Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Выделение, изучение физико-химических и каталитических свойств, иммобилизация и применение для аналитических целей глюкозооксидазы, алкогольоксидазы и холестериноксидазы .
1А. Обзор литературы
1А.1. Введение 13
1 А.2 Источники получения и основные свойства алкогольоксидазы, глюкозооксидазы и холестериноксидазы
1А.2.1. Алкогольоксидаза 15
1А.2.2. Глюкозооксидаза 18
1А.2.3. Холестериноксидаза 19
1А.2.4. Механизм действия глюкозооксидазы, 26
алкогольоксидазы и холестериноксидазы
1А.З. Использование ферментов класса оксидаз в аналитических целя 1 А.ЗЛ. Химические и физико-химические методы определения глюкозы, спиртов, холестерина. /Краткая историческая справка/ 29
1А.3.2. Методы анализа глюкозы, спиртов и холестерина с использованием растворимых GMC-оксидоредуктаз 39
1 А.3.3. Методы анализа глюкозы, спиртов и холестерина с
использованием иммобилизованных GMC-оксидоредуктаз 51
1 А.3.4. Ферментные электроды, реакторы и другие аналитические
устройства на основе иммобилизованных GMC-оксидоредуктаз 53
1А.4. Изучение возможности создания ферментного электрода для определения субстратов НАД-зависимых дегндрогеназ
1А.4.1. Методы определения субстратов НАД-зависимых дегидрогеназ 57
1А.4.2. Получение полимерных форм НАД+ 63
1 А.4.3. Полимерные субстраты оксидоредуктаз 65
1А.5. Заключение 67
1В. Материалы и методы исследований 69
1с. Результаты и их обсуждение
1С.1 Изучение реакции окисления глюкозы под действием глюкозооксидазы 1С
1.1. Изучение кинетических параметров реакции, катализируемой глюкозооксидазой, в присутствии кислорода 77
1С. 1.2. Изучение реакций, катализируемых глюкозооксидазой, в присутствии искусственных акцепторов электронов 80
1С.2. Изучение реакции окисления холестрина под действием холестриноксидазы
1С.2.1. Введение 87
1С.2.2. Зависимость реакции окисления холестерина холестринокси- дазой от «предыстории» растворов субстрата 90
1С.2.3. Механизм, объясняющий кинетические особенности реакции, катализируемой холестриноксидазой 92
1С.2.4. Выделение и характеритика комплекса холестрин - А4-холес-тен-3-он 101
1С.2.5. Влияние структурной организации ассоциатов холестерина на реацию его окисления холетериноксидазой 103
1С.2.6. Холестериноксидаза - индикатор структурной организации ассоциатов холестерина 111
1С.З. Алкогольоксидаза: поиск штамма-продуцента, наращивание, выделение и характеристика препаратов фермента 124
1C.4. Разработка аналитических методов, приборов и устройств для определения субстратов оксидоредуктаз 1С.4.1. Введение 129
1 С.4.2. Критерии подбора носителей для иммобилизации ферментов. Теория и практика 131
1С.4.3. Анализаторы на основе иммобилизованных ферментов для определения субстратов оксидаз 138
1С.4.4. Способ повышения надежности и точности анализа в области нижнего предела определяемых концентраций 142
1С.4.5. Универсальный ферментный электрод для определения субстратов НАД-зависимых дегидрогеназ 145
1С.4.6. Универсальное индикаторное устройство для определения концентраций субстратов ферментативных реакций - тест-капсулы 155
1С.4.7. Спектрофотометрические методы определения глюкозы на основе реакции глюкозооксидазы с искусственными акцепторами электронов 15 9
1С.5. Заключение 161
Раздел 2. Углеводный обмен: механизмы патологических процессов
Глава 2. Механизм развития диабетических
Осложнений
2а. Обзор литературы
2А.1. Введение 168
2А.2. Гликозилирование белков 169
2А.З. Гликозилированные белки в оценке степени компенсации нарушения углеводного обмена 174
2А.4. Роль гликозилированных белков в патогенезе диабетических осложнений 176
2А.5. Роль промежуточных продутов процесса гликозилирования в патогенезе диабетических осложнений 184
2А.6. Диабетические осложнения как следствие интенсификации полиолового пути метаболизма глюкозы 190
2А.7. Анализ различных гипотез развития диабетических осложнений 193
2В. Материалы и методы исследований 198
2c. Результаты 200
2d. Обсуждение результатов в рамках
Новой концепции генерализованного механизма развития диабетических осложнений
2D.1. Обоснование роли ингибиторов сериновых протеиназ в развитии диабетических осложнений 204
2D.2. Поиск «гуанидинового яда» и оценка потенциальной патологической роли метилглиоксаля в развитии диабетических осложнений 210
