Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 30
2. Материалы и методы 35
2.1. Объект исследования
2.2. Подготовка животного к опыту 32
2.3. Замораживание-оттаивание изолированного мозга моллюска 33
2.4. Люминесцентная микроскопия
2.5. Исследование ультраструктуры 37
2.6. Культура in vitro 39
3. Результаты и обсуждение
3.1. Замораживание изолированного мозга прудовика до -196С и электрофизиологический контроль жизнеспособности нейронов после оттаивания 40
3.2. Изменение функциональной активности нейронов моллюска (люминесцентная микроскопия) 44
3.2.1. Изменение функционального состояния синтетического аппарата нейронов моллюска Lymnaea stagnalis L. при повышении температуры среды обитания от 4-6С до 20- 44 22С
3.2.2. Изучение изменения функциональной активности нейронов моллюска после криоконсервации 47
3.2.3. Люминесцентная микроскопия изолированного мозга при длительном инкубировании при +4. +6С(контроль) 51
3.2.4. Изменение функционального состояния синтетического аппарата (по параметру а) нейронов изолированного мозга моллюска при изменении температуры инкубирования изолированного мозга 52
3.3. Изучение изменений ультраструктуры нейрона МПЗ мозга моллюска после криоконсервации 55
3.3.1. Ультраструктура контрольных нейронов 55
3.3.2. Изучение изменений ультраструктурной организации эндоплазматического ретикулума после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от +20-22С до +4-6С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6С (в сравнении) 65
3.3.3. Изучение изменений ультраструктурной организации диктиосом комплекса Голъджи после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от 20-22С до 4-6С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6С (в сравнении)
3.3.4. Изучение изменений ультраструктурной организации митохондрий после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от 20-22С до 4-6 С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6С (в сравнении) 73
3.3.5. Изучение изменений ультраструктурной организации ядерной оболочки нейронов после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от 20-22С до 4-6С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6С (в -,-сравнении)
4. Исследование поведения в культуре in vitro нейронов криоконсервированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L 83
Заключение
Выводы
Приложение
Список литературы
- Замораживание-оттаивание изолированного мозга моллюска
- Изменение функциональной активности нейронов моллюска (люминесцентная микроскопия)
- Изучение изменений ультраструктуры нейрона МПЗ мозга моллюска после криоконсервации
- Изучение изменений ультраструктурной организации митохондрий после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от 20-22С до 4-6 С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6С (в сравнении)
Введение к работе
Сохранение жизнеспособных клеток, тканей, органов при глубоком замораживании (криоконсервация) в течение длительного времени (десятки лет) представляет собой современную проблему при создании многих биологических и медицинских технологий. Раскрытие основных механизмов перехода клеток в состояние обратимой остановки жизни и выхода из него связано с исследованием структурно-функциональных перестроек, осуществляющихся при этих переходах. В связи с этим изучение замораживания нервных клеток до ультранизких температур представляется весьма перспективным из-за возможности регистрации целостности клеточных мембран и рецепторов электрофизиологическими методами, возможности наблюдения за поведением криоконсервированных нейронов в культуре in vitro, а также благодаря возможности изучения поведения криоконсервированных трансплантатов нервной ткани в мозге животных. Несомненно, что в сочетании с гистохимическими, ультрамикроскопическими, иммунологическими и другими методами изучение криоконсервации нервных клеток (нервной ткани) внесет существенный вклад в понимание механизмов криоповреждений и криозащиты в процессе глубокого замораживания.
