Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Концепции окислительного фосфорилирования ( обзор литературы) 10
Строение электронтранспортной цепи митохондрий 10
Кинетика переноса электронов в митохондриях...10
Сопряжение экзергонических и эндергонических процессов 17
Структура и-механизм действия АТФсинтетазы...20
Теории окислительного фосфорилирования 22
Хемиосмотическая теория 22
Конформационные теории сопряжения окисления и фосфорилирования 29
Глава 2. Материалы и методы 36
Выделение митохондрий 36
Определения коэффициента дыхательного контроля 37
Определение содержания электронтранспортных цепей 37
Определение количества в митохондриях радиоизотопным методом 41
Определение количества АТФ по изменению содержания неорганического фосфата 47
Методика изучения синтеза АТФ митохондриями при скачкообразном изменении рН 50
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Глава 3. Влияние скачкообразного изменения рН на фосфорилирование в нативных митохондриях 52
Глава 4. Индуцируемое быстрым изменением рН фосфорилирование в разобщенных митохондриях 67
Обсуждение 92
Выводы 99
Литература 101
- Строение электронтранспортной цепи митохондрий
- Выделение митохондрий
- Влияние скачкообразного изменения рН на фосфорилирование в нативных митохондриях
- Индуцируемое быстрым изменением рН фосфорилирование в разобщенных митохондриях
Введение к работе
Пути утилизации энергии в клетке давно привлекают внимание ученых. Важную роль в этих процессах играют специальные органеллы клетки - митохондрии. В митохондриях осуществляются два взаимосвязанных процесса: окисление органических субстратов (НАДН, сукцината и других) молекулярным кислородом, катализируемое сложной полиферментной системой (электронтранспорт-ной цепью) и синтез АТФ АТФсинтетазой из АДФ и неорганического фосфата. АТЗ? является основным унифицированным источником энергии для многих клеточных процессов.
Энергия, выделяющаяся при окислении субстратов дыхания, используется АТФсинтетазой для синтеза АТФ, содержащей т.н. макроэргическую связь. Поскольку оба этих процесса происходят с участием мембранносвязанных ферментов, синтез АТФ в митохондриях получил название мембранного (окислительного), в отличие от субстратного фосфорилирования. Изучение путей и механизмов трансформации энергии окисления субстратов в макроэргическую связь АТФ в окислительном фосфорилировании является актуальной проблемой современного этапа биоэнергетики. Несмотря на большой объем экспериментальных и теоретических исследований, выполненных в этом направлений, вопросы, связанные с механизмом действия АТФсинтетазы и с сопряжением энергодонорных окислительных процессов с энергоакцепторными процессами синтеза АТФ остаются по настоящее время невыясненными до конца.
В последнее время получили распространение три концепции окислительного фосфорилирования: хемиосмотическая концепция Митчелла 11J , конформационная концепция Бойера 2 J и конфор-мационно-релаксационная концепция Блюменфельда з J .
В соответствии с наиболее распространенной 4 в настоящее время хемиосмотической теорией при переносе электрона от субстрата к кислороду по ЭТЦ происходит транслокация протонов через внутреннюю мембрану митохондрий, приводящая к образованию трансмембранного электрохимического потенциала протонов. Этот трансмембранный электрохимический потенциал, по мнению Митчелла, и является первичным макроэргом. Синтез АТФ в соответствии с этой концепцией осуществляется при прохождении протонов по градиенту концентрации. С этими представлениями согласуются ряд экспериментальных данных. Однако, в последнее время появился целый ряд экспериментальных результатов, неподдающихся объяснению в рамках концепции Митчелла (более подробно об этих результатах и о самой концепции смотри в главе I).
В концепции мембранного фосфорилирования Бойера важная 5 роль отводится конформационным изменениям в белках, расположенных в пунктах сопряжения окислительного фосфорилирования. В одном из последних вариантов конформационной теории, энергия, выделяющаяся при окислении субстрата, затрачивается на перевод синтезированной молекулы АК> из связанного с ферментом состояния в свободное. Бойер полагает, что для АДФ и Фн, связанных с АТФсинтетазой равновесие реакции АДФ + $„*- АТФ смещается. вправо. А для перевода молекулы АТФ в раствор молекула фермента должна перейти в новое конформационное состояние, обладающее пониженным сродством к АТФ. Энергия, необходимая для перевода АТФсинтетазы в эту новую конформацию может передаваться ферменту либо при непосредственном взаимодействии с локализованным в пункте сопряжения компонентом ЭТЦ, изменяющим свою конформацию при окислительно-восстановительных переходах, либо - 7 -опосредовано,путем конформационного изменения в мембране и возникновения градиента рн2,5/ .
Согласно конформационно-релаксационной концепции 6 , предложенной Блюменфельдом,энергия,освобождающаяся при переносе электрона от субстрата к кислороду запасается в форме .конформа-ционно-неравновесных состояний отдельных переносчиков,их комплексов с АШсинтетазой или мембранв в целом (более подробно об этом см. гл.I).Образование ATI? осуществляется в процессе релаксации конформационно-неравновесной формы электронного переносчика-трансформатора связанного с АШсинтетазой.Другими словами, на синтез АТФ используется энергия,выделяющаяся в ходе релаксации конформационно-неравновесной формы электронного переносчика. По мнению автора конформационно-неравновесные состояния АТФсинтетазы могут реализоваться не только при взаимодействии с работающей ЭТЦ,но и при достаточно быстром изменении таких факторов общего действия как температура,рН,диэлектрическая постоянная среды и т.д..
Цель настоящей работы заключалась в исследовании принципиальной возможности синтеза АТФ митохондриями при скачкообразном изменении рН.
