Содержание к диссертации
Введение
1. Введение 3
2. Обзор литературы 6
2.1. Общая характеристика ионных каналов кардиоваскулярной системы теплокровных 6
2.2. Альфа- и р-субъединицы потенциалзависимых К+-каналов и их роль в клеточных процессах 20
2.3. Ионные каналы в кардиомиоцитах моллюсков 30
2.4. Общая характеристика кардиоваскулярной системы моллюсков 37
3. Объекты и методы исследования 49
3.1. Объекты исследования 49
3.2. Особенности выделения миоцитов 51
3.3. Культуральные клетки 53
3.4. Адено и адено-ассоциированные вирусы 53
3.5. Растворы 54
3.6. Электрофизиология, обработка данных и статистика 56
4. Результаты исследования 59
4.1. HERG-подобные К+-каналы портальной вены кролика 59
4.2. Семейства потенциалзависимых К+-каналов в сердце мыши 66
4.2.1. Геноманипуляция и селективное исследование отдельных Kv 66
4.2.2. Транзиторное введение К+-каналов с помощью аденовирусов 78
4.2.3. Длительное введение а-субъединицы Kv 1.5 с помощью адено-ассоциированных вирусов 86
4.3. Потенциалзависимые К+-каналы в сердечных клетках Helix 91
4.3.1. Общая характеристика 91
4.3.2. Фармакологический анализ 94
4.3.3. Биофизические свойства 105
5. Обсуждение результатов 112
Выводы 120
- Альфа- и р-субъединицы потенциалзависимых К+-каналов и их роль в клеточных процессах
- Особенности выделения миоцитов
- Семейства потенциалзависимых К+-каналов в сердце мыши
- Потенциалзависимые К+-каналы в сердечных клетках Helix
Введение к работе
Актуальность темы. Бестраншейные технологии прокладки подземных коммуникаций находят все более широкое распространение и в развитых странах становятся преобладающими. Это предопределено существенным ущербом, к которому приводит рытьё траншей в жилых и промышленных зонах.
В основе бестраншейных способов лежит процесс образования скважин в грунтовом массиве. При этом особую сложность представляет проходка скважин, так называемого «непроходного» сечения (диаметром менее 1м), так как управление технологическим процессом в этом случае может осуществляться только снаружи. Применяемые в настоящее время устройства можно объединить в две группы:
Первая группа - это устройства, образующие скважины путем вдавливания фунта в стенки образуемой скважины. Она представлена в основном пневмо-пробойниками. Так получают скважины не более 300 мм. Увеличение диаметра требует значительных энергозатрат.
Вторая группа - это устройства, образующие скважины путем удаления грунта из сечения образуемой скважины. Она включает устройства для ударного внедрения стальных труб открытым концом с последующей их очисткой. Однако, стальные трубы дороги и в грунте подвержены быстрому разъеданию ржавчиной. В связи с появлением легких и долговечных полиэтиленовых труб широкое распространение получили зарубежные установки для бурения приповерхностных скважин с временным подкреплением стенок скважины буровым раствором. Это установки штангового бурения и микрощиты. Выбуривание грунта по всему сечению скважины и необходимость обеспечить циркуляцию и регенерацию бурового раствора предопределяют высокие энергозатраты, сложность и дороговизну буровых комплексов. Кроме того, гидравлический принцип поддержания временной устойчивости скважины резко усложняет работу при низких температурах.
Наличие отмеченных ограничений делает актуальным создание более простых и менее затратных устройств, позволяющих применять трубы из любого материала и работать по «сухой» технологии без буровых растворов.
Целью работы является обоснование принципиальной схемы, методики расчета и разработка устройства - грунтопроходчика для проходки скважин в уплотняемых фунтах.
Шея работы заключается в оснащении пневмоударной машины кольцевым рабочим органом, который в заданной пропорции разделяет фунт, расположенный в сечении создаваемой скважины, на две части, одна из которых удаляется, а другая - вдавливается в стенки скважины.
Задачи исследований:
-
Определить влияние основных параметров технологической схемы сооружения скважины фунтопроходчиком на скорость проходки скважины.
-
Выявить особенности взаимодействия фунтопроходчика с массивом и обосновать расчетную схему для определения его скорости при заборе фунта.
-
Обосновать схему и соотношение параметров воздухораспредели-
тельной системы пневмоударного привода грунтопроходчика.
4. Построить методику инженерного расчета основных параметров технологического комплекса и разработать проект грунтопроходчика.
Методы исследований - стендовые эксперименты на моделях устройства, математическое моделирование, компьютерный анализ экспериментального материала и результатов моделирования.
Научные положения, защищаемые автором.
1. В качестве критерия при выборе параметров технологической схемы проходки следует принимать показатель, определяемый отношением планируемой скорости проходки скважины к её предельному теоретическому значению.
-
При клиновидной форме рассекателя с углом, меньшим угла трения, расчетное давление лобового сопротивления грунта, усредненное по конической поверхности рассекателя грунтопроходчика аппроксимируется линейной функцией радиуса скважины.
-
Снижение расхода воздуха на привод грунтопроходчика с инерционным распределителем достигается уменьшением произведения отношений масс и рабочих площадей ударника и распределителя.
Достоверность научных результатов. Достоверность научных положений подтверждена необходимым объемом экспериментальных исследований моделей, сопоставимостью аналитических расчетов с экспериментальными результатами.