2D.3. Статус нейтрофилов при сахарном диабете 212
2D.4. Сценарий разрушения организма при сахарном диабете 218
2D.5. Заключение 228
Глава 3. Диабет и рак. механизмы взаимовлияния (Гипотеза)
ЗАЛ. Введение: Метилглиоксаль - «разрушитель» или «защитник»? 231
ЗА.2. Гипергликемия <-» Метилглиоксаль <-> Рак 234
ЗА.З. Сахарный диабет и рак 242
ЗА.4. Протеинкиназа С - регулятор процессов опухолевого роста и диабетических осложнений 254
ЗА.5. Протеинкиназа С и процессы злокачественной пролиферации 256
ЗА.6. Заключение 262
Основные результаты и выводы 264
Список цитированной литературы
- Источники получения и основные свойства алкогольоксидазы, глюкозооксидазы и холестериноксидазы
- Методы анализа глюкозы, спиртов и холестерина с использованием растворимых GMC-оксидоредуктаз
- Гликозилированные белки в оценке степени компенсации нарушения углеводного обмена
- Поиск «гуанидинового яда» и оценка потенциальной патологической роли метилглиоксаля в развитии диабетических осложнений
Введение к работе
Актуальность темы. Поддержание постоянства концентрации глюкозы in vivo является примером одного из самых совершенных механизмов гомеостаза, в функционировании которого участвуют печень, жировая и мускульная ткани, гормоны. Многочисленные нарушения процессов углеводного обмена чаще всего имеют место при сахарном диабете (СД) и характеризуются множественностью форм проявления таких как поражение глаз, почек, нарушение кровообращение, склонность к тромбозу, снижение иммунорезистентности к бактериальным инфекциям, появление незаживляемых ран. Многие специалисты склонны рассматривать перечисленные нарушения не как осложнения СД, а как естественную форму проявления основного заболевания. Такая точка зрения в основном обусловлена отсутствием механизма, позволяющего связать воедино и объяснить весь широкий спектр перечисленных патологий. Поиск такого механизма - одна из атуальнейших современных задач, особенно если принять во внимание неуклонный рост количества больных СД во всем мире.
Многообразие форм нарушений углеводного обмена могут проявляться в явном виде не только при СД, но и некоторых других заболеваниях. Так, например, более чем за 150 лет наблюдений (!) в научной и медицинской литературе накопилось много диаметрально противоположных утверждений, выражающих два полярных мнения о том, что диабет подавляет или, наоборот, способствует злокачественным пролиферативным процессам. С другой стороны, у онкологических больных нередко наблюдаются признаки, характеризующие сильное влияние основного заболевания на процессы углеводного обмена. Таким образом, представляется очень заманчивым попытаться «поставить точку» в этом затянувшимся споре и идентифицировать молекулярный механизм взаимовлияния названных патологий.
Одним из основных инструментов изучения механизмов патологии является селективный анализ различных метаболитов. В конечном итоге, как правило, цель достигается использованием ферментных или иммуноферментных аналитических методов. Разработка и внедрение в практику таких методов невозможно без наличия широкого ассортимента ферментных препаратов, а также фундаментальных знаний механизма их действия. Немаловажным обстоятельством, во многом обеспечивающим успех подобных исследований, является соответствующие конструктивные решения и аппаратурное оформление используемых аналитических методов.
Значения концентраций глюкозы и холестерина безусловно являются базовыми параметрами, адекватно отражающих в целом «согласованность» протекания процессов углеводного обмена in vivo. Мировая потребность в анализах указанных метаболитов обеспечивается аналитическими наборами, тест-полосками или анализаторами, принцип действия которых основан на использовании ферментов глюкозооксидазы и холестериноксидазы. Однако, до сих пор известный набор аналитических методов глюкозы и холестерина не покрывает всех нужд медико-биологических исследований. Разработка новых - является актуальнейшей научно-практической задачей. Причем, поскольку за биологической активностью указанных ферментов можно следить с помощью одних и тех же инструментальных методов анализа, разработка, к примеру, анализатора глюкозы, позволяет, в принципе, использовать созданный прибор и для анализа холестерина без каких-либо конструктивных изменений.
