. В результате действия фактора D происходит отщепление фрагмента Ва (30 кДа) от фактора В и образуется C3(H20)BbMg, являющийся инициирующей СЗ-конвертазой, находящейся в жидкой фазе [23]. По второму механизму тиоэфирная связь СЗ атакуется гидроксильпой группой какой-либо поверхности, что приводит к ковалентному связыванию с поверхностью СЗ, принявшего СЗЬ-подобную конформацию. 1.2.1.3. Связанная СЗ/С5-конвертаза Исходная СЗ-конвертаза продуцирует метастабильный СЗЬ и обеспечивает связывание СЗЬ с поверхностью окружающих частиц. Тиоэфирная связь в метастабильном СЗЬ в 1010 раз более реакционоспособна, чем в исходном СЗ, время полужизни которого составляет 231 ч при 37С. Активированная карбоксильная группа СЗЬ проявляет высокое сродство к гидроксильным и аминогруппам белков, углеводов и липидов, экспонированных на поверхности мембран [24], Профермент C3bB(Mg) является нековалентным трехкомпонентным комплексом, активируемым фактором D, СЗЬ служит субстратным модификатором, позволяющим фактору D расщепить фактор В, и акцептором для ВЬ. Активированная СЗ-конвертаза ковалентно связывается с поверхностью клетки-мишени через СЗЬ. Ее роль заключается в увеличении числа клеточно-связанных молекул СЗЬ в непосредственном окружении СЗ-конвертазы. Время полужизни C3bBb(Mg) составляет 90 с при физиологических значениях рН, температуры и ионной силы. По данным электронной микроскопии СЗ-конвертазы ВЬ состоит из двух доменов диаметром 4 нм каждый, один из которых принимает участие в связывании с СЗЬ, а другой предположительно является каталитическим доменом [25]. Замещение ионов Mg:+ на ионы Ni2+ при формировании фермента приводило к образованию в семь раз более устойчивого комплекса [26] с такой же ферментативной активностью. Это же явление наблюдалось и для инициирующей СЗ-конвертазы. Увеличенная стабильность обоих №2+-содержащих ферментов позволила их физико-химически охарактеризовать и показать, что соотношение компонентов: Ni2+, ВЬ и СЗЬ/СЗ(НгО) в этих комплексах эквимолекулярное [27]. Если в ближайшем окружении СЗ-конвертазы присутствует молекула СЗЬ, то она может выполнять роль СЗ-конвертазы.
Дополнительная молекула СЗЬ необходима для связывания молекулы С5 и модифицирования ее для придания ей способности расщепляться ВЬ [28]. СЗ/С5-Конвертаза стабилизируется циклическим белком проиердином. 1.2.1.4. Узнавание и усиление ответа СЗЬ-Зависимая положительная обратная связь является уникальной особенностью альтернативного пути. СЗЬ, образующийся в реакции, катализируемой СЗ-конвертазой, является субъединицей для построения повой молекулы СЗ-конвертазы. Каждая только что появившаяся молекула СЗЬ способна образовывать фермент совместно с факторами В, D и Mg и продуцировать, таким образом, больше СЗЬ и больше фермента. Этот процесс протекает очень быстро как в растворе, так и на поверхности клетки, причем в последнем случае клетка покрывается СЗЬ [17]. Процесс усиления контролируется факторами II и I как в жидкой фазе, так и на неактивирующих частицах. Фактор Н прекращает образование СЗ-копвертазы и ускоряет распад СЗЬВЬ [29]. Поскольку субстратом для фактора I является СЗЬН, то для действия фактора I па СЗЬ требуется, чтобы последний образовал комплекс с фактором Н [30]. Поскольку концентрация фактора Н в сыворотке значительно выше, чем константа диссоциации СЗЬН, а концентрация СЗЬ низка, весь СЗЬ фактически находится в виде комплекса с фактором Н. С другой стороны, поскольку фактор I является очень эффективной протеазой, он взаимодействует с СЗЬН даже при очень низких концентрациях последнего. Таким образом, факторы II и I совместно являются очень эффективной очистительной системой для удаления СЗЬ и СЗ(НгО). Совокупность регуляторных белков, ассоциированных с клетками хозяина, является прекрасным защитным механизмом против аутоиммунной атаки комплементом. Такими широко распространенными в тканях регуляторами являются DAF и МСР [31]. DAF препятствует сборке СЗ-конвертазы и вызывает разрушение уже образовавшегося фермента. МСР, а также CR1, обладают высокой кофакторной активностью в фактор I-индуцировапном разрушении СЗЬ. Совместно эти мембранные белки могут обеспечивать высокую степень защиты тканей от связывания с СЗЬ. Не совсем попятно взаимоотношение DAF и фактора II при контролировании СЗЬВЬ на человеческих эритроцитах и других клетках крови.