Работа состоит из введения,четырех глав и выводов. В первой главе рассматриваются современные теории окислительного фосфорилирования.Методика эксперимента описана в главе второй.Экспериментальные результаты и их обсуждение содержатся в третьей и четвертой главах.Б главе три приведены результаты экспериментов по исследованию влияния скачкообразного изменения рН на фосфорилирующую активность нативнох митохондрий. Показано,что при быстром повышении рН в фосфорилирующих мито- хондриях увеличивается выход АТФ.Повышение выхода АТФ наблгоет-ся только в процессе изменения рН. Анализ результатов по действию ингибиторов электронного транспорта дыхательной цепи и АТФсинтетазы,а также значения исходного и конечного рН на величину наблюдаемого эффекта,показал, что увеличение синтеза АТФ, по-видимому, связано со структурными изменениями в олигомицин-чувствительном АТФ-синтетазном комплексе,которые возникают вследствие быстрой ионизации некоторых групп белка,инициируемой быстрым защелачиванием среды.Эти результаты получили подтверждение в экспериментах с митохондриями, в которых окислительное ф осфорилирование исходно разобщено старением или переморажи-ванием.
В главе 17 показано, что в разобщенных такими способами митохондриях, в присутствии субстратов фосфорилирования и сукцината, при быстром изменении рН от 5-7,5 до 8,3-10 синтезируется в пересчете на одну ЭТЦ до трех молекул АТФ. Для образования АТФ в систнме необходимо,чтобы в процессе изменения рН проходило через значение 8,0. Величина эффекта при этом не зависит от разницы между конечным и начальным рН.если рН превышает 0,7. На одном и том же образце митохондрий вышеописанный эксперимент может быть воспроизведен без существенных изменений в конечном результате много раз. Эти и другие факты свидетельствуют о том, что регистрируемый в эксперименте АТФ возникает вследствие срабатывания АТФ-синтетазного комплекса при быстром повышении рН, а не за счет диссоциации и выхода в раствор прочносвязанных с АТФсинтетазойт нуклеотидов. Опыты с различными субстратами (сукцинат,НАДН,аскорбат+Т!Л1]Д ) и ингибиторами переноса электронов дыхательной цепи (ротенон,антими- цин, СО) и изменением содержания кислорода в системе показали, что для эффективного действия АТЭ&синтетазы (при рН-ударе) в разобщенных митохондриях необходимо, чтобы ЭТЦ находилась в частично восстановленном состоянии. Это согласуется с полученными в работе результатами по влиянию редокс состояния ЭТЦ разобщенных митохондрий на их АТФазную активность. При этом электронный транспорт, по-видимому, не является обязательным.
КОНЦЕПЦИИ ОКИСЛИТЕЛЬНОГО ФОСФОРИЛИРОВАНИЯ ( Обзор литературы) Строение электронтранспортной цепи митохондрий. Окислительное фосфорилирование играет важную роль в биоэнергетике клетки.При окислительном фосфорилировании энергия окисления субстратов преобразуется в энергию ,так называемой, макроэргической связи AT>, которая затем используется в различных энергоакцепторных процессах клетки. Ферменты окисления субстратов и фосфорилирования сосредоточены в митохондриях.
Строению митохондрий и механизму их функционирования посвящено большое количество работ. 7 8 Поэтому в данном обзоре мы лишь кратко остановимся на этом вопросе. Как известно, митохондрии представляют собой замкнутые везикулы,образованные липопротеиновыми структурами. Различают внешнюю и внутреннюю мембраны .Внешняя мембрана митохондрий проницаема для большинства низкомолекулярных соединений. Внутренняя мембрана проницаема только для очень ограниченного числа малых нейтральных, молекул и непроницаема для большинства заряженных ( Н, ОН ). 9,10,IIJ . Окисление субстратов кислородом осуществляется сложной полиферментной системой,электронтранспортной цепью,строение которой представлено на рис.1. ЭТЦ митохондрий представляет собой последовательность более или менее фиксированных структурно различных переносчиков электронов,расположенных в порядке увеличения их окислительно-восстановительных потенциалов. НАДНдегидрогеназа и сукцинатдегидрогеназа l2,I3j ,катализирующие перенос электронов от соответствующих субстратов на уби-хиноны представляют собой сложные субъединичные ферменты,содержащие железосерные центры и флавиновые коферменты.Убихинон - II -
Ко"АпМИЗвОАНОЬ^ф ЖИРНЫХ кислот "*"
Сук^ииат-*Фп reS ^M-Q^^r-FeS-c^c- Си,а,ЧГ 2
Ччасткшомо- уЧЙСТ1ц1
РМЛИРОВЛНИ*
Некоторые %яжные
ИНГИБИТОРЫ
УчастокБІ ^чйстокИ I TOR ротенои
АМИТАЛ пиерицидии А прогестерон лнтимиции J
РАСТВОРИМЫ* цитохропС
I I I
Некоторые не- j Фиэиологичес- л KV№ СУБСТРАТЫ V
ФЄРРИЦИАНМА
НЄФЄРИЄНТА- і тивно І QCKOP6AT т Рис. І Схема электронтранспортной цепи митохондрий. - 12 -передает электроны в цепь,состоящую из цитохромов в, с4 , с, а,а$ и железосерного белка Риске (рис.І)і8,І8Д9,20,2І,22, 23,24,25,26,27,28,29,30,3IJ . В иследованиях по структуре и функционированию ЭТЦ широко используются различные ингибиторы. Б частности,применение ингибиторов в сочетании с оптической и ЭПР спектроскопией позволило выяснить последовательность переносчиков ЭТЦ и пункты сопряжения окислительного фосфорилирова-ния 22,23 ] .
