Содержание к диссертации
Введение
1. Процессы свободнорадикальной патологии в биологических системах 6
1.1. Механохимические аспекты травматических повреждений 7
1.2. Роль антиоксидантов в регуляции процессов пероксидного окисления липидов 14
2. Материалы и методы исследования 35
3- Синдром мембранной патологии при импульсных динамических воздействиях на организм 45
3.1. Интенсивность пероксидного окисления липидов, корригирующая роль антиоксидантов 46
3.2. Изменения структуры мембран форменных элементов крови и функциональной активности мембраносвязанных ферментов 54
3.3. Метаболически активные парамагнитные центры внутренних органов 61
4. Избыточное кровенаполнение внутренних органов и выживаемость животных при импульсных динамических воздействиях 67
5. Роль монооксида азота в коррекции процессов мембранной патологии 86
Выводы 105
Заключение 107
- Роль антиоксидантов в регуляции процессов пероксидного окисления липидов
- Синдром мембранной патологии при импульсных динамических воздействиях на организм
- Изменения структуры мембран форменных элементов крови и функциональной активности мембраносвязанных ферментов
- Роль монооксида азота в коррекции процессов мембранной патологии
Введение к работе
Исследование молекулярных механизмов передачи и трансформации кинетической энергии импульсных динамических воздействий (ИДВ) в биологических объектах является актуальной фундаментальной и научно-прикладной проблемой.
Фундаментальную значимость этой проблемы трудно переоценить, если принять во внимание, что к ИДВ относятся разнообразные поражающие факторы боевого оружия, травматогенный потенциал которых связан с быстрой передачей биообъекту большого количества энергии. К их числу наряду с баллистическими ранящими снарядами относятся воздушные ударные волны (ВУВ), интенсивные акустические колебания (ИАК), импульсы лазерного и корпускулярного излучения и.т.д.
Открытие механохимических свободнорадикальных процессов повреждения биоструктур привело к значительному расширению знаний о метаболических изменениях в тканях вокруг пулевого канала и позволило по-новому рассматривать механизмы передачи и трансформации энергии при ИДВ.
Эти механизмы включают элементарные механохимические реакции в конденсированных средах, при которых скорость разрыва химических связей с образованием свободных радикалов возрастает при увеличении приложенной внешней нагрузки.
Сам факт образования свободных радикалов при действии огнестрельных ранящих снарядов впервые установлен с использованием спин-индикаторов и метода ЭПР. Обработка ран антиоксидантами, способными связывать возникающие при огнестрельных ранениях химически активные радикалы, приводит к торможению развития свободнорадикальных процессов поражения биоструктур.
Установлено, что при огнестрельных ранениях и действии ВУВ травматические последствия сопровождаются повреждениями биологических структур по оксидативному типу на разных уровнях их организации. В зависимости от природы действующего фактора количественную оценку тяжести травматических повреждений можно осуществить по размеру зоны вторичного некроза при огнестрельных ранениях, уровню кровенаполнения внутренних органов при баротравме или воздействии акустических колебаний, а также по изменению структуры биомембран и активности мембраносвязанных ферментов, снижению содержания метаболически активных парамагнитных центров, а в ряде случаев и по выживаемости экспериментальных животных.
Совокупность эффектов повреждающего действия ИДВ на живые организмы главным образом реализуется на уровне биологических мембран и объединяется понятием мембранной патологии, а в целом характеризует травматогенный потенциал действующего фактора. Это происходит на фоне интенсификации пероксидного окисления липидов (ПОЛ), снижения активности ферментов антиоксидантной защиты клеток, уменьшения содержания природных антиоксидантов и модуляторов антиоксидантного статуса. Перечисленные здесь показатели мембранной патологии характеризуют антиоксидантныи статус в целом, а также позволяют объяснить наблюдаемые в эксперименте мембранопротекторные свойства антиоксидантов и предположить наличие регуляторной взаимосвязи между антиоксидантным статусом и степенью повреждения организма, т.е. травматогенный потенциалом воздействия. Применительно к молекулярным механизмам ИДВ эта проблема является весьма актуальной, хотя ее отдельные аспекты остаются мало изученными.
Для выполнения такого комплекса работ необходимо использование широкого арсенала современных физических методов исследования функционального состояния поврежденных тканей. В первую очередь это относится к методам радиоспектроскопии, позволяющим исследовать первичные метаболические нарушения в тканях и охарактеризовать физико химическую сущность патологических процессов при баротравматических повреждениях органов и тканей.