Интерес к проблеме криоконсервации нервной ткани имеет как научно-фундаментальный характер, так и прикладной в связи с необходимостью создания крио банка трансплантатов нервной ткани для медицинских целей (Frodl et all, 1994; Robbins et all, 1990; Sauer et all, 1992; Brunet et all, 2003). Первые результаты по выживанию ткани мозга цыпленка после замораживания до температуры -196С были опубликованы в 1953 г. (Luyet, Gonzales, 1953). Позднее, в 1980 г., было показано, что нервная ткань эмбриона млекопитающих переживают замораживание до -90С при хранении в течении 18 недель. Далее можно привести ряд работ, в которых эмпирически подобранные режимы замораживания и использование традиционных
криопротекторов (диметилсульфоксид, глицерин) позволили с разной степенью сохранности заморозить ткань мозга крыс и приматов, в том числе человека (Sckott et all, 1986; Silani et all, 1988), культуру нервной ткани (Kawamoto, Barret, 1986; Petite, Calvet 1997; Sckott et all, 1986). В изучение прошедших замораживание нейронов входило тестирование жизнеспособности и описание морфологической сохранности, роста отростков в культуре in vitro, состояния рецепторов, синтеза медиаторов, восстановления электрической активности, приживляемости трансплантатов в мозге животных (Jensen et all, 1985; Sckott et all, 1986; Sucher et all, 1992). Успех криоконсервации в значительной степени зависел от возраста донора, скоростей замораживания-оттаивания, химической природы и концентрации криопротектора. Несмотря на актуальность проблемы, введение в практику нейромедицины методов криоконсервации, пока не получило развития в основном из-за непредсказуемости результатов, обусловленных недостаточностью сведений о механизмах криоповреждений и путей криозащиты.
Нейроны и нервы позвоночных и беспозвоночных животных благодаря свойствам электровозбудимых мембран и хорошо отлаженным способам регистрации электрической активности используются для исследований механизмов действия криопротекторов и низких температур (Pribor, Nara, 1969; Lenz et al., 1975; Menz, 1975; Scott and Lew, 1986; Гахова и др., 1989; Frodl et al., 1994; Чекурова, 1994; Kislov et al., 2000).
В ряде работ, выполненных на нейронах и аксонах позвоночных и беспозвоночных животных, показано, что после криоконсервации в присутствии защитных агентов восстанавливаются электрические параметры нейрональных мембран (Asher, 1972; Pasic, DesaFaria, 1979; Гахова и др., 1989; Sucher et al., 1991; Decherchi et al., 1997; Gakhova et al., 1997). Однако сохранение электрических свойств нейрональных мембран после криокон-сервирования нейронов не может быть единственным показателем жизнеспособности клеток. Раскрытие основных механизмов перехода клеток в недеятельное состояние при глубоком замораживании и выхода из него сопря-
жено с изучением структурно-функциональных перестроек, осуществляющихся при этих переходах. Для нервной ткани, состоящей из высокоспециализированных клеток с внутриклеточной формой регенерации, изучение компенсаторно-приспособительных процессов, как результата воздействия криозащитных агентов и низких температур, имеет особое значение. В то же время работ по исследованию последствий криоконсервации на внутриклеточные структурные и метаболические свойства нейронов незначительное число, закономерности репарации клеточных структур после низкотемпературного воздействия до настоящего времени окончательно не выяснены и требуют дальнейших исследований. В этой связи комплексное изучение морфо-функциональных свойств нейронов на модельных объектах (например, нейронах беспозвоночных) представляется весьма актуальной задачей, поскольку это позволит не только определить области крио-повреждений и в значительной степени прогнозировать степень восстановления, но и оценить возможности повышения криорезистентности нейронов с помощью модификации криопротектирующих сред.
Целью данной работы было изучить восстановление структуры и функции нервных клеток после криоконсервации на примере идентифицированных нейронов МП1 и МПЗ изолированного мозга моллюска Lymnaea stagnalis L. Для выполнения этой цели были поставлены следующие задачи:
Выяснить характер повреждений и нормализации структуры и функции нейронов после замораживания-оттаивания методами электронной и люминесцентной микроскопии.