Кинетика переноса электронов в митохондриях. На схеме I приведена кинетическая последовательность окисления переносчиков ЭТЦ в митохондриях при импульсной подаче кислорода к исходно анаэробным митохондриям (периоды полупревращения в окисленную форму оосчитываются от момента введения кислорода )[32,ЗЗЛ . 00^0а0х51а^с^ мсек. _ 5 _1500 _ 100 Л200 _ф_ мсек с сг ^ Б ФПіІІ п 5 . 100 та 100 ^ 300 жп мсек. С сх вф в^ Фпш (полупериоды времени электронного переноса мезду соседними переносчиками, инициируемого импульсной подачей кислорода к анаэробным митохондриям.)
Сопоставление кинетичвских данных по переносу электрона через ЭТЦ с другими фактами,относящимися к функционированию ЭТЦ и отдельных переносчиков,приводит к ряду противоречий. Например, как следует из схемы 1.,при переносе.; электронов от НАДН (сук-цината) к кислороду после цитохрома с процессы резко ускоряются. Это означает,что окисление цитохромов происходит значительно -ІЗ -быстрее их восстановления ( 100 раз ) и,следовательно,в стационарном режиме они должны находиться в среднем в окисленном состоянии. В действительности же 15% цитохромов находятся в восстановленном состоянии 32,337 . Это кажущееся противоречие, по-видимому, объясняется тем, что скррости электронного переноса между компонентами цитохромной системы в стационарном режиме отличаются от этих скоростей в условиях ,в которых бы- -ли получены данные ,приведенные на схеме 1,т.е. при взаимодействии кислорода с анаэробными митохондриями. Лузиков исоавторы С 34] ,исследуя стационарную кинетику электронного переноса в разобщенных СМЧ при разных концентрациях НАДН, обнаружили что константы скорости переноса электронов между соседними лереносчикамиЭТЦ, вычисленные по уравнению Принсгейма, увеличиваются в 10-20 раз с ростом абсолютной скорости процесса ( в этих опытах скорость переноса электронов по цепи определялась скоростью поступления ВДДН» которую можно было регулировать). Для пары цитохром b-cj изменялась от 90 до 1000 сек. Для пар цитохром с-а и цитохром а-азот 25-33 до 500 сек. .
Зависимость констант скорости электронного переноса между отдельными компонентами ЭТЦ от скорости электронного потока авторы интерпретируют активацией цепи 34] . Время жизни активной формы электронных переносчиков составляло 6-Ю мсек. [34] . Возможны два объяснения этого явления. Варфоломеев и соавторы полагают,что эффект активации связан с тем,что константы скорости переноса электрона между отдельными компонентами ЭТЦ зависят от степени её окисленности 35j. Дело в том, что восстановление одного или нескольких ( но не всех) компонентов дыхательной цепи может приводить к изменению их конфор- - 14 -мации,а следовательно,и взаимодействия с соседними окисленными электронными переносчиками. Это ,в свою очередь, повлияет на строение и свойства каждого переносчика и ЭТЦ в целом.
Другое возможное объяснение заключается в образовании при переносе электрона неравновесных форм переносчиков с измененой активностью f86,88,90,91 J. Теоретически .процессы с участием электронтранспортных белков можно разбить на две стадии, одна из которых представляет собой быстрые локальные изменения химической и электронной структуры активного центра (индуцированные присоединением электрона или потерей электрона ) непосредственно сопровождающиеся колебательной релаксацией самого активного центра и его ближайшего окружения. Характерные времена этой стадии 0,1- I псек. Такие практически мгновенно реализующиеся изменения затрагивают только атомные группы активного центра, в то время как остальная часть белковой глобулы остается неизменной. Вместе с тем новому состоянию активного центра должна,в принципе, соответствовать иная разновесная конформация всего белка. Между отрелаксировавшей и,-неизменившейся частями макромолекулы возникает стерическое напряжение, которое снимается в ходе конфорационнои релаксации. Релаксация к новой конформации после быстрых локальных изменений в активном центре ( вторая стадия) как правило, требует координированного разрыва и образования большого числа слабых связей и может длиться от нескольких десятков микросекунд до секунд.Таким образом после быстрого изменения химического состояния активного центра может возникнуть специфическое(ие) промежу-точное(ые) ("возбужденные") состояние(ия), в которых локальные изменения и сопровождающая их колебательная релаксация бли- - 15 -жайшего окружения активного центра уже произошли (активный центр находится в новом локально кзазиравновесном состоянии), а конформация остальной части макромолекулы отличается от равновесной (на начальных стадиях конформационной релаксации она остается близкой к исходной). Очевидно, что время жизни таких интермедиатов будет определяться длительностью конформацйонных перестроек в молекуле белка. Естественно ожидать, что белковые макромолекулы в промежуточном конформационно-неравновесном состоянии могут существенно отличаться от соответствующих равновесных состояний по своим физическим и химическим характеристикам. Теоретически такая возможность была рассмотрена для случая цитохрома с Блюменфельдом и Чернавским / 86,90,102,116 /. Эти авторы пришли к заключению о принципиальной возможности возникновения при функционировании этого электронтранспортного белка промежуточных состояний с измененной активностью. Экспериментально образование нестабильных состояний было зарегис- . трировано при окислительно-восстановительных превращениях структурно и функционально различных металлсодержащих белков./24, 25,26,27,28,88/ В частностности было показано,что при восстановлении железосерных и гемсодержащих белков образуются промежуточные состояния,которые по своим спектральным характеристикам заметно отличаются от соответствующих равновесных форм. /86,87,88,89,90/ 91,95,102/. Релаксация неравновесных форм белков к равновесному состоянию,как правило, описывается двух-трех стадийной мономолекулярной кинетикой с константой скорости -I04 І/сек. В работах /88,89,91/ было показано,что образующиеся при восстановлении неравновесные формы белков проявляют в окисли-, тельно-восстановительных процессах повышенную реакционную способность. Так ,например, константы скорости реакции окисления неравновесного ферроцитохрома пластоцианином и феррицианидом выше соответствующих значений констант для аналогичных процессов с участием равновесных форм белка в 3-20 раз. Еще большие величины этой разницы наблюдается в реакциях с участием неравновесных форм ферредоксина, пероксидазы, гемоглобина и миогло-бина [88, 96, 105]. На основании выше изложенного можно предположить [Ї05] , что при достаточно большой абсолютной активности электронного транспорта конформавдонная релаксация отдельных переносчиков не успевает произойти за время между актами электронного переноса, и переносчики при этих условиях все время находятся в состоянии с повышенной реакционной способностью.