С целью установления взаимосвязи между степенью повреждения организма и антиоксидантным статусом при травматогенных импульсных воздействиях были поставлены следующие задачи:
1) на разных морфо-функциональных уровнях организма количественно охарактеризовать эффекты фармакологической коррекции биоантиоксидантами баротравм возникающих при воздействии ВУВ или интенсивных акустических колебаний;
2) изучить влияние синтетических биоантиоксидантов на показатели антиоксидантного статуса крови: активность супероксиддисмутазы, содержание церулоплазмина и трансферрина в крови;
3) охарактеризовать возможную роль N0 при поражающем действии ВУВ и изучить фармакологическое действие нового бифункционального антиоксиданта, содержащего оксиароматический фрагмент и группировку-донор монооксида азота.
4) выявить корреляционные соотношения между показателями травматогенного потенциала воздействия и антиоксидантным статусом организма.
Прикладной аспект этих работ связан с открывающимися возможностями использования ингибиторов свободнорадикальных реакций в качестве лекарственных средств и исследования профилактического применения антиоксидантов при повреждающем действии различных ИДВ.
Роль антиоксидантов в регуляции процессов пероксидного окисления липидов
Выяснение роли и механизмов окислительных процессов, протекающих в клетках и тканях организмов, явилось выдающимся шагом вперед в познании сущности химических процессов, лежащих в основе жизнедеятельности. Пероксидная теория окисления была впервые сформулирована НА. Бахом в 1897 г. Следующим шагом было открытие существования свободных радикалов. Открытие свободнорадикальных процессов привело к возникновению новой науки - химической физики, а затем кинетики химических и биологических процессов. Н.Н. Семеновым и Н.М. Эмануэлем была разработана теория цепных реакций свободнорадикального окисления в газовых и жидких фазах. Исследования школ Б.Н. Тару сова и Н,М. Эмануэля показали, что цепные процессы могут развиваться в липопротеиновой фазе клеточных структур и приводить в заключительной стадии к разрушению фазовых границ и к гибели клетки [33, 34]. Эти работы открыли новую главу в современной молекулярной биологии и биофизике - учение о свободнорадикальных неферментативных процессах окисления липидов биологических мембран в норме и при патологии. Канадским физиологом и фармакологом Г. Селье было создано учение о стрессе [35, 36]. Начали накапливаться данные об активации пероксидного окисления не только при лучевом поражении, которое можно рассматривать как частный случай стресса, но и при стрессах самой разной природы, вызванных воздействием ультрафиолетовой радиации, высокой и низкой температур, гипероксии и гипоксии, физических нагрузок и их отсутствия психических напряжений и т.д Инициирование процессов ПОЛ in vivo способны осуществлять различные интермедиаты восстановления молекулярного кислорода (ИВК), в первую очередь супероксидный анион-радикал. Это простейший интермедиат восстановления молекулярного кислорода, связанный с переносом на молекулу Ог одного электрона. Другие ИВК включают гидропероксидный радикал (HCV), гидроксильный радикал (НО ), пероксидные радикалы (RO2 ), а также нерадикальные продукты восстановления О2 (Hi02j ROOH, R-0-0-R и др.). Применительно к теме данного обзора следует отметить, что при поглощении энергии упругих колебаний жидкими средами или при воздействии на них тех или иных высокоэнергетических импульсных факторов происходит явление кавитации. Известно, что в кавитационных полостях происходит диссоциация молекул воды с образованием атомов водорода, сольватированных электронов, гидроксильных радикалов и пероксида водорода. Одним из примеров биологической целесообразности генерации активных форм кислорода in vivo является фагоцитоз.