Оценить степень влияния криопротектора на структуру и функцию нейрона (методами электронной и люминесцентной микроскопии)
Изучить способность криоконсервированных нейронов формировать отростки в культуре in vitro
Замораживание-оттаивание изолированного мозга моллюска
Моллюсков собирали в естественных водоемах обитания осенью при установлении устойчивой холодной погоды и до опыта содержали при 4С в термостатируемой комнате. Ранее было выяснено (Гахова с соавт., 1989), что замораживание до -196С лучше переносит мозг активных животных, содержащихся при 18-20С. Т.е., моллюсков, которые активно питаются и двигаются. Проведенная работа (Карнаухова, Сергиевич, Дмитриева и др., 2002) по изменению интенсивностей флюоресценции нейронов изолированного мозга, (определенная с помощью люминесцентного красителя акридинового оранжевого), показала диапазон функционально обусловленных изменений синтетической (функциональной) активности нейронов по параметру а при нагревании среды обитания животных и время (2 суток), через которое наблюдался выход на плато средних значений функциональной активности по параметру а при содержании животных при 18-20С, Т.е., мы после сохранения моллюсков при 4С в термостатируемой комнате помещали их при комнатной температуре (18-20С) на двое суток (подробно эта работа освещена в главе 3). Этих животных использовали в эксперименте (согласно приведенной схеме, рис.2). 2.3. Замораживание-оттаивание изолированного мозга моллюска Изолированный мозг моллюска замораживали в парах жидкого азота до 196С, со скоростью 380-450С/мин. В качестве криопротектора использовали диметилсульфоксид (ДМСО) в концентрации 1,8 - 2,1М. Материал сохраняли в жидком азоте от 1 месяца до 2 лет. Оттаивание осуществляли на водяной бане при 22-24С со скоростью 380-450С/мин. Скорость замораживания-оттаивания измеряли при помощи медно-константановых термопар с компьютерной регистрацией данных.
Для осмотического уравновешивания внутриклеточной среды с наружным раствором добавление и отмывание криопротектора осуществляли постепенно (Kislov et all, 2000). После оттаивания и отмывания криопротектора для изучения восстановления структуры и функции мозг помещали в физиологический раствор следующего состава (в мМ): NaCl-80; KCl-1,6; MgCb -1; СаСІг-2, буфер Hepes, рН-7,5; и затем инкубировали при 4-6С (Е) согласно схеме эксперимента (рис. 2). Для изучения влияния замораживания-оттаивания и ДМСО изолированный мозг моллюска фиксировали для электронной и люминесцентной микроскопии в каждой из экспериментальных точек согласно схеме эксперимента. В качестве контроля использовали изолированный мозг, инкубированный в физиологическом растворе при тех же временных и температурных режимах, что и в эксперименте, но не подвергавшийся замораживанию в жидком азоте и воздействию ДМСО. Для оценки правильности выбранного режима замораживания-оттаивания (скорости замораживания-оттаивания и отмывания криопротектора), жизнеспособность нейронов после криоконсервации была оценена по морфологическим и электрофизиологическим характеристикам. Морфологические характеристики оце нивали визуально, обращали внимание на общий внешний вид, равномерность распределения пигмента по клетке, интенсивность окраски. -Ф і В (20мин) С D (50мин) Е (2ч20мин) F(5450MHH)G(8450MHH)H Измерение электрических характеристик мембран. Измерение электрических параметров цитоплазматической мембраны клеток осуществляли при помощи стандартных микроэлектродных методов (Приборы и методы для микроэлектродного исследования клеток, 1975) Методом микроэлектродного отведения потенциала были определены мембранный потенциал, потенциал действия, ответ на ацетилхолин криоконсервированных нейронов. Для исследования функционального состояния клеток был использован метод, основанный на окраске препаратов флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым (АО). Клетки флуоресцируют в красной (цитоплазма) и зеленой (ядро) области спектра (рис. 3). Димеры АО, связанные с односпиральными участками РНК, флуоресцируют в красной области спектра 164о-