Новизна научных положений.
-
Получены зависимости между основными параметрами (шаг, скорость транспортирования и забора грунта, время разгрузки грунтоприемной капсулы) технологической схемы работы грунтопроходчика, установлен критерий для выбора их рациональных значений.
-
Обоснована и построена расчетная схема взаимодействия грунтопроходчика с массивом.
-
Выполнено аналитическое исследование инерционного распределителя пневмоударного привода грунтопроходчика и определен диапазон рациональных значений его параметров.
Личный вклад автора заключается: в постановке и проведении экспериментов по исследованию взаимодействия грунтопроходчика с массивом; в обработке экспериментальных данных и их математической интерпретации; в разработке рекомендаций к проектированию грунтопроходчика в целом и отдельных его узлов для осуществления комбинированного метода проходки скважин.
Практическая ценность. Разработан алгоритм расчета основных параметров технологического комплекса для сооружения скважин грунтопроходчи-ком. Даны рекомендации по проектированию и разработан проект грунтопроходчика.
Реализация работы в промышленности. Производственной фирмой "АКВА+" г. Санкт -Петербург, принято решение об использовании основных результатов исследований и изготовлении грунтопроходчика по предложенной
схеме для проходки скважин 0440 мм.
Апробация работы. Отдельные результаты работы докладывались на конференциях: "Интеллектуальный потенциал Сибири" (Новосибирск, 2000), "ВУЗы Сибири и Дальнего Востока ТРАНССИБУ" (Новосибирск, 2002) и семинарах кафедры "Механизации..." СГУПС.
Публикации. Основные результаты диссертации опубликованы в 3 печатных работах.
Объем и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 6 глав, выводов, списка литературы. Содержит 123 страницы машинописного текста, включая 75 рисунков, 14 таблиц и список литературы из 85 наименований.
Основной объем работы выполнен в лаборатории механизации горных работ ИГД СО РАН. Автор выражает глубокую благодарность сотрудникам лаборатории в особенности Петрееву Анатолию Михайловичу за неоценимые научно-методические рекомендации по выполнению работы, Щеглову А. Н., Сыря-мину А. Т., Лобову Ю. Н., Тищенко И. В. и Веберу И. Э. за техническую помощь.
Альфа- и р-субъединицы потенциалзависимых К+-каналов и их роль в клеточных процессах
Молекулярное клонирование выявило наличие большого числа а-субъединиц потенциалзависимых К+-каналов, и позволило провести детальное изучение свойств различных типов каналов, и, в частности, характеристик таких структурных элементов, как р-субъединицы, KChAP (К+ channel-associated protein), и КСЫР {Kv channel interacting protein), ответственных за особенности ионной проницаемости а-субъединиц (Таблица 1). — каналы типа Л, На основе четырех идентифицированных генов Drosophila такие как Shaker\ Shab, Shaw, Shal (Butler et al., 1989), четыре соответствующие подсемейства потенциалзависимых К+-каналов, соответственно Kvl, Kv2, Kv3 и Kv4, показаны в возбудимых клетках млекопитающих. К -каналы типа Kvl.l, Kvl.2 н Kvl.6 влияют на возбудимость висцеральных сенсорных нейронов у крысы (Glazebrook et al., 2002). При всем многообразии а-субъединиц К -каналов и различии их свойств, структурно все эти каналы можно объединить в одно суперсемейство -потенциалзависимые К+-каналы (Kv, voltage-dependent К -channels). По современным представлениям, эти К+-каналы тоже имеют шесть трансмембранных участков с N- и С-терминалями, обращенными вовнутрь. К+-токов типа А (7А) составляют каналы типа Shaker, которые образуются из четырех а-субъединиц, при этом трансмембранные сегменты S5 и S6 являются участком, формирующим ионную пору, Свидетельства в пользу этого утверждения приведены в дальнейшем изложении в следующих работах (MacKinnon et al, 1990; Yellen et al, 1991). При анализе структуры и функции S1-S6 сегментов было определено, что S4 является сенсором потенциала (Тетре1еЫ.Л988). К4-каналы типа А выявлены во многих возбудимых клетках. Одним из свойств этих каналов является временная зависимость хода инактивации активированного тока (Eghbali et al, 2002), Отсюда они и получили другое название, До (transient outward current). Эти каналы активируются независимо от присутствия или отсутствия ионов кальция во внеклеточном растворе, и тем самым их можно отличать от кальцийзависимых К+-каналов (например, Махі К+-канальі). В нейронах 1\ участвует в формировании ранней фаз реполяризации ПД, а также уменьшает скорость деполяризации, которая следует после фазы следовой гиперполяризации. Таким образом, /д важен для модуляции пороговых значений ПД, их частоты и продолжительности (НШе, 1992). Несколько а-субъединицы /д-каналов включая Kvl.4, Kv4.1, Kv4.2 и Kv4.3 были клонированы в мозге теплокровных (Baldwin et al, 1991; Roberds, Tamkun, 1991; Dixon et al, 1996; Serodio et al, 1996). На базе молекулярнобиологических анализов было предположено, что каналы семейства Kv4 (гомолог Shal у Drosophila) являются компонентой пиковых выходящих токов в мозгу и в сердце (Serodio et al, 1994; Barry et al, 1995; Brahmajothi et al, 1996; Fiset et al, 1997). Каналы Kv4.2 в клетках желудочка крысы в основном раположены в ґ-трубочках. Эти каналы составляют значительную часть выходящих токов в кардиомиоцитах млекопитающих, которые известны как Ло (Cha et al., 2004).