При этом мембранос вязанная НАДФ-оксидаза продуцирует Ог" и Н2О2 непосредственно, а НО вторично в процессе так называемого «респираторного взрыва» [37]. Другой активированный фермент -миелопероксидаза нейтрофилов и моноцитов генерирует окисленные галогениды, используя Н202. [38] Для защиты от ИВК нейтрофилы содержат каталазу и глутатионпероксидазу. Активация нейтрофилов наблюдается при различных проявлениях некроза ткани, в том числе при микроинфарктах [39]. Также значительное количество свободных радикалов образуется в эндоплазматическом ретикулуме гепатоцитов и других клеток при метаболизации ксенобиотиков, а также при многих других ферментативных реакциях в качестве нестойких промежуточных продуктов [38]. Бронхоконстриктивные заболевания легких, сопровождающиеся хроническими воспалительными процессами, являются другой важнейшей патологией, роль ИВК при которой достаточно велика. В ходе развития хронических обструктивных заболеваний легких генерацию ИВК способен инициировать гистамин [40]. Усилением генерации ИВК сопровождаются приступы бронхиальной астмы, причем обнаруживается параллелизм между тяжестью астматических приступов и генерацией нейтрофилами ИВК и интенсификацией ПОЛ. Участие свободнорадикальных процессов в сердечно-сосудистой патологии в настоящее время не оставляет сомнений. Показано усиление процессов ПОЛ в ишемизированном миокарде. Повреждающее действие ИВК усиливается при снижении активности ферментов антиоксидантнои защиты тканей и при накоплении лейкоцитов в зоне воспаления [43]. Активация процессов ПОЛ при ишемии может осуществляться за счет нарушения кислородного обеспечения организма: при гипоксии и последующей реоксигенации [41] В то же время, активность СОД, глутатионпероксидазы в ишемизированной области снижается уже в первые минуты ишемии и сохраняется в течение всего периода эксперимента по ишемии миокарда [42]. В постишемический период чувствительность органов к физиологическому или избыточному содержанию кислорода повышена, отмечается активация ПОЛ, несколько снижающаяся при введении различных антиоксидантов [43.]. При повышенном содержании кислорода в раннем репер фузионном периоде наблюдается неполное восстановление органного кровотока. В ишемизированных органах животных ингаляция газовой смесью, обогащенной кислородом, усиливает процессы ПОЛ, в то время как гипоксическая газовая смесь снижает их интенсивность [44, 45]. Выше перечисленные данные позволяют говорить о свободнорадикальном механизме патогенеза при ишемической болезни Современные достижения в области физико-химической биологии во многом связаны с пониманием молекулярных механизмов функционирования клеток и субклеточных структур, в частности, биологических мембран. Особое место в таких исследованиях занимают работы, связанные с изучением структурно-функциональной роли липидов, как важнейших компонентов биомембран, а также развитием концепции о свободнорадикальных механизмах биологического окисления, в том числе и пероксидного окисления липидов (ПОЛ). Основополагающие работы в этой области выполнены исследователями школ Н.М. Эмануэля и Б.Н. Тару сова [33, 34]. В настоящее время свободнорадикальные механизмы процессов ПОЛ в живых системах рассматриваются с позиций теории ингибированного окисления органических соединений в жидкой фазе [47]. Общий ход процесса описывается рядом элементарных стадий, включающих зарождение, продолжение и обрыв цепей окисления [48]: (0)RH - R + я) зарождение цепи г ) продолжение цепи 2)RO; + RH-+ ROOR + R / 13)ROOH -» RO + ОН) разветвление цепи На этом этапе происходит постепенное увеличение количества активных радикалов, продолжающих цепь.
Наконец, в реальных условиях имеют место и события противоположного характера — обрывы цепей в результате взаимодействия (рекомбинации) радикалов между собой. 4)Л + Л - Л-Л \ 5)RO;+ir- ROOR \ 6)RO + ROl - нерадикальныепродукты \ _, обрыв цепи l)RO\ + InH - ROOH + Іп і 8)/и" + ROl -» нерадикальные лродукты І 9)In+In- In Irt j Образующиеся при рекомбинации продукты отдают избыточную энергию в виде квантов излучения. В зависимости от величины избыточной энергии излучаемый квант относится к инфракрасной, видимой и даже ближней ультрафиолетовой области спектра. Такое излучение квалифицируется как хемилюминисценция. Если частота обрывов цепи преобладает над частотой разветвлений, процесс пероксидного окисления прекращается. При обратном соотношении скорость окисления постепенно возрастает по мере увеличения количества активных продуктов и вовлечения в процесс растущего количества молекул субстрата. 110)/и + RH - InH + R } продолжение цепи В биомембранах субклеточных органелл свободнорадикальный процесс ПОЛ индуцируется фермент-зависимыми генераторами Н2О2 и супероксида. Известны специализированные ферменты (липоксигеназа, циклооксигеназа), осуществляющие ПОЛ в системах in vitro. Регуляторную функцию по контролю за содержанием липопероксидов и активных форм кислорода могут осуществлять антиоксидантные ферменты (глутатионпероксидаза, глутатион-Э-трансфераза, каталаза, супероксид-дисмутаза) и ингибиторы - биоантноксиданты различного типа [49, 50]. Как следует из приведенной выше схемы, тормозящее процесс окисления действие ингибиторов-биоантиоксидантов обуславливается двумя типами реакций. Один из них связан с разложением гидропероксидов, являющихся агентами, обеспечивающими разветвление процесса по реакции(З). По этому типу действуют серу содержащие органические соединения, металлокомплексы переменной валентности и, вероятно, ферменты утилизации липопероксидов. Показано, например, что в нативных тканях млекопитающих существует обратная корреляция между стационарной концентрацией липопероксидов и активностью антиоксидантных ферментов