Мономеры АО, интеркалированные в двухспиральные участки РНК, флуоресцируют в зеленой области спектра 15зо (рис. 3). Соотношение полос излучения І64(/І530» обозначенное как параметр а (a=I64o/Ij3o), отражает соотношение одно- и двухспиральных участков РНК в цитоплазме и в связи с этим используется нами в качестве показателя функциональной активности клетки (Карнаухов, 1978; Карнаухов, 2001; Гордон и др., 1989; Сергиевич и др., 2002; Карнаухова, Сергиевич, Дмитриева и др., 2002). Мозг пресноводного моллюска Lymnaea stagnalis изолировали согласно схеме эксперимента (рис.2) и фиксировали смесью Карнуа (этанол : хлороформ : ледяная уксусная кислота - 6 : 3 : 1) 30 минут при соответствующих температурах (Бродский, 1960). Затем обезвоживали в спиртах и заливали в парафиновые блоки. Блоки резали на микротоме на 7 мкм срезы. Срезы депарафинировали смесями ксилол-спирт, выдерживали в цитрат-фосфатном буфере 4 минуты (рН 4,2) и окрашивали в течение 10 минут флуоресцентным красителем акридиновым оранжевым (10"5М, SIGMA, США) приготовленном на том же буфере. После отмывания срезов в буфере (по 5 минут), окрашенные срезы исследовали методом микроспектрального флуоресцентного анализа с использованием двухволнового микрофлуориметра "Радикал ДМФ-2" (МП "Радикал", Россия) (Карнаухов и др, 1983; Карнаухов и др 1987; Карнаухов, 2001). Специальная программа "Микрофлуор" позволяет получать гистограммы распределения интенсивностей флуоресценции в красной и зеленой областях спектра, а также параметра а = 1б40 530 исследуемых клеток в течение 15-20 минут с выводом точек на фазовую плоскость и статистической обработкой данных с использованием t-критерия Стьюдента. Измерения флуоресценции препарата проводили отдельно для ядер и цитоплазмы, с помощью зонда диаметром 7мкм. Изучение флуоресценции ядер не выявило каких-либо заметных изменений, поэтому все основные измерения были выполнены по результатам регистрации люминесценции цитоплазмы. Для исследования специфичности окрашивания рРНК в нейронах моллюска депарафинированные срезы инкубировали в растворе кристаллической рибонуклеазы А (1,0 мг/мл при 37С в течение 30 минут, SIGMA, США) в забуференном физиологическом растворе (рН 7,5). После окрашивания АО этих препаратов люминесценция в красной области спектра
Изменение функциональной активности нейронов моллюска (люминесцентная микроскопия)
Функциональное состояние нейронов связано с уровнем синтетических процессов в клетке. Показано, что изменение метаболизма РНК в нейронах зависит от физиологического состояния животных и меняется при различных видах экспериментально вызванной активности (Бродский, 1966; Карнаухов, Вартонь, 1971; Бочарова, 1973; Мельникова, Карнаухов, 1980). Также были получены данные, свидетельствующие о том, что нейроны моллюсков, находящихся в активном состоянии при 18-20С, переживают криоконсервацию значительно успешнее, чем нейроны моллюсков, которые были взяты в эксперимент из условий их хранения при +2..+4С (Гахова и др, 1989). Для того, чтобы иметь в экспериментах стандартный материал, необходимо было выяснить через какой промежуток времени при нагревании среды содержания животных достигается тот уровень синтетической (функциональной) активности нейронов, который можно считать физиологически обусловленным, и который сможет обеспечить устойчивость нейронов к замораживанию. Также необходимо было выяснить физиологически обусловленный диапазон изменений синтетической активности по параметру а относительно 4С контроля. С этой целью исследовали температурную зависимость синтетической активности нейронов прудовика при увеличении температуры среды содержания животных. При проведении экспериментов моллюсков помещали в среду, которую нагревали до 22С в течение суток. Через 0.5, 1.5, 3, 6, 12, 18 и 24 часа после начала нагревания моллюсков препарировали, выделяли окологлоточные кольца ганглиев и фиксировали по Карнуа. В каждой временной точке температура среды была 6.5, 13, 16.8, 20.5, 21.5, 21.9 и 22.0С, соответственно. Контролем служили животные, содержавшиеся при 4С. Всего в опыте было использовано 14 моллюсков (по 2 животных на каждую точку), 3 животных служили контролем.