На кинетические параметры ЭТЦ митохондрий сильное влияние оказывают субстраты и продукты фосфорилирования. Добавление ДЩ5 и Фн приводит к резкому увеличению скорости дыхания. Напротив, в присутствии АТ скорость переноса электрона от субстрата дыхания к кислороду сильно замедляется, а на участках сукцинат-дегидрогеназа-НАДНдегидрогеназа и цитохром в - c-j-, наблюдается обращение электронного потока. На основе тщательного анализа результатов экспериментов по влиянию субстратов дыхательной цепи и фосфорилирования Чане указал на пять возможных состояний митохондрий [22,23 J . в состоянии I, которое реализуется в отсутствие добавленных из вне субстратов дыхания и фосфорилирования, переносчики ЭТЦ частично восстановлены. Добавление ДЦФ переводит, митохондрии в состояние 2 (все переносчики становятся окисленными), а скорость дыхания лимитируется только количеством субстратов окисления. Если добавить теперь субстраты окисления, то митохондрии переходят в активное состояние, в котором переносчики снова становятся частично восстановленными, а ско- рость электронного транспорта определяется поступлением субстратов через внешнюю мембрану митохондрий и активностью фосфо-рилирующих ферментов. Когда значительная часть добавленного АДФ израсходуется (превратится в АТФ), возникает состояние дыхательного контроля (состояние 4), в котором скорость дыхания снова замедляется и лимитируется отношением АТФ/ДЩ&. В отсутствие кислорода митохондрии находятся в состоянии 5 (анаэробиоза) , в котором все переносчики восстановлены.
Влияние субстратов фосфорилирования на скорость дыхания отражает наличие сопряжения между процессами электронного транспорта и фосфорилирования.
Сопряжение экзергонических и эндергонических процессов.
Явление окислительного фосфорилирования было открыто Эн-гельгардтом в 1930 году [37] . Белицер и Цыбакова [38] выяснили соотношение между процессами окисления и фосфорилирования, т.е. отношение числа молекул этерифицированного неорганического фосфата к числу молекул кислорода (Р/0). При окислительном фосфорилировании энергия, освобождающаяся при переносе электрона от субстрата к кислороду трансформируется в энергию т.н. макроэргической связи АТФ, т.е. в мембранном фосфорилировании осуществляется сопряжение энергодонорнои реакции окисления субстрата дыхания и энергоакцепторной реакции фосфорилирования ДЦФ. Интактные фосфорилирущие митохондрии в литературе еще называются сопряженными.
Донор — .^-^Ог, ДЦФ + ^ ^4 АТФ + HgO Gott(стандартное изменение свободной энергии при рН 7, P=const T=const , t =25С, В/М Mg 2+) составляет 7,6 ккал/моль АТФ.
При окислении НАДН в сопряженных митохондриях на каждый атом поглощенного кислорода образуется три молекулы АТФ. (Р/0 = 3), если же субстратом ЭТЦ служит сукцинат, то Р/0 = 2. В митохондриях фосфорилирование Щ> осуществляется с помощью сложного субъединичного ферментного комплекса - АТФсинтетазы (о структуре и функциях ее см. ниже). Суммарный процесс окислительного фосфорилирования можно записать следующими уравнениями:
НАДН + Н* + 1/2 02 * НАД+ + Н20 (до'= 52,7 ккал/моль)
ЗАДФ + 3$н - ЗАТФ + Ж%0 (ag^ -21,9 ккал/моль).
То обстоятельство, что для НАДН и сукцината Р/0 ^2 означает, что прохождение электрона вдоль ЭТЦ может сопровождаться фос-форилированием АДФ в нескольких пунктах (т.н. пункты сопряжения) . Используя данные по влиянию перехода из состояния 4 в состояние 3 на степень окисления отдельных переносчиков электронного транспорта, по действию ингибиторов электронного транспорта и разобщителей окислительного фосфорилирования, Чане 22, 23J выдвинул гипотезу о локализации отдельных пунктов сопряжения в цепи электронного транспорта. Фосфорилирование АДФ происходит в трех пунктах (см. рис. 2), локализующихся на участке НАДН-флавопротеид, пит. в - цит. Cj и на цитохром-оксидазе. В пунктах сопряжения наблюдается наиболее значительный перепад окислительно-восстановительного потенциала меад-переносчиками (рис, 3). Следует отметить, что для синтеза АТФ требуется прохождение через пункт сопряжения двух электронов
132].
Для характеристики фосфорилирующей активности митохондрий часто используется способность ДЦФ влиять на скорость дыхания. В качестве параметра используется величина отношения скорости дыхания в присутствии ДЦФ к скорости дыхания без него: f = К' у2 так называемый, коэффициент дыхательного контроля. В неповрежденных митохондриях в отсутствие .да скорость дыхания практически равна нулю. Однако, на практике при выделении митохондрий повреждаются и поэтому коэффициент дыхательного контроля не превышает 7.