Оказалось, что не только с практической, но и научной точек зрения, изучение каталитических свойств глюкозооксидазы и холестериноксидазы представляет определенный интерес, поскольку оба фермента характеризуются высокой степенью гомологичное™ первичных струкур. По этому признаку, глюкозооксидазу и холестериноксидазу, равно как и некоторые другие ФАД-зависимые оксидоредуктазы (например, холин- или алкогольоксидаза) объединяют в т.н. семейство GMC-(glucose-methanol-спо1іпе)-оксидоредуктаз [Cavener 1992;Sampson 2001]. Среди членов этого семейства алкогольоксидаза, равно как и оксидазы глюкозы или холестерина, является основным реагентом большинства коммерческих наборов для анализа первичных спиртов в микробиологической и виннодельческой промышленностях. Таким образом, вышеуказанные причины позволяют рассматривать исследования глюкозооксидазы, холестериноксидазы и алкогольоксидазы как актуальную научную задачу с большой практической значимостью.
Цели и задачи исследований. Проведенные исследования были посвящены: 1. Изучению GMC-оксидоредуктаз:
• поиск штаммов-продуцентов алкогольоксидазы и разработка эффективной методики выделения этого фермента;
• изучение физико-химических и каталитических свойств глюкозооксидазы, алкогольоксидазы и холестриноксидазы;
• разработка ферментативных методов анализа глюкозы, спиртов и холестерина с использованием растворимых и иммобилизованных ферментов
• создание прототипов ферментных анализаторов субстратов GMC-оксидоредуктаз
2. Теоретическому и экспериментальному обоснованию генерализированного механизма развития диабетических осложнений.
3. Теоретическому обоснованию гипотезы, объясняющей взаимозависимость патологических молекулярных процессов при совместном протекании сахарного диабета и рака
Научная новизна.
Изучен механизм действия глкжозооксидазы с искусственными акцепторами электронов. Впервые продемонстрировано, при окислении глюкозы глюкозооксидаза может проявлять несколько максимумов рН-активности в зависимости от вида акцептора электронов, используемых в качестве второго субстратра. С кислородом максимум активности наблюдался в области значений рН 5,6; с одноэлектроннными акцепторами -в области рН 7,6; в случае 2,6-дихлорфенолиндофенола рН-оптимум реакции располагался в области значений 5,0. Предложен механизм, объясняющий обнаруженное явление.
Впервые продемонстрирована возможность применения полимерных субстратов на основе окислительно-восстановительных индикаторов для глюкозооксидазы и НАДН-дегидрогеназы. Это позволило предложить новую конструкцию ферментных электродов.
Впервые предложена и экспериментально обоснована оригинальная кинетическая схема действия холестериноксидазы в водно-органических средах. Продемонстрировано, что каталитические свойства фермента холестериноксидаза в сильной мере зависят от структурной организации субстрата. Другими словами, холестериноксидаза является «проявителем» надмолекулярной структуры ассоциатов холестерина С этих позиций, разработанный подход проведения реакции окисления холестерина холестриноксидазой может оказаться приемлемым для дигностики состояния клеточных мембран.
Найден активный дрожжевой продуцент алкогольоксидазы и каталазы Candida boidinii 4g. Разработана оригинальная методика очистки этих ферментов. Изучены основные физико-химические и каталитические свойства алкогольоксидазы.
Предложены и обоснованы экспериментальные критерии подбора пористых носителей для иммобилизации ферментов.
Разработаны различные аналитические методы и устройства для определения некоторых субстратов GMC-оксидоредуктаз и НАД-зависимых дегидрогеназ.
Впервые продемонстрирована возможность инактивации антитромбина-Ш и С1-ингибитора под действием метилглиоксаля. Определены значения констант скоростей указанных реакций в условиях, максимально приближенных к условиям in vivo. Проведен критический анализ и оценка возможного влияния протекания этих процессов на развитие диабетичсеких осложнений. Впервые предложен и обоснован генерализованный механизм развития диабетических осложнений. В основе этого механизма лежит активация длительной гипергликемией внутриклеточных ферментов, входящих в семейство протеинкиназ С (РКС). В соматических клетках этот процесс ведет к состоянию инсулинорезистентности. В нейтрофилах - к их активации и выбросу во внеклеточное пространство миелопероксидазы, эластазы, катионных белков и других эффекторных молекул, разрушающих стенки кровеносных сосудов и иницирующих нарушения в системах свертывания крови и фибринолиза.