Синдром мембранной патологии при импульсных динамических воздействиях на организм
На клеточном и молекулярном уровнях механизмы поражающего щ действия импульсных динамических воздействий (ИДВ) исследованы мало, хотя вполне очевидно наличие предела устойчивости живых клеток к механическим нагрузкам, а устойчивость определяется структурными характеристиками биологических мембран, зависящими от состава липидов. Вследствие этого степень поражающего действия ИДВ a priory должна зависеть от типа клеток и их физиологического состояния. Развиваемые в наших работах представления о молекулярных механизмах биологического действия механоакустических факторов на разные структурно-функциональные уровни живых организмов базируются на ключевой роли процессов ПОЛ и связанных с ними явлений мембранной патологии. Эти процессы, протекающие с участием свободных радикалов, сопровождаются изменением состава фосфолипидов, интенсивности их пероксидного окисления, а также изменениями структуры липидного матрикса биомембран и активности мембраносвязанных ферментов. В связи с этим представляют интерес данные о содержании двойных связей и наличии малонового диальдегида в липидах, антиокислительная активность липидов биомембран, активность ферментов антирадикальной защиты +, организма, а также влияние на эти показатели различных синтетических биоантиоксидантов или композиций на их основе. 1. Интенсивность пероксидного окисления липидов, корригирующая роль антиоксидантов. Импульсные динамические воздействия на организм характеризуются взаимосвязанными показателями пероксидного окисления липидов (ПОЛ), микровязкости липидного матрикса биомембран и активности мембраносвязанных ферментов. Совокупность этих показателей в сочетании с данными антиоксидантного статуса определяют синдром мембранной патологии. Предметом данной работы явилось изучение процесса ПОЛ _ (содержание МДА) и удельной активности Си, Zn-СОД в гомогенатах печени и головного мозга крыс и кроликов после различных ИДВ и при фармакологической коррекции полученных баротравм антиоксидантами. Интенсификация ПОЛ является неспецифическим компонентом стресс- # реакции на клеточном и молекулярном уровнях, участвующим в адаптационных перестройках метаболизма. Однако высокая интенсивность ПОЛ способна привести к нарушению структуры и функций биомембран, вызвать сдвиги метаболизма, антиоксидантного, иммунного, эндокринного статуса и превратить этот процесс из важного звена адаптивных перестроек в компонент патогенеза и стресса [114].
На субклеточном уровне изучена коррекция антиоксидантами показателей пероксидного окисления липидов мозга крыс при действии ВУВ и интенсивных акустических колебаний (ИАК). +1 Показано, что контузионное действие ВУВ в первые часы после воздействия сопровождается интенсификацией процесса ПОЛ. Это выражается в 50%-ном увеличении содержания малонового диальдегида (конечного продукта ПОЛ) и снижении степени ненасыщенности липидов в клетках головного мозга в среднем на 30% (рис. 2А и Б) Применение антиоксиданта из класса стабильных нитроксильных радикалов пипиридинового ряда приводит к снижению содержания продуктов ПОЛ (рисунок 2А) и увеличению содержания двойных связей в липидах мембран клеток головного мозга (рисунок 2Б). Также было показано, что после воздействия ИАК происходит активация процессов ПОЛ при одновременном увеличении активности СОД в гомогенатах мозга и печени экспериментальных животных (таблица 1). Интенсификация ПОЛ как при действии ВУВ, так и при ИАК подтверждает наше предположение о том, что на молекулярном уровне механизм баротравматических повреждений имеет свободнорадикальную природу. Таким образом, единый механизм повреждающего действия ВУВ и ИАК на различных уровнях организации организма, позволяет нам объединить эти воздействия под одним термином - импульсные динамические воздействия (ИДВ). Из данных таблицы 1 следует, что при акустическом воздействии интенсификация ПОЛ, характерная для синдрома мембранной патологии, отмечается только в гепатоцитах и клетках головного мозга крыс. Вместе с тем, в первый час после воздействия в клетках печени и головного мозга происходит увеличение содержания СОД. Однонаправленное изменение интенсивности ПОЛ и активности СОД находит объяснение только при вполне допустимом условии локализации МДА в липидах цитоплазматических мембран и нахождения Си, Zn-СОД в цитозоле. Поскольку при ИДВ содержание растворимой СОД меняется незначительно, то при выборе антиоксидантов для фармакологической коррекции последствий баротравмы основное внимание было уделено амфифильным соединениям с мембраннотропными свойствами. В этом плане наиболее интересен феноксан, 3,5-дитретбутил-4-оксифенильный фрагмент которого, обеспечивает его локализацию в липидном матриксе биомембран. Именно по этой причине было изучено его влияние на интенсивность ПОЛ. Из таблицы 2 видно, что предварительное использование феноксана снижало содержание МДА в клетках головного мозга крыс, подвергшихся воздействию ИДВ, до уровня нормы. В гепатоцитах крыс также наблюдалось заметное снижение содержания МДА, хотя полной нормализации интенсивности процессов ПОЛ не происходило. Нормализующее действие феноксана на содержание МДА в головном мозге отмечено также при воздействии ИАК на кроликов (таблица 3). Из данных таблицы 3 следует, что ИДВ приводит к снижению содержания МДА в печени кроликов при незначительном увеличении содержания СОД, как это было показано в таблице 1. Сопоставление результатов таблиц 2 и 3 приводит к заключению о наличии не только видовой (крысы, кролики), но и тканевой (головной мозг, печень) специфичности регуляции систем генерации и элиминирования свободных радикалов.