Известно большое количество соединений, ингибирующих окислительное фосфорилирование. К ним относятся 2,4-динитрофенол, карбонилпианид^енилгидразоны и антибиотики - валиномицин, грамицидин, нигерицин, олигомицин, ауровертин. Все ингибиторы окислительного фосфорилирования по их механизму действия можно разбить на три группы.
2,4-динитрофенол и карбощанид^фенилгидразоны стимулируют транспорт электронов, но подавляют синтез АІФ (т.е. нарушают сопряжение). Это - так называемые, разобщители окислительного фосфорилирования L64, 82-84J .
Другой класс ингибиторов представлен антибиотиком валино-мицином, который также нарушает процесс фосфорилирования при активации дыхания. Соединения этого класса отличаются от 2,4--динитрофенола тем, что для проявления их разобщающего действия необходимо присутствие К+. Предполагается, что разобщающее действие двух указанных выше типов, в основном связано с их прото-нофорной или ионофорной активностью (более подробно об этом см. ниже) [ 43 ] .
В отличие от разобщителей окислительного фосфорилирования соединения третьего типа, в частности олигомицин, оказывают ин- гибирущее действие на мембраносвязанную АТФсинтетазу.
Структура и механизм действия АТФсинтетазы.
В энергопреобразующих мембранах синтез АТФ осуществляется специализированной ферментной системой - АТФсинтетазным комплексом. Этот комплекс состоит, по крайней мере, из девяти различных полипептидов [83, 84] . Согласно современным представлениям в АТФсинтетазный комплекс входят две различные функциональные компоненты, так называемые, факторы VQ и Pj (рис. 2). Фактор Pj содержит каталитический центр, в котором осуществляется фосфори-лирование АДФ. Предполагается, что VQ функционирует как проводник протонов через мембрану к каталитическому центру Pj. Гидрофобный фактор Г0 локализуется во внутренней митохондриальной мембране и состоит из трех субъединиц. Г- присоединен к 3?0 (мол. вес 430 кД) с помощью ^ -субъединицы и, так называемого, олигомицин-чувствительного белка и выступает в митохондриальный матрикс. Pj легко может отделяться от мембраны при обработке мочевиной, хелаторными соединениями или созданием низкой ионной силы. Фактор 5j растворим в воде и имеет молекулярный вес 300--400 кД. Субъединичный состав Bj- слабо зависит от источника выделения и имеет структуру, изображенную на рис. 2. О субъединичной структуре Pj нет единого мнения, предполагается, что он может иметь структуру [84] oCg вг V6\~ (Рэкер) или оС3 j93 yS& (Козлов). По мнению Скулачева активный центр локализован на fi-субъединице. Изолированный Pj эффективно катализирует гидролиз, но не синтез АТФ. На АТФазную и синтетазную активность комплекса сильно влияет взаимное расположение факторов FQ и Pj, причем при неправильном присоединении-Pj к Р0 фермент теряет чувствительность к действию олигомицина. Предполагается, что
Рис. 2. Схематическое изображение строения АТФазы митохондрий. ингибирующее действие олигомицина обусловлено тем, что он закрывает протонный канал фактора -Г0.
Одним из основных и наименее понятных вопросов мембранного фосфорилирования является механизм сопряжения экзергонической реакции окисления субстратов дыхания с экзергонической реакцией синтеза АТФ.
Теория окислительного фосфорилирования.
Первой была предложена, так называемая, химическая концепция окислительного фосфорилирования [22, 23, 39j . Б основе этой теории лежат те же предположения, что и в теории субстратного фосфорилирования, т.е. энергия запасается в форме ковалент-ной "высоко" энергетической связи между одним из переносчиков--трансформаторов (Т) и лигандом (I) неизвестной природы. Ав+во + 1^Ао 1+Бв А0 I + X z± А0 + X I X I + Ф„ ^ X Ф + I X Ф + АИФ ^ X + АТФ
Ав + В0 + ДИ^ + Фн AQ + Вв + АТФ
Многочисленные попытки зафиксировать и зарегистрировать промежуточные продукты А0~1, Х~1, Х~Р не увенчались успехом. Поэтому в последнее время все большее распространение получают физические концепции мембранного фосфорилирования.