Исследованы общие и значимые для СД и рака молекулярные процессы. Показано, что внутриклеточные процессы, контролируемые семейством ферментов РКС лежат не только в основе развития диабетических осложнений, но и контролируют злокачественный опухолевый рост клеток. Это обстоятельство позволило классифицировать рассматриваемые патологии включая инсулинорезистентность как "РКС- синдром". Проведенный в диссертации анализ позволил высказать гипотезу, согласно которой изменение статуса РКС под действием гипергликемии или в условиях инсулинорезистентности - наиболее характерных форм проявления сахарного диабета, способно как "компенсировать" так и "усиливать" дисфункцию изоферментов РКС, обусловленную, в свою очередь, процессами канцерогенеза.
Результирующий клинический эффект взаимовлияния диабета и рака, по-видимому, в этих случаях будет зависть от степени компенсации сахарного диабета, вида и стадии онкологического заболевания. В рамках этой гипотезы, стало возможным объяснить, почему СД может подавлять, препятствовать или способствовать развитию рака.
Структура диссертационной работы. Диссертационная работа «Углеводный обмен: механизмы патологических процессов, анализ важнейших метаболитов» посвящена следующим конкретным научным аспектам по данной теме:
• выделению, изучение физико-химических и каталитических свойств ряда ряда ферментов класса оксидорекдуктаз с целью создания на их основе новых аналитических методик и устройств для анализа важнейших метаболитов углеводного обмена.
• обоснованию гипотезы существования генерализированного механизма развития осложнений при нарушениях углеводного обмен, обусловленных сахарным диабетом
• изучению взаимозависимости и взаимовлиянию патологических процессов при канцерогенезе и сахарном диабете.
Источники получения и основные свойства алкогольоксидазы, глюкозооксидазы и холестериноксидазы
Употребление в научной литературе терминологии в сравнительной, а тем более в превосходной степени, строго говоря, требует если не аргументации, то, по меньшей мере, возможности рассмотрения тех и других данных. Ниже представленный краткий исторический обзор химических и физико-химических методов анализа глюкозы, спиртов, холестрина призван подчеркнуть ту особую роль, которую сыграли ферменты в аналитической химии перечисленных соединений. Кроме того, рассмотрение, на первый взгляд, совершенно «устаревшей» тематики в настоящем разделе, преследует также и несколько другую цель. Как будет показано далее, некоторые из рассматриваемых реакций, лежащих в основе химических методов анализа глюкозы, могут иметь место и in vivo и быть связанными с развитием многочисленных патологий, обусловленных нарушением углеводного обмена (см. раздел 2А).
Глюкоза
Химические методы определения Сахаров и глюкозы, в частности, подразделяют на две основные группы: методы, основанные на восстановительных свойствах Сахаров и методы, основанные на конденсации молекул углеводов с ароматическими аминами.
Методы, основанные на восстановительных свойствах глюкозы Из восстановительных методов анализа глюкозы чаще всего используются методы, в основе которых в качестве восстанавливающегося компонента применяют феррицианид-ионы или ионы 2-х валентной меди (Си2 ).
Одним из первых был метод Хагедорна-Иенсена [Hagedorn & Jensen 1923; Holtz et al., 1961], принцип которого заключается в окислении глюкозы в щелочной среде при 100С известным количеством феррицианида с последующим йодометрическим титрованием избытка реагента раствором тиосульфата натрия. Метод дает завышенные результаты из-за присутствия в биологических пробах помимо глюкозы других соединений, восстанавливающих феррицианид. В настоящее время применяется крайне редко. К данной группе следует отнести также метод Хофмана [Hoffman 1937], также основанный на реакции восстановления феррицианид-иона. Регистрацию процесса ведут спектрофотометрически при 426 нм (максимум поглощения феррицианида, отсутствующий у ферроцианида). Недостатки метода - низкий коэффициент чувствительности, определяющийся молярным коэффициентом погашения (1(Г M W) и плохая селективность, связанная с возможностью восстановления феррицианида некоторыми другими соединениями с восстановительными свойствами, такими как глютатион, цистеин или аскорбиновая кислота [Caraway & Kammeyer 1972]. В силу последней причины метод не применим для анализа глюкозы в моче. Известны попытки использования метода в автоанализаторе для определения глюкозы в цельной крови [Brown et al., 1966]. Через катетер, введенный в вену, происходит отбор порций крови, которая смешивается с антикоагулянтом и проходит через диализатор. В этом устройстве происходит смешение продиффундировавших через мембрану низкомолекулярных компонентов крови, в том числе глюкозы, с реагентами. Время реакции (при постоянной скорости прокачки) задается длиной шлангов, через которые проходит смесь. На выходе раствор проходит через проточную кювету фотометра, которым измеряются показания. В целом, сам метод не получил широкого распространения в клинической практике, в то время как использованный принцип проведения измерений был осуществлен в ряде промышленно выпускаемых анализаторов.