Каналы семейства Kv4 способствуют также генерации регулярных спайков низкой частоты в пирамидальных нейронах (Martina et al., 1998). В некоторых клетках Kv3.3 и/или Kv3.4 входят в состав /д, но они отсутствуют в сердце (Ohya et al., 1997). /д можно блокировать с помощью 4-АР. Семейства Kv3 (гомолог Shaw у Drosophila) тоже чувствительны к миллимолярным концентрациям 4-АР, но их можно блокировать и внеклеточным TEA в концентрациях менее чем 5 мМ (Ohya et al, 1997). К+-каналы типа Kv3 у теплокровных являются селективной мишенью нейромодуляторов, и их экпрессия позволяет разным нейромодуляторам регулировать спайки в интернейронах (Lien et al., 2002). /д-токи в кардиомиоцитах теплокровных не чувствительны к TEA при концентрациях до 10 мМ. Нативные Kv-каналы представляют собой комбинацию мембранной а— и цитоплазматической р-субъедишщ (Trimmer, 1998), а также KChAP (Kuryshever а І, 2000) и КСЫР (Kim et al, 2004а; Kim et al, 2004b). Альфа- и р-субъединицы потенциалзависимых К -каналов у млекопитающих ансамблирутотся в эндоплазматическом ретикулуме и остаются вместе как постоянный комплекс (Shi et al, 1996). Бета-субъединицы потенциалзависимых К4-каналов являются симметричными гетеромерами оксиредуктазных белков, как и интегральные мембранные а-субъединицы (Gulbis et al, 2000). Высказывалось предположение, что внутриклеточный домен ТІ взаимодействует с р-субъединицой (Sewing е t al, 1996). Домен ТІ это цитоплазматический домен ЫНг-терминали, который непосредственно начинается от первой трансмембранной спирали. Этот домен состоит из 130 аминокислотных остатков (Kreusch et al, 1998). Тетрамеры домена ТІ образуют длинную (около 20 А) и узкую воротную структуру (см, далее), которая является внутренней частью ион-проводящего пути (Kreusch et al, 1998). Элементы, которые модулируют воротные механизмы потенциалзависимых К -каналов, находятся между С-терминалями сегмента S6 и цитоплазматической части канала, что было показано с помощью ионов Cd+ (Liu et al, 1997). При активации канала, в ответ на деполяризацию МП, сегмент S4 передвигается примерно на 10 А в выходящем направлении от цитоплазмы (Mannuzzu et al, 1996). Исключение домена ТІ предотвращает ассоциацию ct-субъединицы с р-субъединицой. Взаимодействие а— и fS-субъединиц можно выявить in vivo при анализе инактивации тока, которая означает закупоривание ворот инактивационным пептидом (Zagotta et al, 1990; Rettig et al, 1994). Последний пептид эффективен, когда присоединен к ЇЧНг-терминали либо а-, либо р-субъединицы (Gulbis et al, 2000). Таким образом, если а-субъединица не имеет своего инактивационного пептида, инактивация, вызванная р-субъединицей, показывает ассоциацию ос-субъединицы с р-субъединицей (Rettig et al, 1994). Домен ТІ не участвует впрямую в процессе инактивации, но держит р-субъединицы на адекватном месте. Аминокислотная последовательность контактирующего звена (connectors; см. Рис. 3) домена ТІ гомологична только внутри отдельных семейств К -каналов, но не между К+-каналами из разных семейств. Поэтому Р]- и Рг-субъединицы ассоциируются только с а-субъединицами Kvl; эти р-субъединицы не имеют взаимосвязь с К+-каналами из семейства Kv2 (Nakahira et al, 1996). Четыре домена ТІ и столько же р-субъединиц образуют комплекс ТІ4р4. Центр этого комплекса положительно заряжен и имеет величину около 4 А, к оторый слишком узкий, чтобы пропускать ионы TEA, или же молекулы внутриклеточного инактивационного пептида. Так как инактивационный пептид не сможет передвигаться по центру комплекса TUP4 (Рис. 3), он должен достичь ворота через отверстие над ТІ тетрамером (Gulbis et al, 2000). Мутации положительно заряженных аминокислот, обусловливающие основные свойства инактивационного пептида в терминали NH2, влияют на скорость и величину инактивации (Murrell-Lagnado, Aldrich, 1993; Gebauer et al, 2004).