Как реакция на неудачи химической теории мембранного фосфорилирования получила широкое распространение хемиосмотическая концепция, предложенная Митчеллом в 1961 году [і] . Хемиосмоти-ческую концепцию довольно трудно изложить подробно, так как детали этой концепции, впрочем как и всякой рабочей гипотезы, постоянно меняются в свете уточнения экспериментальных данных, поэ- тому здесь приведены только основные постулаты этой теории и некоторые касающиеся ее экспериментальные данные [і, 4, 40-49] . Мембранное фосфорилирование согласно этой концепции осуществляется в замкнутых везикулах с низкой проницаемостью мембран для Н* и ОН"" (а также для некоторых других ионов К+, На+ и т.д.). Перенос электронов по ЭТЦ сопровождается переносом протонов через внутреннюю митохондриальную мембрану (т.н. протонный насос). Этот процесс обеспечивается ассиметричным расположением переносчиков относительно обеих сторон мембраны (рис. 3). В случае митохондрий этот насос выкачивает протоны из матрикса во вневези-кулярное пространство. Транслокация протонов через мембрану вызывает возникновение градиента концентрации протонов. Результирующая разность электрохимических потенциалов протонов (по Митчеллу протонодвижущая сила Р) равен р я д ^ - 2х2„|р_ Д рН и является, как бы, первичным "макроэргом". Как следует из выражения (I) ЭХП ионов водорода состоит из двух компонентов: электрической д v^ , обусловленной различным содержанием положительных и отрицательных зарядов по обе стороны мембраны (рис. 3) и осмотической (концентрационной), представленной разностью концентраций ионов Н"*" между отсекали, разделенными мембраной ( д рН). При митохондриальном окислении одной молекулы НАДН через мембрану переносится не менее 6 протонов (Н"У2е~ = H"Vo=6), в случае сукцината HVo = ІҐ"/2е~ = 4. Синтез АТФ осуществляется при прохоздении протонов по градиенту концентрации через ориентированный АТФсинтетазный комплекс. В соответствии с хемиосмо-тической концепцией на каждые два протона, прошедшие через АТ$-синтетазный комплекс синтезируется одна молекула АТФ. Учитывая, - 24 ~ „2H+
Н* 2Н4 2Н+ Св*
Рис. 3. Схема окислительного фосфорилирования в митохондриях по хемиосмотическои концепции. что ^G» ( рН 7, = 25 С) для синтеза АТФ составляет 34,5КДж/моль /43/ и полагая,что для образования одной молекулы требуется прохождение через АІФсинтетазу двух протонов, можно считать,что необходимый градиент рН будет равен 35/ (2 5,7)= 3 ед. рН. Однако при степени фосфорилирования 10% градиент рН должен составлять 5 ед. рН. Экспериментально показано,что прохождение электронов по дыхательной цепи действительно индуцирует разность рН и, что искусственно созданный градиент рН ( по обе стороны мембраны) приводит к синтезу АТФ, но требуемого порядка величин в градиенте рН не наблюдалось. Вместе с тем, если мембрана заряжена без накопления избытка протонов в среде, то на мембране возникает потенциал,который может быть иг пользован для синтеза АТФ так же как и протонный градиент. Градиенту рН в Зед. рН будет эквивалентен мембранный потенциал д \/>z 0,177В. Изменение свободной энергии при прохождении сквозь мембрану моля ионов водорода выражается уравнением до =5,708 рН = 96,5 ду» кДж/моль. Суммарный эффект градиента рН и мембранного потенциала ( оба выражаются в вольтах) называют протонодвижущей силой р = ли, - 2,.3-ВЇ д рН ( t=25?C; 2,3 КР*0,0592) т Р
Поскольку мембранный потенциал митохондрий как и хлоропластов непосредственно измерить очень трудно, этот постулат на наш взгляд не прошел еще необходимой проверки. Гипотеза Митчелла стимулировала постановку множества экспериментов. Ряд экспериментальных результатов согласуется с представлениями хемиосмотической концепции. Было установлено, что в энергопреобразующих мембранах на различных объектах при переносе электронов осуществляется трансмембранный перенос протонов,который обычно регистрируется по закисленню или защелачиванию вневезикулярного пространства. Скулачевым и Либерманом с соавторами /50-56/ экспериментами с применением проникающих синтетических ионов было показано,что в фосфорилирующих митохондриях существует трансмембранный потенциал. В рамках хемиосмотической концепции находят простое объяснение разобщающее действие протонофо^ов и ионофоров, явление ,'"" дыхательного контроля, влияние АТФ на редокс потенциал отдельных компонентов ЭТЦ и индуцированный АТФ ионкнй транспорт в мембранах. Одним из основных экспериментальных доказательств концепции Митчелла считаются опыты по синтезу АТФ мембранным АТФ-синтетазным комплексом в условиях искусственно созданного градиента рН. В серии работ Ягендорфа и Юрайба было показано/57-59/ что при быстром увеличении рН ( от 4 до 8) в суспензии хлороп-ластов синтезируется до 50-80 мол. АТФ на каждый комплекс (ЯЧЕ. Процесс не требовал световой энергии, не зависел от активности редокс цепи и тормозился разобщителями. В подобных условиях Хин-кель / 60/ наблюдал синтез АТФ СМЧ. Максимальный выход (10 мол. АТФ на-Г-I) был при сочетании градиента рН с мембранным потенциалом. В ряде работ было продемонстрировано, что комплекс.Г-0 ---Г-І, встроенный в липосомы способен синтезировать АТФ при наложении д рН. В этих экспериментах д рН генерировали либо быстрым изменением рН среды, либо встроенным в эти липосомы бакте-риородопсином [бі, 63] . Следует отметить, что эффективность индуцируемого д рН синтеза АТФ в таких системах увеличивается при наложении мембранного потенциала. В свете этих данных оказался несколько неожиданным результат, полученный Митчеллом [64] по синтезу АТФ митохондриями при быстром закислении среды. Для того, чтобы увеличить диапозон д рН, он предварительно выдерживал митохондрии при рН 9, а затем скачкообразно понижал рН до 4,2-3,9. При таком изменении рН синтез АТФ не превышал трех мо- лекул АТ2> на 5-І. Оставаясь в рамках хемиосмотической концепции трудно понять почему эта работа не была повторена и сам Митчелл не ссылается на него. Следующее предположение этой теории состоит в обратимости процесса фосфорилирования. При гидролизе АТФ возникает трансмембранный градиент протонов. Кроме того известно, что энергия АТФ может быть использована для транспорта ионов через мембрану против градиента их концентрации [б5, 6б] . В рамках этих представлений следовало бы ожидать синтеза АТФ при обращении ионных потоков. Действительно, синтез АТФ в митохондриях наблюдали не только в присутствии градиента протонов, но и при наложении градиента К+ или Ca"*"t Кокрелл б5, 66J показал, что выход ионов К+ из митохондрий, инкубируемых в безкалиевой среде в присутствии валиномицина может быть сопряжен с фосфори-лированием АДФ. Этот результат был подтвержден Евтодиенко ^67j , который получил также указание на возможный синтез АТФ при выходе из митохондрий ионов С а44- по концентрационному градиенту. Синтез АТ сопряженный с выходом К* был подробно исследован Росси и Аццони [б8] , показавшими, что этот процесс характеризуется теми же свойствами, что и окислительное фосфорилирование, отличаясь от последнего лишь способом энергообеспечения. Было найдено, в частности, что выход К+ из митохондрий, подобно дыханию в состоянии 4, ускоряется добавкой АДФ и Фн. Разобщитель нигерицин и олигомицин тормозили процесс фосфорилирования.