Об уровне синтетической (функциональной) активности судили по изменению усредненного значения параметра а цитоплазмы нейронов четырех ганглиев: большого и малого париетальных, висцерального и плеврального. У каждого из моллюсков исследовали по 400-500 клеток. Из рисунка видно, что в первые часы нагревания среды значение параметра а увеличивалось и через 1.5 часа (13.0С) достигало максимума (на 35% выше контрольных значений). Затем значение параметра а снижалось и после 6-часового нагревания (20.5С) оставалось на постоянном уровне, достигая плато на 20% превышающем контрольные значения. Следовательно, функционально обусловленный диапазон изменений значений параметра а составляет 35% относительно 4С контроля. Все средние значения параметра а цитоплазмы нейронов при исследованных температурах достоверно отличались от контрольных значений при 4С (р 0.05), в то время как для средних значений параметра а ядер нейронов в данной серии экспериментов таких отличий не обнаружено. Проведенные исследования позволили установить физиологически обусловленный диапазон температурных изменений параметра а нейронов моллюсков относительно 4С контроля (35%). В дальнейшей работе были использованы моллюски, предварительно адаптированные к температуре 18-20С.
Для изучения функционального состояния нейронов изолированного мозга моллюска после замораживания-оттаивания была проведена серия экспериментов согласно схеме, представленной на рис. 2. Данные экспериментов приведены в таблицах 1,2, 3 (приложение) и на рис. 9, Как можно видеть на рис. 9, значения параметра а цитоплазмы изучаемых клеток МП1 и МПЗ изменялись в зависимости от конкретных условий эксперимента: сразу после оттаивания значение параметра а не отличалось от контроля (Р 0,95 нейрон МП1, Р 0,99 нейрон МПЗ), значительно возрастало после отмывания криопротектора ДМСО (35-40%, Р), сохранялось на высоком уровне в течение 1,5 часов при охлаждении изолированного мозга, и возвращалось к контрольному уровню после длительного инкубирования (5 и 8 часов), что может свидетельствовать о восстановлении функциональной (синтетической) активности нейронов после глубокого замораживания. При этом обе клетки вели себя сходным образом. На этих рисунках можно также видеть, что ДМСО, без замораживания, оказывает эффект на синтетическую (функциональную) активность нейронов. Причем, характер ответа нейрона на воздействие ДМСО идентичен ответу на замораживание-оттаивание: после 20-минутного пребывания мозга моллюска в растворе с ДМСО и отмывания в течение 30 минут значение параметра а возрастает относительно контрольного на 30% для клетки МШ, на 17% - для МПЗ (Р), что на 50 и более процентов ниже, чем значения а, полученного для замороженно-отгаянных нейронов; это значение а остается на достигнутом уровне (нейрон МШ), или продолжает увеличиваться (нейрон МПЗ) при постепенном охлаждении внешнего раствора от 22 до 4-6С в течение 1,5 часов; дальнейшее инкубирование при 4-6С приводит к снижению значения а и достигает контрольного уровня к 5-8 часам, как и после замораживания-оттаивания.
Изучение изменений ультраструктуры нейрона МПЗ мозга моллюска после криоконсервации
Ультраструктура контрольных нейронов при 22С В норме для нейрона МПЗ малого париетального ганглия моллюска Lymnaea stagnalis L характерно присутствие хорошо развитого эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи, присутствие лизосом, ламеллярных структур, электронноплотных гранул, вакуолей различного типа. Цистерны гранулярного эндоплазматического ретикулума размещались в околоядерной зоне цитоплазмы в виде концентрических окружностей вокруг ядра, в средней части цитоплазмы более короткие цистерны ретикулума были расположены диффузно (рис. 14а,в). Свободные рибосомы и полисомы заполняли все пространство цитоплазматического матрикса (рис. 14, 15). Диктиосомы комплекса Гольджи имели вид пластинчато-трубчатых структур различной величины (рис. 14г, 15а,в). Электронноплотные гранулы располагались по всей цитоплазме нейрона (рис. 156). Митохондрии имели различную величину и форму, хорошо выраженные кристы (рис. 15а,б). Цитосомы и ламеллярные структуры (местами образующие скопления), разнообразных форм и размеров (достигающие 0,7-0,8мк), были разбросаны по цитоплазме (рис. 146). Встречались мультивезикулярные тельца (рис. 15а), слоистые тельца (рис. цитоплазму. Поры ядерной мембраны были затянуты диафрагмой, заметно прилегание тонкого слоя хроматина к ядерной оболочке. К наружной ядерной мембране плотно прилегали рибосомы (рис. 14а). Люминесцентная микроскопия (глава 3) показала низкое значение синтетической активности нейронов по параметру а при 22С (рис.9, табл. 1, приложение).