Метод Фолина-Ву [Folin & Wu 1920] основан на определении интенсивности окраски растворов фосфорномолибденовой сини под действием одновалентной меди (Си1+), образующейся в результате восстановления тартрата меди (Си ). Данный метод до недавнего времени широко применялся в клинической практике, хотя и обладает рядом недостатков - большая положительная погрешность (завышение результатов анализа до 20%) и необходимость удаления белков из проб. /у і 1-1-4.
Из других методов, включающих восстановление меди (Си до Си ), наибольшего внимания заслуживают методы Нельсона-Сомоджи [Nelson 1944] и неокупроиновый [Brown 1961]. Первый основан на способности глюкозы восстанавливать двухвалентную медь, входящую в состав медно-тартратного реактива, до одновалентной, которую определяют колорометрически, добавляя арсеномолибденовый реагент. Метод требует удаления из проб белков. Неокупроиновый метод основан на определении одновалентной меди с помощью реактива 2,9,-диметил-1,10-фенантролина, образующего с ней внутрикомплексное соединение в карбонатной среде при кинячении. Максимальная интенсивность окраски достигается через 3-5 минут. Неокупроин высоко специфичен по отношению к Си1+ и присутствие ионов 56 других металлов, включая Си2+, не оказывает мешающего влияния. Окраска устойчива в широком диапозоне рН от 3 до 10 и не зависила от присутствия хлорид-, тартрат-, цитрат-, ацетат-, фосфат- и ряда других анионов. Добавление карбоната к пробе позволяло уменьшить положительную погрешность, присущую всем восстановительным методам. Метод получил широкое распространение и реализован в ряде автоматических анализаторов. Величина погрешности при клинических анализах составляет около 10% при концентрации глюкозы менее 10мг/100мл (10мг%) и увеличивается до 20% при более высоких концентрациях.
Помимо методов, в которых используются реакции восстановления ионов Си2+ и феррицианида, известны методы, основанные на восстановлении пикриновой кислоты в щелочном растворе при нагревании (метод Бенедикта) [Benedict 1918] или реакциях между глюкозой, серной кислотой и нафтолом [Yamafuji & Yoshida 1939], тимолом [Schmor 1955] или фенолом [Dubois et al., 1956]. Методы просты в исполнении, однако окраски растворов нестабильны и зависят от температуры. Погрешность достигает 30%.
Восстановительные методы до сих пор находят применение в клинических исследованиях несмотря на ряд существенных недостатков -неспецифичность, высокая положительная погрешность, трудоемкость (кипячение, удаление белков и т.д.) и необходжимость внесения в анализируемые пробы многочисленных реагентов.
Методы анализа глюкозы, спиртов и холестерина с использованием растворимых GMC-оксидоредуктаз
Широкое распространение ферментативных методов анализа обусловлено следующими факторами: ферменты как катализаторы обеспечивают избирательность определения применение ферментов позволяет проводить реакцию с высокой скоростью и в мягких условиях (близкие к нейтральным значениям величины рН, комнатная температура, нормальное атмосферное давление) широким ассортиментом коммерческих препаратов ферментов.
Определение содержания веществ с помощью ферментов проводят двумя способами, которые принято классифицировать как «метод начальных скоростей» и «метод конечной точки». В дальнейшем будем придерживаться этой терминологии.
При использовании метода начальных скоростей содержание вещества рассчитьшается из калибровочного графика зависимости начальной скорости ферментативной реакции от концентрации определяемого соединения. Определение начальной скорости реакции может быть проведено либо дифференцированием начального участка зависимости концентрации субстрата или продукта реакции от времени, либо регистрацией изменения концентраций за фиксированный интервал времени, в течение которого скорость реакции не изменяется.
Метод конечной точки предусматривает высокую глубину превращения субстрата (как правило, не менее 90%) и применяется для необратимых реакций. Этот метод наиболее точен и не подвержен влиянию факторов, изменяющих скорость реакции. Инактивация фермента в присутствии ингибиторов не влияют на результаты измерения, а лишь увеличивают его время. Однако, для быстрого проведения анализа, такой метод требует применения высокой концентрации фермента. Поэтому наиболее распространен метод начальных скоростей, который и применяется в большинстве автоматических анализаторах, обеспечивающих постоянство условий проведения реакции.