Б последние годы, однако, появился ряд новых экспериментальных данных, которые либо не согласуются с этой гипотезой (в ее первоначальном варианте), либо интерпретация их вызывает затруднение [б9-82] . Рядом авторов было показано, что при окислительном фосфорилировании отсутствует корреляция между измене- ниєм &ffii+ и д*р . В частности, по данным Вильсона [б9] изменение дрН от I до 0 при постоянном мембранном потенциале ( Л^ = 130 мВ) практически не влияет на фосфатный потенциал в митохондриях и на скорость дыхания. Уменьшение дуи^+ на 58$ (в основном за счет изменения мембранного потенциала) приводит лишь только к небольшому уменьшению энергии, используемой для синтеза АТЗ>. Это согласуется также с данными Маршанского Г70_] , который показал, что активность ЭТЦ и АТШсинтетазы не коррелирует с величиной мембранного потенциала. В ряде случаев в фос-форилирующих мембранах значение AJUh*оказывается значительно меньше, чем это необходимо по хемиосмотическому механизму. Коул и Алии [7IJ описали систему окислительного фосфорилирования в надосадочной фракции из хемиавтотрофа т. Haveiius 9 которая не содержит мембранных структур и частиц, регистрируемых электронным микроскопированием. В этих системах фосфорилирование было сопряжено с окислением тиосульфата, сукцината и аскорбата кислородом (Р/0 = 0,96; 1,9; 0,76, соответственно). Образование АТ полностью подавлялось ДШ и производными фенилгидразона. Низкие концентрации олигомицина (0,5 мкг/мг б) также выключали фосфорилирование. Недавно Келлем Г72] было показано, что в штамме такой эффективный разобщитель мембранного фосфорилирования как протонофор Ш> не влиял на их фосфорилирующую активность. С друтой стороны по данным Ротенберга [73J анестетик-хлороформ, который полностью ингибирует синтез АТФ в митохондриях печени крыс в концентрации І ш, тем не менее не влияет на электрохимический трансмембранный потенциал протонов.
Конформационная теория сопряжения окисления и фосфори- лирования. В 1964 г. Бойер [8б] высказал предположение о том, что окисление и фосфорилирование в митохондриях могут быть сопряжены посредством конформационных изменений фермента, участвующего в переносе электронов и/или энергии. Предполагалось, что энергия E'SH —js:^ BrSH 2t-fi.~#. в^3 -> kse + ATP COOH чСООН ЧС0 COOH окисления затрачивается на создание напряженной конформации фермента. Последующее возвращение в исходную конформадию сопровождается использованием накопленной энергии, для синтеза высокоэнергетического соединения, например, тиоэфира, образовавшегося в результате реакции между карбоксильной и сульфгидрильной группами фермента. Затем происходит перенос энергии на ДО. С этими представлениями согласуются экспериментально обнаруженные структурные изменения отдельных компонентов дыхательной цепи, АТФсин-тетазы и митохондриальной мембраны в целом [2, 5, 85-92І . Идея относительно конформационного сопряжения синтеза АТФ и переноса электронов становится еще более привлекательной, если учесть, что АТФ используется в мышцах для совершения механической работы. В этом случае гидролиз АТФ сопряжен с относительным движением белковых компонентов в мышцах. Весьма резкое изменение формы митохондрий при переходе между сост. 4 и 3 навело Грина [93] на мысль о том, что фосфорилирование неразделимо связано с кон-формационными изменениями в мембранных белках. Следует однако отметить, что в последние годы представления Бойера претерпели существенное изменение. В соответствии с одной из последних его концепций, в активном центре фермента АДФ и Фн могут соединяться - зо - спонтанно почти без притока энергии, однако образующийся АТЗ> прочно связан с ферментом и для его удаления требуется энергия. Эта энергия обеспечивается изменением конформации фермента (при этом фермент переходит в новое конформационное состояние с пониженным сродством к ATI), вызываемым возникающим при электронном транспорте градиентом протонов 5, 94]
Иной подход к проблеме мембранного фосфорилирования используется в конформационно-релаксационной концепции [3, 6, 88, 95--97J Блюменфельда. В соответствии с этой концепцией энергия, освобождающаяся при переносе электрона от субстрата к кислороду запасается в форме конформационно-неравновесных состояний электронных переносчиков-трансформаторов в пунктах сопряжения, их комплексов с АТФсинтетазой и/или мембраны в целом. Образование АН осуществляется в процессе релаксации конформационно-неравно-весной формы электронного переносчика-трансформатора, связанного с АНсинтетазным комплексом. Рассмотрим более подробно этот механизм. В каждом пункте сопряжения осуществляются процессы, схематически изображенные на схеме B.jS М -1-* B~S М -~»» B~S*M — 2— B2S М* --.ІФ-BgS м** —5—в1s м ; в. s м ^исходное состояние переносчика-трансформатора В, мембраны М, АТФсинтетазы - g