Стимуляторы природного С1-ингибитора
До сих пор мы обсуждали ингибиторы системы комплемента, по стоит упомянуть также об исследованиях, касающихся фармакологического увеличения активности естественных ингибиторов системы комплемента. Bauman и Brockman [179] показали, что гепарин, вещества 33 и 34 усиливают взаимодействие между С1-ингибитором и С1. Синергетический эффект соединений 33,34 и С1-ингибитора проявлялся при концентрациях 2.5-5.Ох 10" М. В сыворотке они блокировали взаимодействие С1 с С4. В организме эти соединения ингибировали комплемент и защищали морских свинок от фатального шока Фроссмана. Гепарин (2-200 мкг/мл) ингибировал комплемент усилением активности С1-ингибитора в сыворотке, а также в очищенном состоянии [180, 181]. Ранние исследования показали, что азосульфоновый краситель, Chlorazol Fast Pink (32), ингибирует сывороточный комплемент посредством стимуляции С1-ингибитора [182]. 1.5. СОЕДИНЕНИЯ, КОТОРЫЕ ИНДУЦИРУЮТ ВЫРАБОТКУ С1- ИНГИБИТОРА Производное андрогена, даназол (119), индуцирует выработку в увеличенных количествах С1-ингибитора у пациентов с HANE. HANE - автосомальное доминантное нарушение, характеризующееся эпизодическими отеками и связанное с уменьшением функционального уровня CI-эстеразного ингибитора. Приблизительно 85% пациентов имеют пониженный антигенный уровень нормального ингибиториого белка и 15% имеют нормальный или повышенный уровень функционально ненормального белка. Лечение даназолом (119) приводило к увеличению выработки нормального С1-ингибитора у обеих групп пациентов [183, 184]. Увеличение уровня С1-ингибитора вызывало увеличение уровня С4. Минимальная эффективная доза даназола — 100-400 мг/день[185]. Подобное увеличение уровней нормального С1-эстеразного ингибитора и С4 наблюдалось после лечения другими природными и синтетическими производными андрогена, такими как метилтестостерон [186], фтороксиместерон (120) и оксиметолон (121) [187]. Lesavre с сотрудниками [188] изучил три гексапептида, которые частично повторяют последовательность фактора В, окружающую связь, разрушаемую фактором D. Эти пептиды не являются субстратами для фактора D, но они ингибируют его ферментную активность. 122а NH2-GIn-Lys-Arg-Lys-Ile-VaI-COOH 122b NH2-Glu-Lys-Arg-Lys-Ile-Val-COOH 122с NH2-Pyr-Lys-Arg-Lys-IIe-Val-COOH Пептиды 122b и 122с вызывают 50% ингибирование жидкофазпой СЗ-коннертазы при 3.0x10 5М и 3.0x1 О М соответственно. Пептид 122а был неэффективен при 1.0х10"3М.