Зависимость начальной скорости реакции (V0) большинства ферментативных реакций от концентрации субстрата (S), как правило, описывается уравнением Михаэлиса-Ментон:
Из уравнения следует, что линейная зависимость начальной скорости реакции от концентрации субстрата наблюдается при S « К,,,. Основные принципы ферментативного анализа и вопросы его применения для определения различных соединений рассмотрены в ряде обзоров и монографии [Березин и Клесов 1976; Варфоломеев и Гуревич 1999].
Сравнительный анализ ферментативных методов определения глюкозы
Методы ферментативного определения глюкозы основаны на реакциях окисления глюкозы или ее производных. К таковым реакциям относятся: окисление глюкозы до глюконо - 8 - лактона под действием глюкозооксидазы (КФ 1.1.3.4) окисление глюкозы до глюконо- 8 -лактона под действием NAD-зависимой глюкозодегидрогеназы (КФ 1.1.1.47) окисление глюкозо-6-фосфата до 6-фосфоглюконата под действием NADP-зависимой глюкозо-6-фосфатдегидрогеназы (КФ 1.1.1.49). В этом методе глюкоза предварительно подвергается фосфорилированию под действием гексокиназы (КФ 2.7.1.1) или ацетилфосфат-Д-гексозофосфотрансферазы (КФ 2.7.1.61).
Самое широкое распространение получили ферментативные методы определения глюкозы, основанные на реакции, катализируемой глюкозооксидазой. Варианты этого метода рассмотрим ниже и для удобства изложения разделим их на два класса, отличающихся между собой способом регистрации реакции. Спектрофотометрические методы Глюкозооксидаза катализирует реакцию окисления глюкозы кислородом по схеме: B-D-глюкоза + 02 — глюконо- 5 -лактон + Н202 (1А.7)
За исключением перекиси водорода никакой другой компонент данной реакции не поглощает в видимой или ультрафиолетовой областях спектра. Однако, из-за низкого значения молярного коэффициента погашения для Н202 (s23o = 72,7 М"1 cm 1) [George 1953] и поглощения в этой области спектра белками, нуклеиновыми кислотами, стероидами и другими соединениями спектрофотометрическая индикация данной реакции по накоплению перекиси водорода практически не осуществима. Поэтому, большинство спектрофотометрических методов определения глюкозы с помощью глюкозооксидазы основано на использовании вторичной индикаторной реакции, субстратом в которой является перекись водорода.
При спектрофотометрическом завершении анализа в качестве индикаторных могут быть использованы реакции окисления различных соединений перекисью водорода - ферроцианида в кислой среде [Афанасьева и Щербухин 1975], метанола под действием каталазы (КФ 1.11.1.6) [Meiattini 1977], йодид-иона до йода под действием солей молибдена (VI) [Ware 1968] или хромогенных соединений под действием пероксидазы (КФ 1.11.1.7).
Разработано множество вариантов определения глюкозы с помощью двухферментной системы глюкозооксидазы и пероксидазы. В этом случае разнообразие вариантов обусловлено исключительно использованием различных субстратов пероксидазы:
Гликозилированные белки в оценке степени компенсации нарушения углеводного обмена
Первоначально казалось, что при наличие такого большого и разнообразного «ассортимента» диабетических нарушений, выявить те или иные функциональные изменения как следствие реакции гликозилирования того или иного биологически-активного соединения не составит особого труда, и будущий поток доказательств определялся исключительно расторопностью научных сотрудников. Однако, как это не редко бывает в жизни, оптимистические надежды по поводу главенствующей роли и исключительности процессов гликозилирования как причины развития осложнений СД, мягко говоря, себя не оправдали. Действительно, «чёрт сидит в деталях». Многочисленные попытки идентифицировать или изменить функциональные свойства каких-либо систем, активно вовлеченных в патогенез диабетических осложнений, под действием искусственной гипергликемии, приводили к отсутствию ярко-выраженного ожидаемого эффекта. Рассмотрим некоторые направления исследований в этой области.