По нашему мнению однонаправленные изменения в этих системах характеристик ПОЛ и СОД можно рассматривать как одно из проявлений повреждающего эффекта ИДВ. Предварительное введение антиоксидантов оксиароматического ряда в эквимолярных дозах 3x10"5 М/кг за один час до воздействия ИАК избирательно вызывало изменения интенсивности ПОЛ и содержания СОД по сравнению с опытом (таблица 4). Так, введение крысам феноксана активирует СОД (таблица 4) и тормозит ПОЛ (таблица 2) по сравнению с опытом в головном мозге и в печени экспериментальных животных. Композиция феноксан+мексидол приводит ПОЛ в гомогенате мозга к уровню нормы (таблица 2). В печени этот эффект менее выражен. Введение ТОП нормализует содержание СОД, корректируя последствия воздействия. Композиция феноксана с топироксом значительно активирует СОД в мозге по сравнению с опытом и уменьшает, приводя к норме, активность СОД в печени (таблица 4). При баротравматических повреждениях вызванных ИДВ наблюдается разнонаправленное влияние антиоксидантов на изучаемые параметры оксидативного стресса в головном мозге и печени (табл.4 и 2, 3). Так, предварительное введение феноксана увеличивало активность СОД и тормозило процессы ПОЛ в головном мозге, но ингибировало СОД и активировало ПОЛ в печени, приближая значения интенсивности ПОЛ и активности СОД к норме. При предварительном применении композиции мексидол+феноксан наблюдалось увеличение активности СОД и ПОЛ в мозге кроликов, а в печени при активации СОД отмечалось торможение процесса ПОЛ до уровня несколько ниже нормы (табл.4 и 2, 3). Использование топирокса в композиции с феноксаном приводило к уменьшению активности СОД (таблица 4) и активации ПОЛ в мозге и печени (таблица 3), приближая их значения к норме. Таким образом, в эксперименте на кроликах более эффективными были феноксан и композиция феноксана с топироксом, которые нормализовали значения ПОЛ и СОД. При изучении коррекции интенсивности процессов ПОЛ протекающих в мозге и печени крыс наиболее эффективными были так же феноксан и композиция феноксан+мексидол. Одновременно с этим в крови на 40% и 45% увеличивается содержание белков острой фазы, церулоплазмина (ЦП) и трансферрина (ТФ) соответственно (таблица 5). Эти белки плазмы крови являются модуляторами антиоксидантного статуса.
Изменения структуры мембран форменных элементов крови и функциональной активности мембраносвязанных ферментов
Способность биоантиоксидантов выступать в качестве мембранопротекторов была изучена методом триплетных зондов в опытах по исследованию структуры биомембран форменных элементов крови после . интенсивных акустических воздействий на экспериментальных животных. Изменения в структуре мембран форменных элементов крови наблюдали по экспоненциальным кривым затухания фосфоресценции триплетного зонда эритрозина и аннигиляционной замедленной флуоресценции зонда пирена. Известно, что пирен локализуется во внутренних гидрофобных областях мембраны, тогда как эритрозин располагается, в основном, в приповерхностных полярных областях. В экспериментах измеряли среднее время жизни возбужденной лазерным импульсом молекулы зонда, зависящее от вероятности столкновения с молекулой тушителя. Данный показатель зависит от скорости диффузии зонда внутри мембранной матрицы, характеризуя, таким образом, микровязкость мембраны. Использование двух типов зондов позволяет одновременно характеризовать микровязкость внутренних гидрофобных сайтов мембраны (пирен) и внешних полярных областей (эритрозин). Из полученных данных (таблица 6) следует, что при действии ИАК на крыс в мембранах лейкоцитов снижается время жизни фосфоресценции молекул эритрозина относительно нормы с (2,45±0,07) 10 5 до (2,10±0,001) 10 5 с. Этот результат указывает на увеличение диффузионной подвижности зонда, вероятно, вследствие понижения микровязкости полярных сайтов мембраны. Было показано, что в результате применения антиоксидантов время жизни возбужденного состояния эритрозина увеличивается. Это соответствует снижению подвижности зонда в мембране, а, следовательно, и увеличению микровязкости мембран лейкоцитов в области полярных группировок фосфолипидов. Так из таблицы 6 видно, что введение ТОП приближает значения времен жизни возбужденного состояния эритрозина к норме, соответствующей возбужденным зондам, введенным в лейкоцитарные мембраны интактных животных. При использовании феноксана время жизни возбужденного состояния эритрозина, встроенного в мембрану лейкоцитов, превышает время жизни возбужденного зонда в нативной мембране на 16%. Как видно из таблицы 6, время жизни возбужденного состояния пирена в результате акустического воздействия увеличивается на 15% по отношению ко времени жизни замедленной флуоресценции пирена, встроенного в мембраны лейкоцитов интактных животных.