Пептиды 122Ь, 122с, 122а ипгибировали фактор D-зависимую жидкофазиую активацию фактора В на 50% при концентрациях 3.0x1 О М, 8.0x10 4М и 1.0х10"3М соответственно. Пептид 122Ь вызывал 50% ингибирование клеточно-связапных СЗ/С5-конвертаз при 1.0x10" 4М Эти полипептиды не ингибируют оба пути активации комплемента при концентрациях до 10"ЭМ, по-видимому, из-за разрушения этих полипептидов протеазами сыворотки. Caporale с сотрудниками [189] наблюдал ингибирование СЗ-конвертазы, CVFBb, леупептиіюм (ацетил-лей цин-лейциіі-арпшаль) с Boc-Leu-Gly-Arg-амшюмєтилкумаршюм в качестве субстрата. Трипептид глутатион (123) также ингибировал альтернативный путь [81]. Burger с сотрудниками [190] показал, что некоторые полиапиопы, а именно DS 500 (сульфат декстраиа мол. масса 5х105 Да), зимозап, инулин, DNP60-HSA, каррагенан, леван и липополисахарид (LPS), индуцируют активацию СЗ и фактора В в очищенной от С4 сыворотке морских свинок, и эта активация ингибнруется низкомолекулярпыми полианионами ( 10000), а именно DS 5 (мол. масса 5х103 Да). CVF, сильный активатор альтернативного пути, также ингибировался этими полианионами. Добавление Mg + не восстанавливало СЗ-активирующий эффект CVF или других активаторов. Незамещенный декстраи, а также глюкоза-6-сульфат не ннгибируют альтернативный путь активации комплемента, вызванный вышеупомянутыми активаторами. Фермент CVFB только частично ингибировался полиэтилеисульфоновой кислотой (мол. масса 4.8x103) (PES 4.8). PES 4.8 также ингибировал зимозан-связанный СЗЬВ. Эти данные показывают, что низкомолекулярные полианионы оказывают свое действие за счет подавления первых этапов альтернативного пути активации комплемента. Сульфатированные полианионы с высокой молекулярной массой ( 104 Да), как было показано ранее, активируют альтернативный путь активации комплемента. Однако, как было продемонстрировано Bitter-Snermann с сотрудниками [191] на примере сульфатировапного сефадекса (SS), они не ведут себя подобно зимозану. Оказалось, что они сорбируют /?jH (750 мкг SS/мл плазмы морской свинки связывают 95% /?]Н) и тем самым вызывают жидкофазнуго активацию СЗ и фактора В в сыворотках человека и морской свинки дефицитных по С2 и С4 без разрушения С5. Сульфатированные полианионы с низким молекулярным весом не активируют СЗ, а вызывают ингибирование, механизм которого пока еще неизвестен. Пентозанполисульфоэфир (SP 54) (10-100 мкг/мл) ингибирует образование СЗЬВ [192]. Гепарин в микрограммовых количествах ингибирует образование СЗЬВ и предотвращает ДіН-опосредованный распад этого фермента [193]. Поли-Ь-лизин (50 кДа) [194] при концентрациях порядка 10" М более эффективно предотвращал образование клеточно-связанного или жидкофазного СЗЬВЬ, чем образование СЗЬВ. О» не.изменял стабилизирующее действие пропердина. Подобно полилизииу, полиберен также препятствовал разрушению фактора В под действием фактора D. Авторы заключили из своих исследований, что антигемолитическое действие поликатионов зависит от плотности положительно заряженных групп в молекулах. 1.6.3. Аминокислоты и их производные ЕАСА (72) при концентрации 1 М усиливает спонтанный распад СЗ при инкубации при 37С, инициируя тем самым, как полагают, альтернативный путь активации комплемента [195]. При более низких концентрациях ЕАСА иигибирует, а не ускоряет распад СЗ в сыворотке. При концентрациях превышающих 0.5 М активация преобладает над ингибированнем.
Реакции с участием зимозана и CVF подобным образом подавлялись ЕАСА. Ингибирование было обусловлено подавлением сборки СЗ-конвертазы альтернативного пути. Высокие концентрации ЕАСА ускоряли распад СЗ. Это было объяснено ингибированнем СЗЬ-инактиватора. При более низких концентрациях действие ЕАСА на СЗЬ-инактиватор было не достаточно, поэтому доминировало ингибирование распада СЗ. Vallota [140] установил, что ЕАСА ингибирует образование С5-копвертазы при 1.0 М. Цистеин и гомоцистеин (10-40x10" М), как было показано, ингибируют оба пути активации комплемента [81]. Метиловые эфиры ацетил-Ышзипа и г -а-ацетил-Ь-лизипа ингибируют превращение фактора В под действием фактора D, 1.6.4. Амидины и гуанндниы Пропамидин (124) ингибирует альтернативный путь активации комплемента, действуя наС5 [196,197] и, вероятно, взаимодействуя с В-детерминантой СЗ [198]. FUT-I75 (118) специфически связывается с Bb-фрагментом фактора В или CoVFBb [199]. Он также ингибирует гемолитическую активность фактора В, СЗ-конвергазпую активность CoVFBb и разрушающую фактор В активность фактора D. Концентрации FUT-175, вызывающие 50% ингибирование этих активностей - 10"5 М - 10"4 М- Подобно другим гуанидинам, описанным рапсе, FUT-175 также ингибирует Clr, Cls и общую гемолитическую активность классического пути. В ряде исследовательских работ, посвященных разработке ингибиторов для терапевтического регулирования альтернативного пути, была описана трехмерная структура фактора D, установленная методом рентгеновской кристаллографии [200, 201, 202]. Пристальное внимание к ингибированию фактора D объясняется тем, что он является лимитирующим ферментом в альтернативном пути активации системы комплемента и функционирует в начале биохимического каскада. Способность диизопропилфторфосфата и 3,4-дихлороизокумарина [203] полностью ипактивировать фактор D [204] была использована в кристаллографических исследованиях для того, чтобы сравнить между собой активные .сайты пативного фактора D и фактора D в комплексе с ингибитором с целью разработки низкомолекулярных ингибиторов. Информация, полученная в результате этой работы, помогла разработать ВСХ-1470 (1С;о 96 нМ), который ипгибировал фактор D в наномолярных концентрациях и был в 180 раз эффективнее FUT-175.