Линкер ТІ-SI, который связывает домены ТІ с первым трансмембранным сегментом, содержит несколько отрицательно заряженных аминокислот (Gulbis et al, 2000). Мутации в некоторых из этих аминокислот тоже влияют на скорость инактивации, а также на возвращение в исходное положение из состояния инактивация (Heinemann et al., 1996). Удаление домена ТІ из а-субъединицы не влияет на проводимость одиночного канала, следовательно, этот домен не является тетрамером, и не образует добавочное продолжение к структуре ворот (Kobertz, Miller, 1999). По-видимому, домен ТІ К+-каналов является тетрамером (Strang et al, 2001; Strang et al, 2003), образующим платформу для р-субъединицы. Детерминанты, контролирующие экспрессии каналов в мембране, находятся в участке поры (Manganas et al, 2001). С помощью точечных мутаций было показао, что существует два участка, важные для перемещения канала к мембране. Один участок находится во внеклеточном "turret" домене, а второй находится дистально от селективного фильтра. С теми же участками связываются некоторые нейротоксины. Выходящие токи через гетеромультимерные Kv каналы семейства Shaker имеют разные величины временного хода инактивации. Существуют два типа/механизма инактивации, С и N (Jan, Jan, 1997). Тип С представляет собой инактивацию, которая осуществляется при взаимосвязи между СООН-терминалью и воротными сегментами S5 и S6 ct-субъединицы (Choi et al, 1991). У Kv-каналов семейства Shaker инактивация типа С происходит из-за сужения внешней стороны поры (Ogielska et al., 1995). Ход инактивация типа С можно замедлить внеклеточной аппликацией TEA (Grissmer, Cahalan, 1989), или/и повышением содержания ионов К+ во внеклеточном растворе (Baukrowitz, Yellen, 1995; Wang etal, 2003). В первом случае инактивация отражает занятость связывающей стороны вблизи внеклеточного устья поры (Choi et al, 1991;Lopez-Barneoefa/., 1993).
Особенности выделения миоцитов
Выделение гладкомышечных клеток кролика Oryctolagus cuniculus. Препаровка портальной вены и последовательная изоляция гладкомышечных клеток была осуществлена на взрослых кроликах породы New Zealand White (3-3,5 кг). Кроликов обездвиживали кетамином (12,5 мг/кг), а затем им вводили летальную дозу пентобарбитала (32 мг/кг). Для изоляции портальной вены производился большой разрез брюшной полости, быстро изолировали вену, и помещали ее в соответствующий физиологический раствор (Раствор Ж, Таблица 3). Дальнейшая препаровка производилась в этом растворе. Портальную вену закрепляли на силиконовой подложке, и с помощью пинцета и ножниц удаляли соединительные и жировые ткани. Затем портальная вена разделялась на части. Кусочки помещались в маленькую колбу (12 мл), содержащую раствор, состав которого перечислен в Таблице 3 (Раствор Ж). Для диссоциации клеток в раствор Ж" добавляли трипсин (из расчета 20 единиц/мл) и коллагеназу в концентрации 1 мг/мл. Процесс диссоциации клеток длился до 40 минут. Диссоциированные клетки отмывали, и хранили в холодильнике при 4 С в растворе Д. Их использовали в течение 2 дней. Выделения сердечных клеток у мышей Mas т usculus. Для изоляции сердца мышей сперва обездвиживали эфиром, и дальнейшую препаровку проводили под общим наркозом (кетамин: 50 мг/кг). Делали небольшой разрез грудной полости, быстро извлекали сердце, и в соответствующем физиологическом растворе (Таблица 3, Раствор Е) подготавливали для ретроградной перфузии. Для этого сердце быстро закрепляли в установку и перфузировали раствором Е. Для диссоциации клеток в раствор Е добавляли коллагеназу в концентрации 1 мг/мл. Процесс перфузии длился до 10 минут при 37 С. После этого предсердия отделялись от желудочков, далее последовательно разделялись левый и правый желудочки. Кусочки ткани помещали раздельно в маленькие колбы (12 мл), содержавшие свежий раствор Е, в который дополнительно добавляли альбумин в концентрации 10 мг/мл. Кусочки желудочков инкубировали в течение 10 минут при 37 С» После инкубации выделенные клетки центрифугировали в течение 5 минут при частоте вращения 400/минуту, и осадок с клетками помещали в свежий раствор Е. Клетки хранили при комнатной температуре в растворе Е и использовали в течение 10 часов после изоляции, а в редких случаях до 3 дней. В последнем случае клетки хранили в холодильнике при 4 С. Клетки от инфицированных соответствующими векторами (см. Раздел 3.4) сердец были изолированы после 3-10 дней в случае применения аденовируса или после 6 месяцев при использовании адено-ассоциированных вирусов. В этих клетках были проанализированы последовательно электрофизиологические, биофизические и фармакологические свойства ионных токов. Изоляция сердечных клеток у моллюсков, В литературе описаны методики выделения кардиомиоцитов прудовика и мидии.