Этот факт свидетельствует о том, что увеличивается микровязкость гидрофобных сайтов лейкоцитарных мембран при действии ИАК. Фармакологическая коррекция с использованием феноксана и ТОП восстанавливает микровязкость неполярных сайтов мембран лейкоцитов практически до уровня нормы. При исследовании влияния ИАК на микровязкость мембран эритроцитов крыс (таблица 7) показано, что значения времен жизни возбужденных молекул триплетных зондов эритрозина и пирена в полярных и неполярных сайтах эритроцитарных мембран возрастают по сравнению со значениями времен жизни возбужденных состояний зондов, встроенных в мембраны эритроцитов интактных животных. Это свидетельствует об увеличении микровязкости как полярных, так и неполярных областей фосфолипидной мембраны эритроцитов в результате воздействия ИАК. В присутствии феноксана и ТОП микровязкость неполярных сайтов мембран несколько снижается, а полярных — увеличивается. Таким образом, при изучении влияния ИАК на форменные элементы крови были получены следующие данные. 1. Показано, что при воздействии ИАК уменьшается микровязкость полярных областей мембран лейкоцитов, а неполярных - увеличивается. Применение феноксана, и ТОП восстанавливает вязкость неполярных сайтов лейкоцитарной мембраны практически до состояния нормы. 2. После воздействия ИАК увеличивается микровязкость как полярных, так и неполярных областей эритроцитарных мембран.. Применение феноксана и ТОП приводит к увеличению микровязкости полярной и некоторому уменьшению неполярных областей мембран эритроцитов. Вышеперечисленные данные свидетельствуют об интенсификации процессов ПОЛ после акустического воздействия, что в свою очередь сопровождается изменением липидного состава биомембран и изменением их микровязкости. Изменения микровязкости биологических мембран неизбежно отражаются на активности мембраносвязанных ферментов, К числу таких ферментов относятся моноаминооксидазы (МАО). Изучалось влияние ИАК на каталитическую активность мембраносвязанных ферментов, осуществляющих окислительное дезаминирование биогенных аминов митохондриальной моноаминоксидазы А (МАО-А) и моноаминоксидазы В (МАО-В) головного мозга крыс и кроликов. Известно, что моноаминоксидазы являются важнейшими мембраносвязанными ферментами организма, осуществляющими процесс окислительного дезаминирования биогенных аминов. Показано, что МАО-А и МАО-В играют двойную защитную роль: защищая нейроны от эндогенных аминов, (тирамина, фенилэтиламина и триптамина), которые могут нарушать процесс нейропередачи, и предохраняя организм от действия токсических экзогенных аминов [115].