Как уже отмечалось, кардиоваскулярные осложнения СД являются основной причиной смертности пациентов. С целью проверки предположения о существенном влиянии процессов гликозилирования на развитие этой патологии при диабете были проделаны опыты на крысах, находившихся в состоянии гипергликемии 12 недель, вследствие инициирования у них СД инъекцией стрептозотоцина [Ganguly et al., 1990]. Через указанный промежуток временни у подопытных животных развивались все характерные симпомы: существенно уменьшалась скорость кровообращения, кровяное давление в сердечной систоле, скорости сокращения и расслабления сердечной мышцы, в то время как диастолическое давление заметно увеличелось. Значительно уменьшалась также активность сарколеммальной Na ,К -АТРазы. Другими словами, налицо были все основные симпомы диабетической кардиопатии Однако, авторам исследования не удалось обнаружить никакого отличия в степени гликозилирования сакролеммальных белков или мембран, изолированных из подопытных и интактных животных. Авторы констатировали факт повышенного уровеня продуктов неферментативного гликозилирования в почках и мышцах, но не более того. Естественным и логичным выводом этих исследований явилось заключение об отсутствии какого-либо влияния процесса неферментативного гликозилирования на развитие диабетической кардиомиопатии.
Микроангеопатии при СД характеризуются специфическими структурными изменениями, которые проявляются в утолщении базальных стенок капилляров. Следствием морфологических изменений является нарушение функциональных свойств микрососудов, что проявляется, в частности, в снижении реактивности сосудистой стенки в ответ на различные раздражители. Так, например, по результатам одного исследования [Fortes 1983] для того, чтобы нейтрализовать вазаконстрикторное действие норадреналина на сосуды крыс с аллоксаноым диабетом, дозы гистамина и брадикинина прошлось увеличить в 20 раз. Причем, было продемонстрировано, что изменение реактивности сосудов было связано исключительно со свойствами эндотелия - если эндотелиальный слой удалить, то реакция на норадренолин становилась сравнимой с таковой у здоровых животных. Вполне естественно, что вследствие «нароста» эндотелиального слоя стенки микрососудов при гипергликемии также теряют свою эластичность, что в свою очередь ведет к гемореологическим или тромболическим осложнениям. Возникает естественный вопрос: «За счет каких процессов происходит образование этого «нароста» ».
Известно, что структурной основой кровеносных сосудов является коллаген. Этот фибрилярный белок характеризуется большой продолжительностью жизни in vivo и вследствие этого наиболее подвержен неблагоприятному воздействию глюкозы в периоды гипергликемии у больных СД [Schindler & Kohn 1980; Галенок и др., 1989]. Содержание продуктов глубокого гликозилирования в коллагене у больных СД по различным данным может превышать в 5 - 13 раз аналогичный показатель у здоровых [Brown et al., 2005; Monnier et al., 2005]. Изменяются в целом и физико-химические параметры гликозилированного белка, что, в частности, может проявляться, например, в пигментации кожы [Monnier & Cerami 1981] или в снижении эластичности белка.
Таким образом, безусловно, изменение свойств коллагена в результате его гликозилирования оказывает влияние на развитие микроангеопатии, однако, оценить конкретный вклад этого процесса на основании данных литературы не представляется возможным.
Важно подчеркнуть, что если концентрация гликозированного коллагена в экспериментальных исследованиях на животных может существенно превышать нормальные значения, то мозговая ткань, к примеру, остается без изменений [Brown et al., 2005]. В то время как известно, что именно среди больных СД нарушения мозгового кровообращения является частым явлением. В целом же, нарушение микроциркуляции - одно из наиболее характерных диабетических осложнений. Заметим, что к системе микроциркуляции крови относят сосуды, диаметр которых сравним с диаметром эритроцита. Поэтому, микроциркуляция зависит по меньшей мере не только от эластичности сосудистой стенки, но и реологических свойств крови. В свою очередь, реологические свойства крови зависят от объемной концентрации эритроцитов - гематокрита, который и определяет вязкость крови у здоровых людей. Коэффициент корреляции между логарифмом вязкости крови и гематокритом в норме близок к 1. Величина стандартного гематокрита составляет 45%. При СД коэффициент корреляции между логарифмом вязкости крови и гематокритом может снижаться до значения 0,6, а величина гематокрита довольно часто изменяется [Галенок и др. 1987; Выдиборец 1990; Kamada et al., 1990]. Вязкость плазмы больных СД может также существенно превышать нормальные значения, особенно у лиц с ярко-выраженными осложнениями. Однако, при скомпенсированном диабете значения вязкоти крови или плазмы мало отличаются от нормы [Schut et al., 1992; Chong-Martinez et al., 2003] и глюкоза не обладает ярко выраженными патогенным влиянием на свойства мембран эритроцитов.