Приводимые методики в цитируемых статьях оказались непригодными для выделения клеток наземных пульмонат. Поэтому одной из первоначальных методических проблем была разработка специальной процедуры выделения клеток, позволяющей получать неповрежденных ферментом клетки. Нам удалось разработать специальный способ выделения миоцитов для виноградной улитки и ахатины (Kodirov et at, 1995; Kodirov et al, 2004b). Анестезия улиток осуществлялась путем охлаждения при 0 — +3 С. Как только вызывали полное обездвиживание, у улитки с помощью пинцета удалялась раковина. Животное без раковины закрепляли на силиконовой подложке дорсальной стороной кверху. Для изоляции сердца вскрывали цефалопедальный гемоцель, и производили разрез стенки легочной полости вдоль мантийного валика. Дальнейшая препаровка производилась в соответствующих физиологических растворах. Сердце изолировали быстро, остатки аорты и предсердия отделялись от желудочка. Эксперименты проводились только на клетках желудочка Helix, но не предсердия. Эта было сделано потому, что у других видов моллюсков были исслдованы только вентрикулярные клетки. Затем желудочек был разделен на две части, чтобы подстраховать внутренние слои миокарда от чрезмерного влияния ферментов. Эти сердечные ткани были помещены в маленькую колбу (25 мл), содержащую специальный раствор, близкий по составу к "KB solution" (Isenberg, Klockner, 1982). Состав этого специального раствора приведен в Таблице 3 (Раствор Д). Для диссоциации клеток в раствор Д добавляли папаин в концентрациях 1 мг/мл. Процесс диссоциации длился 20-30 минут. После инкубации выделенные клетки центрифугировали в течение 4 минут при частоте вращения 400/минуту, и осадок с клетками помещали в свежий раствор Д. Наконец, полученные таким образом клетки хранили в холодильнике при 4 С в растворе Д, и их использовали в течение 5 дней. 3.3. Культуральные клетки Клеточная культура и инфекция. Для тестирования аденовиральных векторов, содержащих Ку1,5-каналы сердца крысы, на стеклянной подложке культивировались трансформированные эмбриональные клетки почек человека (НЕК 293) в среде DMEM-Gibco (Sigma, США), содержащей 5% телячьей плазмы (fetal calf serum). После инкубации в среде с 95% Ог и 5% COj в течение 48 часов клетки трансфектировали с помощью аденовирусов соответствующей плазмидой сДНК, содержащей аминокислотные последовательности а-субъединицы Kvl-5-каналов, используя модифицированный нами метод. Инфицировались а-субъединицы K.vl.5 или GFP (green fluorescent protein) из расчета 10 или 100 МОЇ (multitudes of infection) плазмиды на одну ячейку культуральной посуды. GFP был использован как биологический маркер, который не влиял на свойства общих выходящих токов, но позволял оценивать успешность инфекции.
Приблизительно через 24 часов после инфекции клетки использовались для электрофизиологического эксперимента. Экпрессию экзогенных Kvl-5-каналов в этих клетках, а также в кардиомицитах мышей (см. далее) подтверждали по методу Вестерн блотта с использованием моноклональных антител против а-субъединицы Kvl,5. 3.4. Ад єно и адено-ассоциированные вирусы Инфекция аденовирусами (AV) позволяет вводить каналы в кардиомиоциты только на короткий срок (до 10 дней). Для более длительной экпрессии применялись поколения адено-ассоциированных виральных векторов (AAV) типа 5, которые были получены с использованием модифицированного метода (Chartier et at, 1996). Аденовиральные векторы содержали Ку1.5-каналы крысы. Для контроля возможного прямого действия вируса на исследуемые каналы были созданы сходные адено- или адено-ассоциированные виральные векторы, кодирующие ген р-галактозидазы (AV-LacZ, AAV-LacZ) или ген GFP (AV-GFP, AAV-GFP). Аденовиральные векторы были протестированы и любезно предоставлены нам Dr. Lee. Составы основных растворов для всех объектов приведены в Таблице 3. В качестве буфера во всех растворах применялся HEPES (N-2-Hydroxyethylpiperazine-N -2-ethanesulfonic acid; Sigma). Бескальциевые растворы приготавливались на основе солей натрия, калия, магния и HEPES с исключением только кальция (раствор А, Таблица 3). Сведения о антагонистах приводятся в соответствующих местах в главе «РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ». Антагонисты, растворенные в одном из наружных растворов, подавались в камеру с помощью насоса. Время полной смены раствора составляло менее 1 минуты для конфигурации whole-cell. Дополнительные изменения в составе основных растворов оговорены в соответствующих местах. рН всех вне- и внутриклеточных растворов были соответственно 7,4 и 7,2, Насыщенные растворы Е-4031 (это селективный блокатор HERG К+-каналов и антиаритмик III класса), 4-АП и TEA приготовляли в концентрациях 2-10 мМ. Затем все эти блокаторы разбавлялись до соответствующих окончательных концентраций в наружных растворах.