Термодинамика катализируемого МАО окисления аминов заключается в том, что амины с редокс-потенциалом около +1В окисляются кислородом с образованием пероксида водорода - редокс-потенциал +0,3 В - через редокс-пару FAD/FADH (потенциал которой обычно около -0,2 В). Известно, что накопление продуктов ПОЛ ведет к изменению каталитической активности МАО [116]. Интенсификация ПОЛ в мембранах митохондрий вызывает снижение активности МАО-А и МАО-В. Изменение каталитических свойств моноаминоксидазы может быть способом выявления окислительного стресса, который ассоциируется с различными патологическими состояниями, нарушающими нейромедиаторные процессы в центральной нервной системе. Обратимое снижение каталитической активности МАО обнаружено при многих патологиях, сопровождающихся активацией ПОЛ [117,118]. Такие изменения наблюдаются при облучении, злокачественном росте, гипервитаминозе D2 [119], в грануляционно-фиброзной ткани кожных ран [120], при гипероксии [121], туберкулезе [118], холодовом стрессе [1122], черепно-мозговой травме [115], гипоксии [123], экспериментальной гиперхолистеринемии [124]. Высказываются предположения о возможном патогенетическом значении модификации активности МАО при заболеваниях и, в частности, при атеросклерозе [125]. В свете сказанного можно утверждать, что интерес к исследованию МАО определяется ее важной ролью в процессах передачи нервных импульсов и способностью к изменению субстратной специфичности в условиях, способствующих накоплению липидных перекисей. Продукты реакции включаются в метаболизм, что обеспечивает непосредственную связь между функциональной активностью нервной системы и изменением каталитических свойств МАО. МАО является основным ферментом обмена катехоламинов и серотонина [126]. Поскольку нарушение мембранных структур является одной из первичных ответных реакций на экстремальные воздействия, мембранная локализация МАО определяет особую чувствительность этого фермента к различным патогенным факторам. Это обусловливает большое значение изучения изменений каталитических свойств МАО в механизмах ответной реакции организма на экстремальные воздействия. МАО-В помимо участия в обмене Р-фенилэтиламина (бензиламина) и метиламина, играет важную роль в регуляции действия симпатомиметических аминов и осуществлении детоксикационной функции печени и желудочно-кишечного тракта [116]. Изменение каталитических свойств МАО при экстремальных воздействиях происходит в результате влияния продуктов ПОЛ на митохондриальные мембраны [119]. Исходя из сказанного, становится понятным интерес к изучению изменения каталитической активности МАО-А и МАО-В при воздействии ИАК, вызывающих повреждение тканей печени и головного мозга.
Роль монооксида азота в коррекции процессов мембранной патологии
Известно, что монооксид азота (N0) участвует в регуляции тонуса кровеносных сосудов как антагонист адренергической системы, регулируя деятельность органов дыхательной системы, желудочно-кишечного тракта и мочеполовой системы. Отмечается влияние N0 на функционирование секреторных тканей и клеток [134]. Недавно стало известно о том, что NO участвует в регуляции систем внутриклеточной сигнализации. Наличие неспаренного электрона придает молекуле N0 способность к рекомбинации с другими свободными радикалами, в частности, с супероксидами, что может приводить к торможению первичных стадий инициирования свободнорадикального процесса ПОЛ.[135]. Растворимость монооксида азота в гидрофобной области клеточных мембран предполагает его участие в торможении цепных реакций ПОЛ [136]. Известно, например, что N0 также образует с ионами двухвалентного железа нитрозильные комплексы, препятствуя генерации гидроксильных радикалов [137]. На рисунке 12 представлена корреляция выживаемости животных и содержания парамагнитных динитрозильных комплексов негемового железа в печени. Видно, что с уменьшением количества нитрозильных комплексов снижается выживаемость. Это подтверждает важную роль монооксида азота при мембранной патологии вызванной баротравматическими повреждениями. Многообразие физиологических эффектов монооксида азота, в частности, его противоишемическое действие, явилось для нас основой для практического применения биоантиоксиданта (топирокса) гибридной структуры. Его азотистое основание представлено липофильным 2,4,6-триметил-3- оксипиридином, а кислотный фрагмент - нитроксиянтарной кислотой (донор монооксида азота). На приведенной схеме (рисунок 13) показано, что молекулы топирокса способны тормозить инициирование ПОЛ двумя путями. Оксиароматическая группировка нейтрализует пероксидные радикалы. Нитратный фрагмент молекулы при биотрансформации приводит к образованию монооксида азота, который связывается с супероксидрадикалами инициирующими ПОЛ. Основная роль СОД сводится к регуляции баланса между одно- и двух электронными формами восстановленного кислорода (Ог и Н2О2, соответственно). Поэтому в первую очередь было интересно выяснить, каким образом отражается на активности СОД предварительное введение нового гибридного антиоксиданта при ИДВ.