Синтез амфифильного дисульфата бисфенола и изучение его антигемолитической активности в составе липосомных дисперсий
Известно, что полиапионные соединения, в частности полисульфаты, ингибируют большинство стадий активации комплемента [95]. Lauenstein [90] и Raepple [93] установили, что сульфатированные полисахариды ингибируют действие компонента С1, взаимодействуя с его субкомпонентом Clq. Это действие сохранил ближайший низкомолекулярный аналог сурамин, имеющий 6 сульфогрупп. В нашей лаборатории также было показано, что отрицательно заряженные полимеры взаимодействуют с Clq [5]. Clq состоит из 18 полипептидных цепей (6А, 6В и 6С цепей), каждая из которых содержит N-концевой коллагеноподобный участок и С-концевую глобулярную область. Цепи ассоциированы вместе таким образом, что полная молекула содержит шесть глобулярных головок, прикрепленных к центральному участку посредством гибких стеблей и внешне напоминает букет тюльпанов [142]. Поскольку молекула Clq состоит из шести (рис. 2) идентичных функциональных субъединиц и, следовательно, содержит шесть мест связывания с отрицательно заряженными субстанциями, эффекторы, способные взаимодействовать с двумя и более фрагментами Clq должны быть на порядок активней. Так, Anderson [146] включил дипептид Тгр-Туг, ингибирующий комплемент путем связывания с Clq (ІС5о=15 мМ), в состав полимерной матрицы (в качестве матрицы использовались бычий сывороточный альбумин и декстрап) и показал увеличение АА в 115 раз. Мы предположили, что липосома, в бислой которой включен отрицательно заряженный амфифильный эффектор (34), будет связываться с Clq на порядок эффективнее (рис. 5Б). Изменение концентрации эффектора в бислое липосом позволяет менять расстояние между нарами заряженных групп на поверхности мембраны. Из графика зависимости между АА и мольной долей активного вещества в липосоме можно будет определить оптимальное расстояние между заряженными молекулами и создать бидентатный эффектор, расстояние между парами заряженных групп которого будет соответствовать максимально эффективному (рис. 5А). Одним из важнейших этапов конструирования лекарственных препаратов является определение молекулярной мишени, с которой взаимодействует лекарственная субстанция.
Так как известно, что отрицательно заряженные полимеры взаимодействуют с Clq, очень вероятно, что и исследуемые эффекторы имеют ту же мишень. Для проверки этой гипотезы мы синтезировали дисульфат аналога бисфенола А с жирным хвостом (34) для инкорпорации его в липосомы. 2.8.1. Синтез амфифильного дисульфата бисфенола Синтез дисульфата 1,1-ди(4"-гидроксифенил)гексадекана (34) проводили по схеме 4. Окислением пальмитинового спирта диметилсульфоксидом в присутствии пятиокиси фосфора получали соответствующий альдегид, который конденсировали с фенолом в кислой среде. В результате получали неочищенный продукт с выходом около 50%. После третьей перекристаллизации из толуола мы выделяли чистый по 1Н-ЯМР-спектру продукт (рис. 7) с выходом 7.5%. Далее 1,1-ди(4 -гидроксифенил)гексадекан сульфатировали по методике, описанной в п. 2.2. Выход реакции сульфатироваиия составил 67%. 