Семейства потенциалзависимых К+-каналов в сердце мыши
К продлению потенциалов действия (ПД) приводят различные мутации каналов (см. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ). Некоторые из этих мутаций вызьшают уменьшение К+-токов посредством доминантно-негативного механизма. Экспериментальные модели удлиненного QT-интервала (LQT синдром) получены при экспрессии мутированного Kvl.l канала. У таких мутантов (Kvl.lN206Tag) доминантный ген (KvIDN) негативно модулирует (т.е. блокирует) токи через Клг!.5-каналы. При этом происходит почти полное подавление Kvl.S-токов, что осуществляется из-за образования гетеромерных (мутированных) каналов, состоящих из а-субъединиц Kvl.5 и KvIDN. Гетеромерные каналы либо не проводят К -токи, или же не доходят до цитоплазматической мембраны, где они при благоприятных условиях могли и должны образовать функциональные каналы. Экспрессия другого гена (Kv2.1N216Tag) в сердце по доминантно-негативному механизму приводит к уменьшению количества или к исчезновению Kv2.1 -каналов в цитоплазматической мембране (Xu et ah, 1999). В наших экспериментах мы исследовали последствия скрещивания этих двух трансгенных мышей. Были получены четыре линии мышей, в сердце которых: а) отсутствовали оба трансгена - WT (wild type); б) присутствовал один доминантно-негативный трансген - KvIDN; в) присутствовал один Kv2DN; г) присутствовали оба трансгена - KvIDN и Kv2DN. Для выяснения причины различия ВАХ для разных субъединиц мы провели эксперименты со скачкообразным изменением мембранного потенциала. В этом случае потенцилзависимость проводимости канала должна определяться мгновенной ВАХ, для которой амплитуда тока измеряется сразу же после скачка потенциала. Потенциалзависимость же кинетики открывания и закрывания канала определяется релаксацией тока до нового стационарного состояния и стационарной ВАХ. Для сердечных клеток в стандартных внеклеточных растворах характерна высокая кальциевая проницаемость. Блокада Са2+-токов осуществлялась 2 мМ Со2+. ТТХ-чувствительные Na+OKH блокировали с помощью 10 цМ ТТХ во внеклеточном растворе, а нечувствительные к TTXNa+OKH инактивировали с помощью коротких скачков потенциалов до -20 мВ продолжительностью 20 мс (Рис. 7Г). К -токи в изолированных кардиомиоцитах контрольных мышей (WT), активировались подачей ступенек потенциала длительностью 4 с. Были выявлены токи, состоящие из четырех компонент. Одна из компонент быстро инактивировалась до некоторого постоянного уровня (Рис. 1А). Эта компонента известна как ]С-токи типа А, которые кодируют а-субъединицами Kv4.2 или Kv4.3.
В кардиомиоцитах левого желудочка мышей мгновенный транзиторный К -ток в основном осуществляется через Ку4.2-каналы. В состав мгновенного тока по всей видимости входят и К+-токи, проводящиеся каналами Kvl.5 и Kv2.1 и/или Kv2.2 (см. далее). В некоторых клетках К+-токи также проходят через каналы Kvl.4. О неоднородности транзиторных токов свидетельствует их несколько медленная временная инактивация (132 + 10,5 мс, п = 15; Рис. 1А) по сравнению с токами через Ку4.2-каналы (29,7 ± 6,4 мс при +60 мВ, п - 11, Р 0,05; см. Рис. 10 и ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ), а также чувствительность токов к 4-АП (Рис. 1Б, Г, ) и TEA (Рис. 1В, Д, ). При контрольных условиях соотношение пикового тока к постоянной составляющей незначительно варьировало у разных клеток (Рис. 7А). Ступеньки потенциалов подавались от поддерживаемого потенциала -70 мВ до заданного значения между -60 и +60 мВ. Протокол опыта схематически показан на Рис. 1Г. Добавление 50 (дМ 4-АП блокировало выходящие токи (Рис. 75, Г). Амплитуда тока еще больше уменьшалась при совместной аппликации 50 рМ 4-АП и 5 мМ TEA (Рис. 1В). 4-АП-чуветвительные токи содержат только транзиторную компоненту, быстро инактивирующуюся до нулевого уровня (Рис. 77"). ТЕА-чувствительные токи состояли тоже из пиковой компоненты, но инактивировались до нулевого уровня намного медленнее (Рис. 1Д). Отношение пикового тока к постоянной составляющей варьировало в зависимости от сочетания мутированных субъединиц Kvl.l и Kv2.1. Наложенные друг на друга ВАХ мгновенного значения амплитуды тока при контрольных условиях (, и — 28), для 4-АП- (, п = 17) и ТЕА-чувствительных (А, п = 15) токов представлены на Рис. ТЕ. Разница в амплитудах токов чувствительных к 4-АП и TEA статистически не была достоверна. Средние значения амплитуды мгновенных токов, чувствительных к 4-АП и TEA, активированных от поддерживаемого потенциала -70 мВ при +60 мВ, были соответственно 11,3 + 2 пА пФ_ (н = 17) и 8,9 ± 1,8 пА пФ-1 (и= 1 5, Р 0,05). Амплитуда мгновенных токов, нормализированная к емкости клеток при контрольных условиях при +60 мВ, была 35,2 ± 3,2 пА пФ"1 (п = 28, Р 0,05). Относительное участие 4-АП и ТЕА-чувствительных токов в составе тотальных К —токов можно вычислить, используя соответственно следующие выражения: (Kvl..5) -«4-АП-чувствителтые котроль %v2.1) ТЕА-чувств1П1льные коїпрояь Соответствующие индексы для Kvl.5 (0,32) и Kv2.1 и/или KV2.2 (0,25) свидетельствует о том, что оба компонента К+-токов задержанного выпрямления присутствуют у WT мышей в приблизительно одинаковых соотношениях. В дальнейших экспериментах выходящие токи были активированы подачей ступеньки потенциалов длительностью 4 с на клетки, изолированные из сердца мышей KvlDN (Рис. 8). К+-токи были активированы при условиях, сходных с приведенными на Рис. 1Г. Морфология токов, активированных при скачкообразном изменении потенциалов, была сходна с таковыми у WT мышей, но опытный глаз может обнаружить отсутствие одного компонента, а точнее К+-токов через Ку1.5-каналы (Рис, SA), Одним из свойств К-токов через каналы Kvl.5 является их высокая чувствительность к 4-АП. Это вещество уже при концентрации 50 цМ значительно и селективно блокирует выходящие К+-токи у WT мышей (Рис. IE и Г). В сердечных клетках KvlDN мышей 50 цМ 4-АП не влиял на выходящие токи (Рис. 85), что доказывает отсутствие Kvl.S-токов. Аппликация TEA при концентрации 5 мМ в присутствии 4-АР вызвала значительное уменьшение тока (Рис. 8В). Выходящие К+-токи в кардиомиоцитах желудочка KvlDN мышей были более чувствительны к TEA, чем у WT мышей (Рис. 75) при одинаковых концентрациях (5 мМ). Эффекты TEA могут быть почти полностью устранены после суперфузии клеток нормальным внеклеточным раствором (данные не показаны). Для того, чтобы количественно проанализировать влияние 4-АП и TEA на К+-каналы в сердечных клетках желудочка KvlDN мышей, методом субстракции были вычислены 4-АП и ТЕА-чувствительные токи, соответственно к 50 цМ 4-АП и 5 мМ TEA (Рис. 87" и Д). Метод субстракции показал, что выходящие К+-токи в кардиомиоцитах желудочка KvlDN мышей были менее чувствительны к 50 цМ 4-АП. Эти данные подтверждают, что KvlDN как доминантный ген селективно блокирует токи через Kvl .5-каналы.