Согласно схеме эксперимента (рис.2), изолированный мозг охлаждали в течение 1,5 часов от 22 до 4-6С.Ультраструктура нейронов после охлаждения характеризовалась набуханием цистерн гранулярного эндоплазматического ретикулума, диссоциацией диктиосом комплекса Гольджи, просветлением матрикса митохондрий и их набуханием (рис. 16), образованием глубоких складок ядерной оболочки (рис. 27г). В ядерной оболочке видны поры, открытые на значительном протяжении, заметно прилежание тонкого слоя хроматина к внутренней оболочке ядерной мембраны и «движение» глыбок ядерного материала по направлению к оболочке, на внешнем слое ядерной мембраны плотно сидят рибосомы (рис. 27г). В цитоплазме хорошо заметны микротрубочки, что свидетельствует о сохранении клеткой транспортной функции. Электронноплотные гранулы, мультивезикулярные тельца, ламеллярные структуры и цитосомы распределены по цитоплазме. Цитоплазматический матрикс заполнен моносомами и полисомами (рис. 16).
Изменения эндоплазматического ретикулума, комплекса Гольджи, митохондрий и увеличение контакта ядра и цитоплазмы за счет глубоких впячиваний, вызваны ответом нейронов на охлаждение. Движение гранулярного ядерного материала к ядерной оболочке, открытие пор на большом протяжении ядерной оболочки (рис. 27г), значительное увеличение площади соприкосновения ядра и цитоплазмы за счет глубоких впячиванийсвидетельствует об усилении обмена между ядром и цитоплазмой, активном выбросе гранул РНП из ядра.
В цитоплазме нейрона после охлаждения встречаются "розетты" (рис. 16а) эндоплазматической сети, описанные Маниной (1971) после разнообразных воздействий. В нашем случае мы наблюдали их при охлаждении изолированного мозга от 22 до 4-6С. Однако при температуре 0..+4С прудовик зимует (Болдырева, 1929; Зернов, 1928; Жадин, 1952), т.е. эти условия физиологически обычны для его обитания. Также, изолированный мозг при пониженной температуре, а не при комнатной температуре, восстанавливает электрофизиологические характеристики, после воздействия замораживания-оттаивания (Гахова и др., 1989). Другие авторы отмечают подобную организацию ретикулума нейронов прудовика с незначительным увеличением объема цистерн, в весенний период (Warton et all., 1977), что может быть связано с весенним "пробуждением". На основании этого можно сказать, что данные изменения эндоплазматического ретикулума (в том числе "розетты") не являются патологическими для нейронов моллюска.
Изменение функциональной активности, измеренной по параметру а, в период охлаждения находилось в пределах ошибки (рис. 9, табл. 1). Люминесцентная микроскопия показала (глава 3) достоверное увеличение синтетической активности по параметру а при длительном (5 часов) инкубировании при 4-6С по сравнению с нейронами после 20 и 50 минут инкубирования в физиологическом растворе при 22С. При дальнейшем инкубировании при 5С происходит нормализация ультраструктуры: сборка диктиосом комплекса Гольджи, сужение цистерн эндоплазматического ретикулума. Как видно (рис. 9), увеличение синтетической активности по параметру а не совпадает по времени с ультраструктурными перестройками, свидетельствующими об активном выбросе из ядра РНП (увеличение числа пор, прилегание глыбок гранулярного типа к мембране, рис. 27г), а происходит значительно позже.