2.8.2. Влияние амфифильного дисульфата бисфепола (34) в составе липосом на гемолитическую систему В связи с тем, что мы обнаружили гемолитическую способность дисульфата бисфенола (34), для изучения зависимости между мольным соотношением дисульфат : липид в липосомах и проявляемой ими АА необходимо было проверить, не наблюдаются ли дополнительные эффекты: проявляют ли липосомы с дисульфатом 1,1-ди(4 -гидроксифенил)гексодекана (34) гемолитическую активность; Для проверки этого действия липосомы из яФХ диаметром 200 им с разным содержанием активного вещества (липид:эффектор 0.944:0.056; 0.955:0.045; 0.967:0.033) инкубировали с сенсибилизированными эритроцитами. способны ли липосомы с эффектором активировать белки СК; Для определения этого те же линосомные дисперсии инкубировали с эритроцитами и комплементом. способны ли «пустые» липосомы из яФХ лизировать эритроциты и активировать белки СК. Для этого в первом случае липосомы из яФХ диаметром 200 им в концентрации 6.9 мг/мл (10.46 мМ) инкубировали с эритроцитами. Во втором случае «пустые» липосомы инкубировали с эритроцитами и комплементом. В результате было установлено, что значения лизиса эритроцитов для всех вышеперечисленных определений сравнимы с фоновым лизисом, что позволяет сделать вывод о том, что «пустые» липосомы или липосомы с эффектором не проявляют гемолитическую активность и не способны активировать белки СК, 2.8.3. Зависимость антигемолитической активности липосом с дисульфатом 1,1-ди(4 -гидроксифенил)гсксадскана (34) от его доли в бислое Липосомные дисперсии с эффектором в бислое получали по стандартной методике, смешивая в нужных пропорциях растворы дисульфата 1,1-Ди(4 -гидроксифенил)гексадекана (34) и яФХ в спирте. Затем смесь подвергали ультразвуковой обработке, упаривали, прибавляли вероиаловый буфер и 5 раз повторяли цикл замораживания-оттаивания. Далее каждый образен продавливали 19 раз через ядерный фильтр с порами 200 нм. Исследования антигемолитической активности дисульфата (34) в составе липосом состояли из двух серий опытов. В первой серии брали фиксированное количество эффектора (500 мкг/мл), и, изменяя количество липидов, получали образцы с мольной долей дисульфата (34) от 0.017 до 0.123.
Активность дисперсий проверяли в стандартной гемолитической системе, учитывая светорассеивание образцов. При этом наблюдался максимум АА при 0.069-0.095 (АА до 38.2% при мольной доле 0.079). Увеличение АА при мольной доле дисульфата (34) менее 0.044 объясняется влиянием на определение степени гемолиза большого количества липидов, что подтверждено опытами с пустыми липосомамн, поэтому данный диапазон далее не рассматривался. Чтобы исследовать диапазон концентраций менее 0.06 мольной доли, вторую серию опытов проводили при постоянной концентрации яФХ, изменяя концентрацию эффектора. Втора» серия опытов проводилась с образцами, в которых концентрация липидов была постоянной, а количество эффектора изменялось так, что его мольная доля составляла 0.025 - 0.072. Опыты проводили при различных разбавлениях (0.35%, 0.46%, 0.69% липидов в дисперсии). Максимумы наблюдались в диапазоне от мольной доли эффектора 0.025 (АА до 78% при 0.69% липидов) до 0.048 (АА до 16.9% при 0.35% липидов). Данным образцам соответствует абсолютная концентрация дисульфата 1,1-ди(4 -гидроксифепил)гексадекапа(34) 0.232 мкМ. При рассмотрении полученных результатов (рис. 8, 9) видно, что между активностью и мольной долей эффектора (34) в липосоме нет четкой корреляции, которая прослеживалась бы при разных разбавлениях липидной дисперсии. Поэтому, для оценки расстояния между парами заряженных групп эффектора в бислое был выбран диапазон 0.049-0.069 мольной доли дисульфата (34), в котором наблюдаются максимумы активности. Диапазон менее 0.049 не учитывался вследствие высокой погрешности измерений, вызванных высокой опалесценцией липосом ной дисперсии. Крайние точки диапазона также не рассматривались. 