Потенциалзависимые К+-каналы в сердечных клетках Helix
Идентификация К — каналов. Надо отметить, что интактные клетки сокращались, когда микроэлектрод находился вблизи от клетки, и имела место утечка внутриклеточного раствора (высокое содержание К+) из микроэлектрода прежде чем была образована конфигурация whole-cell. Ответ клетки на высокую концентрацию К+ был обратимым, т.е. если мембрана клетки не была повреждена ферментом, наблюдаемое сокращение быстро сменялось релаксацией (данные не показаны). Для анализа ответов К+-каналов сердечных клеток виноградной улитки на ступеньку потенциала была проведена серия специальных тестирований (Рис. 18). Ранее у Lymnaea зависимость К+-токов типа А от поддерживаемого потенциала бьша определена в присутствие 5 мМ TEA (Yeoman, Benjamin, 1999). Этим К+-каналам свойственна стационарная инактивация при более позитивных поддерживаемых потенциалах. Исследование зависимости К -токов типа А от поддерживаемого потенциала в сердечных клетках виноградной улитки в наших экспериментах проводилось при стандартных условиях в отсутствие TEA (Рис. 18Л, Б). Протокол импульсов показан в верхней части Рис. 18Л. Семейства К+-токов были активированы в физиологическом растворе в ответ на скачкообразное изменение мембранного потенциала между -50 и +80 мВ (интервал: 10 мВ) либо от поддерживаемого потенциала -40 мВ (Рис. 18Л), либо от -70 мВ (Рис. \%Б). Продолжительность импульсов составляла 250 мс. Выходящие токи при деполяризации до +20 мВ не инактивировались, однако в диапазоне МП от +30 до +80 мВ, наблюдалась значительная инактивация. Выходящие К+-токи типа А активировались даже от поддерживаемого потенциала -40 мВ (Рис. 18Л). Этим они отличаются от К -токов типа А у млекопитающих (см. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ). При более негативном потенциале, например при -70 мВ, амплитуда токов увеличивалась (Рис. \%Б). Тем не менее структура тока при обеих условиях была одинаковая, что свидетельствует об активации одного и того же канала. Таким образом, при использовании только разных поддерживаемых потенциалов выходящие їС-токи в кардиомиоцитах Helix, в противоположность таковым у Mytilus edulis (Curtis et ai, 1999), невозможно разделить на выходящие К -токи типа А (/А), и токи задержанного выпрямления (/к). Активацию К+-токов в кардиомиоцитах желудочка Helix можно было наблюдать начиная от -30 мВ. На Рис. 185 показаны В АХ пиковых значений токов для поддерживаемых потенциалов -70 мВ (белые кружочки; я = 18) и —40 мВ (черные кружочки; и = 31) при стандартном внеклеточном растворе.