Поиск «гуанидинового яда» и оценка потенциальной патологической роли метилглиоксаля в развитии диабетических осложнений
Энергетические потребности организма в условиях стагнации углеводного метаболизма удовлетворяются преимущественно за счет жирового обмена. С другой стороны, развитие диабетических осложнений и уровень их тяжести прямо пропорциональны длительности и уровню декомпенсации заболевания. Поэтому, поиск соединения, свойства которого удовлетворяли бы указанным выше требованиям, изначально осуществлялся среди промежуточных метаболитов процесса кетогенеза. Первым и главным кандидатом на эту роль претендовал ацетоацетат. Основаниями для такого предположения явились следующие обстоятельства. Как известно, основным промежуточным продуктом метаболизма жирных кислот является ацетил-СоА. В условиях вынужденной ограниченности потребления глюкозы два из трех путей метаболизма ацетил-СоА практически блокированы, а именно -цикл Кребса и ресинтез жирных кислот. В такой ситуации утилизация ацетил-СоА происходит за счет усиления биосинтеза холестерина и ацетоацетата. Вот почему концентрация последнего у больных СД независимо от степени компенсации болезни, числа инъекций инсулина или приема сахароснижающих препаратов всегда превышает норму [Harano et al., 1984]. Кроме того, многократное, в течение длительного времени введение ацетоацетата подопытным животным инициирует у них диабет, повреждает сосуды и вызывает характерные для данного заболевания многочисленные метаболические нарушения [Nath & Brahmankar 1962; Constantinides & Kiser 1981]. Имелся также целый ряд неявных указаний на возможность вовлечения высоких концентраций ацетоацетата в различные процессы взаимодействия с гуанидиновой группировкой. Так, например, известны многочисленные примеры реакции гуанидинсодержащих соединений с эфирными производными ацетоацетата. Однако, в этих реакциях производные ацетоацетата скорее всего выступали в роли хоть и слабых, но дикетонов.
С другой стороны, нельзя было также исключить возможность реакции ацетоацетата как кетокислоты с первичными аминогруппами белков [Laios et al., 1993]. Никто и никогда не обсуждал последствия протекания этой реакции in vivo из-за её крайне низкой скорости. Однако, в связи с открытием фермента, существенно ускоряющего этот процесс [Гулый и др., 1989], сложившиеся представления могли бы в корне измениться Словом, длительный поиск „гуанидинового" яда, накопление которого, являлось бы характерным процессом для диабета, мог окончиться безрезультатно, если бы не серия статей начала 80-х [Harrison & Saeed 1981, 1983]... В названных работах было продемонстрировано, что продуктом ферментативного окисления ацетоацетата под действием миелопероксидазы является метилглиоксаль - соединение, как было уже указано выше, способное специфически и эффективно взаимодействовать с гуанидиновой группировкой аргинина. Таким образом, получалось, что искомым соединением скорее всего является не ацетоацетат, а продукт реакции его окисления. В правильности сделанного вывода нас поддержали работы других исследователей, также указывавших на принципиальную возможность участия метилглиоксаля в развитии сосудистых осложнений при сахарном диабете [Kalapos 1992; Thornalley et al., 1989].
Нами было впервые продемонстрировано, что метилглиоксаль способен инактивировать АТ-Ш и С1-ИНГ. Наиболее вероятной причиной инактивации является модификация аргининовых остатков активных центров указанных молекул.
Полученные значения констант скоростей реакций инактивации АТ-Ш и С1-ИНГ под действием метилглиоксаля позволили приблизительно оценить степень влияния этих процессов in vivo. Оказалось что при концентрации МГ 5 цМ время, в течение которого произойдет ингибирование 50% всего пула АТ-Ш (ті/2 90 час) практически совпадает с временем его полувыведения из организма [Tengborn et al., 1981]. С учетом того, что реакция модификации С1-ИНГ под действием диальдегида протекает несколько медленнее чем с АТ-Ш, а период полувыведения С1-ИНГ из организма составляет от 24 до 48 часов [Quastel et al., 1983], можно заключить, что чисто формально это соединение не может оказывать in vivo какое-либо существенное влияние на активность С1-ИНГ и АТ-Ш. Следовательно, вклад метилглиоксаля в процесс порчи С1-ИНГ и АТ-Ш in vivo возможен, но при существенно более высоких его концентрациях, отражающих по всей видимости уровень компенсации СД. Либо процесс одновременной инактивации указанных серпинов должен происходить под действием гораздо более мощного, и не уступающего в специфичности, эффектора чем метилглиоксаль.