2.8.4. ОЦЕНКА РАССТОЯНИЯ МЕЖДУ ПАРАМИ ЗАРЯЖЕННЫХ ГРУПП В ЛИПОСОМАХ С ДИСУЛЪФАТОМ 1,1ДИ(4 - ГИДРОКСИФЕНИЛ)ГЕКСАДЕКАНА (34) В БИСЛОЕ Так как пары отрицательных зарядов из-за электростатического отталкивания распределяются на поверхности мембраны равномерно, а укладка молекул вероятнее всего гексагональная, из геометрических построений можно вывести следующее соответствие между мольным составом липосом, содержащих соединение (34), и расстояния между парами заряженных групп:
2-Циклопентилмалоновая кислота (57)
Для получения сенсибилизированных эритроцитов 10 мл суспензии бараньих эритроцитов в VBS2+ (lxlO9 клеток/мл) и 10 мл гемолитической сыворотки, разбавленной VBS в соотношении 1:400, инкубировали 25 мин при 37С, после чего эритроциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 3000g. Сенсибилизированные эритроциты (200 мкл суспензии в VBS2+, 1.5x10s клеток/мл) смешивали с 200 мкл раствора сыворотки морской свинки в VBS как источника комплемента в концентрации, обеспечивающей 75% гемолиз, 400 мкл VBS2+ и 200 мкл раствора ингибитора в VBS в разных концентрациях. Для стандартизации опыта и определения АА эталона в систему вместо ингибитора прибавляли по 200 мкл растворов сульфстрона в VBS2+c концентрациями 5 мг/мл, 2.5 мг/мл, 1.25 мг/мл, 0.625 мг/мл, 0.313 мг/мл. В контрольной системе исследуемое вещество заменяли буфером. Для учета спонтанного лизиса эритроцитов смешивали 200 мкл сенсибилизированных эритроцитов с 800 мкл буфера. Все образцы инкубировали 25 мин при 37С, разбавляли в 4 раза холодным буфером для остановки реакции и нелизированные эритроциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 3000g. Оптическую плотность супернатаита измеряли при 4J4 нм, АА вычисляли по формуле (III). 91 Далее строили график зависимости ЛА от концентрации ингибитора и сульфетрона, определяли по нему onlCjo, ICfOc- Значения ICgo рассчитывали по формуле ICstHonICso/ICso TlCso. 2. Гемолитическую активность соединений определяли аналогично, добавляя в гемолитическую систему 200 мкл VBS2+вместо раствора комплемента. 3.1S. Определение функциональной активности компонентов Clr, Cls методом иммуноферментного анализа Раствор иммуноглобулина человека IgG3 в карбонатном буфере (100 мкл, 100 мкг/мл) вносили в лунки плоскодонного полистиролового планшета, выдерживали ночь при 4С. Лунки промывали VBSE (3x150 мкл), осушали, прибавляли раствор комплемента морской свинки в VBSE (100 мкл, 1:200) и инкубировали 1 ч при 37С. Лунки промывали VBSE (3x150 мкл), прибавляли по 200 мкл раствора исследуемого вещества в VBS2+. Согласно методу 1, планшет инкубировали 1 ч при 37С, содержимое лунок вытряхивали, прибавляли раствор комплемента морской свинки в VBS2+ в разных разведениях (100 мкл) и 10 мкл раствора R1 в VBS +. Согласно методу 2, растворы комплемента и R1 добавляли сразу. Планшет инкубировали 1 ч при 37С, промывали изотоническим фосфатным буфером, содержащим 0.05% Tween 20, и добавляли конъюгат пероксидазы хрепа с антителами человека против компонента СЗ.