Для сравнения, на Рис. 1 &Г показаны средние значения стационарных ВАХ, измеренные в конце импульса (продолжительность 250 мс). Средние значения амплитуды мгновенных токов, активированные от поддерживаемых потенциалов -40 мВ и -70 мВ, нормализованные к емкости клеток при +60 мВ, были соответственно 44,9 ± 3,2 пА пФ_ (я = 31) и 104,5 ± 9,1 пА пФ"1 (я = 18, Р 0,001). Таким образом, величина амплитуды токов зависела от значения поддерживаемого потенциала, что в дальнейшем было подтверждено в опытах, в которых поддерживаемый потенциал составлял -50 мВ (см. Рис. 24). ВАХ пиковых значений токов демонстрировали значительное выходящее выпрямление. Для К+-каналов мгновенные ВАХ имеют более выраженное выпрямление в выходящем направлении тока, по сравнению со стационарными ВАХ. Свойства токов в кардиомиоцитах желудочка Helix похожи на свойства потенциалзависимых К -каналов с выходящим выпрямлением у теплокровных. Дозозависимое влияние ТЕЛ. Так как данные о возможной природе токов в кардиомиоцитах у наземных пульмонат отсутствовали, мы провели ряд фармакологических анализов с использованием известных блокаторов К+-каналов. Семейства К+-токов были проанализированы в присутствии TEA в диапазоне от 1 нМ до 30 мМ. На Рис. \9А и Б представлены вызванные К+-токи в ответ на скачкообразное изменение мембранного потенциала при +20 и +80 мВ (эти значения МП были выбраны только для наглядности) от поддерживаемого потенциала -40 мВ. Аппликации TEA на клетку в концентрации от 100 {лЪА до 10 мМ TEA (Рис. 19/4, Б, ) значительно уменьшали амплитуды тока. Более того, кривые К+-токов в ответ на сдвиг к +20 mV (Рис. \9А) в отсутствии и в присутствии 100 /JM TEA пересекались, и структура тока была похожа на таковую для К+-каналов задержанного выпрямление (/к.) у Lymnaea. Активация К -тока в кардиомиоцитах желудочка Helix при условиях, когда во внеклеточном растворе присутствовал TEA, была относительно медленная, а инактивация была незначительная. Надо отметить, что І\ у Lymnaea был идентифицирован исходя из двух критериев: первое - К+-токи были нечувствительны к TEA; и второе - была зарегистрирована временная инактивация активированного тока в течение 200 мс. При контрольных условиях К+-токи в кардиомиоцитах желудочка Helix активировались, начиная уже с -30 мВ (поддерживаемый потенциал: -40 мВ), и амплитуда тока увеличивалась при более позитивных МП (Рис. 195, , п = 31). Были показаны последовательно различные степени блокирования токов внеклеточным TEA. ВАХ пиковых значений показали наличие выходящих токов несмотря на присутствие 100 //М TEA во внеклеточном растворе (Рис. 195, О). Вольтамперные кривые, полученные до и после аппликации 100 //М TEA при потенциалах между -50 и +10 мВ, практически совпадали (Рис. 195). Кумулятивная аппликация TEA при концентрациях до 10 мМ значительно блокировала К+-токи (Рис. 195, ). Таким образом, была составлена дозозависимая кривая для TEA в диапазоне концентраций от 1 нМ до 30 мМ (w = 3-10) (Рис. \9Г). Для определения дозозависимости ответов каналов применяли ступенчатое изменение потенциала. Ступенька потенциала длительностью 250 мс подавалась от поддерживаемого потенциала -40 мВ до заданного значения между -50 и +80 мВ. Токи, активированные таким методом в отсутствие TEA (/котроль), вычитались из ответов на ступеньку потенциала во время стационарной составляющей в присутствие антагониста (/TEA), И аппроксимировались выражением: / = ТЕА / контроль Средние значения ± S.E.M. представлены как функции концентрации TEA, чтобы вычислить ICso (336 ± 142 / М), и кривизну (0,8 ± 0,2).
Интересно заметить, что кумулятивная аппликация 30 мМ TEA после 10 мМ не вызвала дальнейшего ингибирования (Рис. 19Г). Эффекты TEA были почти полностью обратимы после промывки нормальным внеклеточным раствором (см. Рис. 22Д). Фармакологический анализ свойств бифазных К -токов. Для того, чтобы можно было более детально сравнивать К+-каналы в сердечных клетках виноградной улитки Helix с таковыми у Lymnaea stagnalis и млекопитающих, при определении ВАХ была использована пилообразная стимуляция. МП клетки поддерживался при 0 мВ, затем подавался кратковременный скачок до -120 мВ (продолжительность 10 мс), чтобы избавиться от инактивации канала. Затем мембранный потенциал пилообразно изменялся в течение 3 с до +60 мВ (Рис. 20Л). Вольтамперная характеристика тока при контрольных условиях показывает активацию К+-каналов в кардиомиоцитах желудочка Helix начиная от -20 мВ, и при этом максимальная амплитуда токов регистрировалась при +20 мВ (Рис. 2ІЇБ), Потенциал реверсии тока (при -91,6 мВ) был близок к потенциалу равновесия калия (Е& — -86,9 mV), что свидетельствует о калиевом происхождении токов, чувствительных к TEA (Рис. 205 и Г). Входящие токи при таких условиях не были зарегистрированы. Таким образом, первые же опыты показали некоторые отличия в свойствах К+ каналов между двумя видами улиток, Helix и Lymnaea stagnalis. Вольтамперная характеристика ІС -токов в сердечных клетках виноградной улитки Helix имела сложное выпрямление, демонстрируя при мембранных потенциалах около +20 мВ аномальное выпрямление, а при потенциалах более чем +30 мВ - нормальное выпрямление. Однако в диапазоне потенциалов от -90 до +20 мВ ВАХ для К+-токов имела характер нормального выпрямления (Рис. 20). Мы назвали такой тип ВАХ "ВАХ с бифазным выпрямлением" (Рис. 20Б). Несмотря на то, что форма ВАХ иногда варьировала от клетки к клетке, бифазные токи при пилообразном изменении потенциала бьши стабильны и идентичны у большинства кардиомиоцитов (Рис. 20). Гиперполяризация мембраны до -120 мВ не показала наличие входящего тока. Характер выпрямления ВАХ при пилообразном изменении мембранного потенциала после аппликации 1 мМ TEA немного варьировал в диапазоне потенциалов между -40 и 0 мВ, тогда как в диапазоне от 0 до +60 мВ они были идентичными (205 и В). Однако в присутствии 10 мМ TEA во внеклеточном растворе амплитуда ТЕА-чувствительных токов увеличивалась.