Изучение изменений ультраструктурной организации митохондрий после воздействий замораживания-оттаивания, ДМСО и последующих охлаждения (от 20-22С до 4-6 С) и длительного инкубирования в физиологическом растворе при +4-+6С (в сравнении)
К цитоскелетным элементам клетки относят микрофиламенты (актин), промежуточные филаменты (виментин) и микротрубочки (тубулин) (Ченцов, 1984). Замораживание-оттаивание, а именно — физические процессы, сопровождающие это воздействие, вызывают изменения в организации цитоскелета нейрона. Об этом свидетельствует формирование жгута (rod like) в цитоплазме нейрона вокруг ядра (рис. 28в). Подобное образование не встречается ни после воздействий криопротектора, ни после длительного инкубирования или охлаждения (рис. 28). С восстановлением электрофизиологических характеристик (через 1,5часа инкубирования в физиологическом растворе при 4-6С) наблюдалось разрыхление тяжа наряду с общей картиной восстановления нейрона после оттаивания. Именно в этот временной промежуток зональность распределения структур по цитоплазме выражена наиболее ярко и на уровне люминесцентного, и на уровне электронно-микроскопического анализа клетки. В околоядерном пространстве наблюдалось прилегание тонкого слоя структур (ламеллярных, митохондрий, моносом, пузырьков Гольджи, небольших вакуолей) к ядерной мембране. Эта зона ярко окрашивалась акридиновым оранжевым.
Затем зона больших вакуолей, или (и)область нитей тяжа, образованная обширными гладкостенными вакуолями или цистернами ретикулума, или (и) рыхло расположенными нитями цитоскелета. Вторая зона слабо окрашивалась люминесцентным красителем АО, абсолютное значение параметра а в этой зоне в 1,5-2 раза меньше, чем в приядерной и периферической зонах. Затем следует третья зона, периферическая, где наблюдается большое количество разнообразных структур, образующих комплексы — липосомы, лизосомы, ламеллярные структуры, заметно удлиненные и уплощенные митохондрии. Формирование жгутовидного образования из промежуточных филаментов вокруг ядра описано на фибробластах крыс в ответ на воздействие теплового шока (Welch, Suhan, 1985). Этими же авторами отмечались подобные образования при вызывании физиологического стресса воздействием множества других агентов, в том числе аналогов аминокислот и тяжелыми металлами (Thomas et all., 1982). Biessmann et all (1982) наблюдали подобное перераспределение промежуточно-подобных филаментов в клетках Drosophila после теплового шока.
При воздействии теплового шока на клетки млекопитающих эти изменения обратимы при возвращении клеток в нормальные условия (Welch, Suhan, 1985). Образование жгутов электронноплотного вещества отмечали в цитоплазме адаптированных маутнеровских нейронов (МН) золотой рыбки после воздействия яда фракции 6 черного скорпиона (Михеева и др., 2000). Эти жгуты по морфологии идентичны тяжам электронно-плотного вещества, наблюдаемым в цитоплазме МН при действии фаллоидина или при их адаптации после стандартной обработки материала для электронно-микроскопических исследований (Moshkov et all, 1980; Tiras et all, 1992). Жгутовидные (rod-like) структуры актиновой природы присутствовали и в ядре фибробластов крыс после теплового шока (Welch, Suhan, 1985), В ядрах нейронов (-30-50%) после воздействия замораживания-оттаивания обнаруживались миелиноподобные структуры. Со временем инкубирования-восстановления в физиологическом растворе оттаянных клеток они становились более оформленными (рис. 29), но не исчезали вовсе. Известно присутствие подобных структур в ядрах клеток тритонии, но встречаются они очень редко (Боровягин, Сахаров, 1968). В наших экспериментах в ядрах контрольных нейронов этих структур не обнаруживалось, но однозначно отнести их образование к воздействию замораживания-оттаивания все-таки нельзя. Хотя не исключено, что замораживание-оттаивание способствует их образованию. Морфологическое сравнение rod-like структур актиновой природы в клеточных ядрах после теплового шока (Welch, Suhan, 1985) с миелиноподобным структурами, обнаруживаемыми в ядре нейронов после воздействия замораживания-оттаивания не выявило сходства.