Планшет инкубировали 1 ч при 37С, промывали изотоническим фосфатным буфером, содержащим 0.05% Tween 20 от несвязавшегося коъюгата, прибавляли 100 мкл раствора тетраметилбензидина в цитратно-фосфатном буфере, содержащем 0.006% Н2О2. После 10 мин инкубации в темноте, реакцию останавливали прибавлением 50 мкл 14% серной кислоты. Результаты реакции учитывали на спектрофотометре с вертикальным лучом, измеряя оптическую плотность при 490 нм. 3.19. Получение лииосом из яФХ с дисульфатом 1,1-ди(4 -гидроксифенил)гсксадекана (34) в бислое Растворы дисульфата 1,1-ди(4 -гидроксифенил)гексадекана (34) (0.5 мМ) и яФХ (20 мМ) в метаноле смешивали в количествах согласно таблицам 22 и 23, обрабатывали ультразвуком 2 мин, упаривали досуха на роторном испарителе. Далее к каждому образцу прибавляли по 1.5 мл вероналового буфера и замораживали в жидком азоте, затем оттаивали на водяной бане при 50 С. Цикл замораживания-оттаивания повторяли 4 раза. Далее каждый образец продавливали 19 раз через ядерный фильтр с порами 200 нм. 1. Определение гемолитической активности липосом с соединением (34) в бислое. К смеси 600 мкл VBS , 200 мкл сенсибилизированных эритроцитов в VBS прибавляли 200 мкл дисперсии липосом из яФХ диаметром 200 нм с разным содержанием активного вещества (34) (липид:эффектор 0.944:0.056; 0.955:0.045; 0.967:0.033). 2. Определение способности липосом с соединением (34) в бислое активировать белки СК. К смеси 400 мкл VBS:+, 200 мкл эритроцитов в VBS2+, 200 мкл комплемента морской свинки в VBS2+ прибавляли 200 мкл дисперсии липосом из яФХ диаметром 200 нм с разным содержанием активного вещества (34) (липид:эффектор 0,944:0.056; 0.955:0.045; 0.967:0.033). 3. Определение способности пустых липосом из яФХ лизировать эритроциты и активировать белки СК. К смеси 400 мкл VBS , 200 мкл эритроцитов в VBS , 200 мкл комплемента морской свинки в VBS2+ прибавляли 200 мкл дисперсии пустых липосом из яФХ диаметром 200 нм. Для учета спонтанного лизиса эритроцитов смешивали 200 мкл сенсибилизированных эритроцитов с 800 мкл буфера. Все образцы инкубировали 25 мии при 37С, разбавляли в 4 раза холодным буфером для остановки реакции и нелизированные эритроциты осаждали центрифугированием в течение 5 мин при 3000g Оптическую плотность супернатанта измеряли при 414 пм. 3.21. Определение ККМ дисульфата 1,1-ди(4 -гидр жсифеиил)гексадекана (34) Готовили 6 растворов соединения (34) в воде с концентрацией 78-мкМ. Каждый последующий раствор получали двукратным разбавлением предыдущего. По данным измерения оптической плотности при 500 нм строили график. ККМ дисульфата 1,1-Ди(4 -гидроксифенил)гексадекана (34) составляет 15 мкМ (рис. 11).
Разработан метод сульфатирования бисфеноло», ароматических спиртов и бетулина действием серной кислоты и уксусного ангидрида в пиридине. Синтезированы производные бисфенола А с различными анионными заместителями (сульфатными, фосфатными, карбоксимстильными), ряд дисульфатов бисфснолов, ароматических спиртов и бетулина. Определена АА полученных соединений, а также ряда дикарбоповых кислот аналогичного сбисфенолами строения. Установлены следующие закономерности. Впервые показано, что для проявления АА достаточно одной анионной группы. Добавление второй отрицательно заряженной группы оказывает положительный, но не очень значительный эффект, исключение составляет карбоксиметильная группа. Установлено, что введение в структуру объемных гидрофобных заместителей (циклогексилиденового, флуоренилиденового, аптронилиденового) приводит к существенному увеличению активности. Показано, что электронодонорные заместители (метальные группы) в бензольных ядрах в ор/но-положениях к сульфатной группе вызывают снижение АА, электроиоакцепторные (атомы галогена) - увеличение. Несмотря на электронодонорные свойства пропильиого и аллилыюго радикалов, их высокая гидрофобность и способность экранировать заряженные группы оказывают активирующее воздействие. Выявлена количественная взаимосвязь «структура - активность» (QSAR) в ряду дисульфатов бисфенолов. Значимыми дескрипторами являются сумма частичных отрицательных зарядов на ертю-углеродиых атомах бензольных ядер относительно сульфатной группы, гидрофобность молекулы и поляризуемость центрального радикала. С помощью этого уравнения для трех соединений контрольной группы была предсказана АА с ошибкой 25-85%. В уравнении количественной взаимосвязи «структура - активность» для ароматических дикарбоновых кислот значимыми дескрипторами являются расстояние между зарядами и гидрофобность молекул. Изучена зависимость АА дисульфата 1,1-Ди-(4 -гидроксифенил)-гексадекапа (34) в составе липосом от содержания активного вещества. Показано, что максимальная активность проявляется при мольной доле эффектора 0.049-0.069, что соответствует расстоянию 4.2-3.5 нм между парами зарядов па поверхности мембраны. С помощью ИФА показано взаимодействие сульфстрона (49) с Clq и снижение функциональной способности С1г и Cls в присутствии дифосфата бисфенола А (5), дисульфата 9,9-бис-(4 -гидроксифенил)-флуорсна (20), что позволяет рассматривать эти белки наряду с Clq в качестве возможных молекулярных мишеней.