В таблицах И и 12 представлены результаты изменения активности СОД как ключевого фермента антирадикальной защиты в тканях крыс и кроликов. Из таблицы 11 следует, что применение топирокса статистически достоверно нормализует завышенную в опыте активность СОД клеток головного мозга крыс через один час после акустического воздействия. Предварительное введение композиций антиоксидантов до акустического воздействия приводило к увеличению активности СОД относительно опыта. Как следует из данных таблицы 11, введение топирокса также нормализует активность СОД в гепатоцитах крыс, корректируя последствия акустического воздействия, а композиция антиоксидантов феноксана и топирокса оказалась более эффективной, чем композиция феноксана с мексидолом. Исследования повреждающего действия ИДВ на кроликов и коррекция баротравм с помощью антиоксидантов подтвердили результаты, полученные при изучении ИДВ на крыс (таблицы 12). Из данных таблицы 12 следует, что повышенная после акустического воздействия активность СОД в клетках головного мозга и печени нормализуется при использовании топирокса и композиции феноксан+топирокс. Одновременно с активностью СОД в клетках головного мозга и печении изучали активность основных модуляторов антиоксидантного статуса крови - церулоплазмина и трансферрина (таблица 13). Как следует из данных таблицы 13, лучший фармакологический эффект также был получен при профилактическом использовании топирокса в качестве ингибитора радикальных реакций. Пероксидное окисление липидов определяли в митохондриях мозга кроликов и крыс после воздействия ИАК. На рисунке 14 представлены данные по содержанию малонового диальдегида в митохондриях мозга крыс после ИДВ и фармакологической коррекции. Как видно из данных представленных на рисунке 14, действие ИАК вызывает нарушение ПОЛ в митохондриях мозга крыс. Из этих результатов следует, что действие препарата топирокс приближает интенсивность ПОЛ к норме. Отмечено, что мексидол практически не ингибировал процессы ПОЛ после импульсного динамического воздействия, а образование конечного продукта - МДА оставалась выше уровня нормы. Таким образом, при акустическом воздействии происходит активация ПОЛ митохондрий мозга кроликов. Фармакологическая коррекция с применением топирокса приводит к торможению ПОЛ в митохондриях мозга крыс и кроликов, тогда как феноксан, мексидол активируют ПОЛ в митохондриях мозга крыс выше уровня нормы. Вышеперечисленные данные свидетельствуют о нарушении нормального течения процессов ПОЛ после акустического воздействия, что в свою очередь сопровождается изменением липидного состава биомембран, а, следовательно, изменением их микровязкости. Способность топирокса выступать в качестве мембранопротектора была изучена методом триплетных зондов в опытах по исследованию структуры биомембран форменных элементов крови после воздействия ИАК на экспериментальных животных. Данные отражающие структурные изменения мембран форменных элементов крови представлены на рис. 15. Было установлено, что время жизни молекул зондов эритрозина и пирена, а, следовательно, и микровязкость как полярных, так и неполярных областей эритроцитарных мембран после акустического воздействия увеличивается. Применение феноксана и ТОП приводит к уменьшению микровязкости неполярных областей мембран эритроцитов и увеличению полярных. Использование антиоксиданта с нитратной группировкой (топирокс) изменяет микровязкость мембран эритроцитов до уровня нормы как в полярной, так и неполярной областях. Таким образом, использование бинарного антиоксиданта топирокса приводит к уникальному эффекту, когда микровязкость мембран эритроцитов полностью нормализуется как в полярной, так и неполярной областях, чего не происходит при применении антиоксидантов без группировки - донора N0. Как следует из таблицы 14, применение антиоксидантов с нитратной группировкой (топирокс в присутствии феноксана) восстанавливает время жизни возбужденного зонда до значения, соответствующего норме.
При изучении влияния композиций антиоксидантов на эритроцитарные мембраны выявили, что в присутствии комплексов феноксан+топирокс и феноксан+мексидол уменьшается время жизни возбужденного состояния пирена до нормальных значений. Из проведенных исследований видно, что действие фармакологии уменьшает микровязкость неполярных областей эритроцитарной мембраны, причем для коипозиции феноксан+топирокс - до состояния нормы. Таким образом, из таблицы 14 видно, что в результате воздействия ИАК увеличивается вязкость полярных и неполярных сайтов эритроцитарных мембран. В результате предварительного применения биоантиоксидантов, особенно в случае топирокса и композиции феноксан+топирокс как в полярных, так и в неполярных сайтах эритроцитарной мембраны вязкость восстанавливается практически до уровня нормы. Феноксан и мексидол в меньшей степени, чем топирокс защищают мембраны эритроцитов от баротравмы. При изучении влияния композиций антиоксидантов на лейкоцитарные мембраны после воздействия ИАК получили результаты, приведенные в таблице 15. Предварительное введение композиций биоантиоксидантов феноксан+топирокс восстанавливает микровязкость полярных сайтов мембран лейкоцитов до уровня нормы, а в случае применения феноксана и композиции феноксан+мексидол микровязкость значительно увеличивается по сравнению с нормой. Использование в качестве мембранопротекторов феноксана и композиции феноксан+топирокс восстанавливает микровязкость неполярных сайтов лейкоцитарной мембраны практически до состояния нормы. А применение композиции феноксан+мексидол уменьшает время жизни возбужденного пирена в лейкоцитарной мембране, но его значение х превышало значение, соответствующее нормальной мембране. Т.е. вязкость мембраны в этом случае была несколько выше, чем в нативной мембране. Таким образом, при изучении влияния ИАК режима Вихрь большого объема и выраженной интенсивности на форменные элементы крови были получены следующие данные 1.После акустического воздействия увеличивается вязкость как полярных, так и неполярных областей эритроцитарных мембран.