После присоединения электрона (быстрая стадия I) к металлу активного центра переносчика-трансформатора В быстро произойдет колебательная релаксация активного центра и близлежащих групп, но вся молекула переносчика Bj с восстановленным активным центром останется в исходном ("окисленном") конформационном состоянии, т.е. в результате присоединения электрона конформация переносчика не меняется, но становится неравновесной (Bs М). By медленно - ЗІ - релаксирует к равновесному состоянию В (где конформация белковой глобулы В находится в равновесии с восстановленным активным центром). Релаксация неравновесной конформации переносчика в пункте сопряжения сопровождается образованием химической мак-роэргической связи в сопрягающем ферменте s f что приводит к изменению конформации этого белка (стадия 2). Новая конформация АТФсинтетазы s* вызывает соответствующий релаксационный процесс целого участка мембраны, новая конформация которого определяется в конечном счете состоянием переносчиков и образовавшимися первичными макроэргическими связями. Далее электрон быстро переносится на следующий акцептор (стадия 3), а мембрана, которая стала неравновесной в результате изменения АИсинтетазы релакси-рует к новой равновесной структуре М (стадия 4). В состоянии Bg3 М переносчик-трансформатор не может принять электрон от донора (поскольку соответствующие уровни не совпадают), а измененная структура мембраны затрудняет релаксацию Bg—»-Bj. В отсутствии акцепторов энергии (субстратов фосфорилирования) состояние В2Л*медленно релаксирует с выделением тепла в исходное состояние (дыхательный контроль). Фосфорилирование ДЦФ снимает химическое напряжение ( s*--*s) и ускоряет релаксацию всей системы, замыкающей цикл (стадия 5). В рамках этих представлений регуляция дыхания и фосфорилирования в энергопреобразрщих мембранах объясняется следующим образом. Благодаря кооперативным свойствам мембраны, состояние отдельных переносчиков, а следовательно и их активность, и времена их релаксационных изменений взаимосвязаны. Исходное состояние переносчика-трансформатора перед рабочим ходом существенно неравновесно, а перепад энергии при его релаксации определяется не только его собственными ха- - 32 -рактеристиками, но и состоянием целых участков мембраны, которое, в свою очередь, зависит от ситуации в других пунктах сопряжения данной ЭТЦ, а может быть и других ЭТЦ. Предполагается, что в правильно работающей фосфорилирующей мембране перепад энергии при релаксации В^В^ каждого переносчика-трансформатора к моменту его восстановления становится равным или превышает величину необходимую для синтеза одной молекулы АТФ. Стехиометрия процесса ( прохождение двух электронов через пункт сопряжения приводит к синтезу одной молекулы АШ) выполняется только в среднем. Перенос электрона через всю ЭТЦ к С^ приводит к образованию либо одной, либо двух молекул АТФ ( в среднем 1,5) в зависимости от мгновенного состояния ЭТЦ. По мнению Блюменфельда, в ситуации, когда конформация переносчиков и положение электронных уровней существенно неравновесны, бессмысленно пользоваться обычными термодинамическими функциями и, в частности, О-В потенциалами. Скорости отдельных сталий цикла и, следовательно, отношение концентраций окисленных и восстановленных форм переносчиков могут существенно зависеть от состояния мембраны.
Релаксация к равновесию может происходить не только путем изменения конформации макромолекулы, но и за счет изменения ее поверхностного заряда. Возникающая после переноса электрона конформация переносчика-трансформатора неравновесна не только геометрически, но и электрически. Если возможно достаточно быстрое изменение поверхностного заряда, то релаксация к равновесию возможна и без значительного изменения геометрии. Предполагается, что разобщители способны осуществлять быструю электрическую релаксацию переносчика-трансформатора и мембраны в целом, в присутствии разобщителей электронные уровни будут снижаться настолько быстро, что химические "макроэрги" не успевают возникнуть, а время переноса электронов через пункт сопряжения резко уменьшится. В последние годы в литературе /появились экспериментальные данные, подтверждающие представление об участии неравновесных форм белков, их комплексов и мембраны в целом в биоэнергетических процессах. Экспериментами с отдельными компонентами ЭТЦ было показано,что при их редокс превращениях возникают кон-формациокно-неравновесные состояния с измененными физическими и химическими свойствами. На наличие таких состояний в функционирующей ЭТЦ митохондрий указывают вышеупомянутые результаты Лузикова и соавторов по активации электронного транспорта /34,35/ а также его данные по влиянию функционального состояния митохондрий на эффективность действия различных денатурирующих агентов / 35/. Было установлено, что функционирующие митохондрии более резистентны к денатурирующему действию нагревания и протеоли-тических ферментов по сравнению с полностью окисленной или полностью восстановленной формой митохондрий. В рамках этой концепции находят простое объяснение изменение редокс потенциалов и спектральных характеристик цитохромов в и химических свойств цитохромоксидазы при энергезации митохондрий / 13-21, 23-29, 88, 95-105/. Имеются также указания на участие в процессах мембранного фосфорилирования нестабильных форм АТФсинтетазы /104,107/. По данным Лузикова /34, 35/ в фосфорилирующих митохондриях увеличивается резистентность АТФсинтетазы по отношению к инакти-вирующему действию протеолитических ферментов и тепловой обработке. Наконец, недавно, методом низкотемпературной ЭПР-спектро-скопии было показано, что железосерный компонент НАДНдегидроге-назы митохондрий ( т. н. центр N-2), расположенный в первом пункте сопряжения, в интенсивно фосфорилирующих митохондриях находится преимущественно в неравновесном состоянии, в то время как в митохондриях с разобщенным окислительным фосфорилировани-ем все центры N_2 находятся практически в равновесном состоянии. [99J . Кроме того, Ониши и соавторы [іОб] показали, что в фосфорилирующих митохондриях изменяется окислительно-восстановительный потенциал центра я_2. Подобные результаты были получены и для других переносчиков-трансформаторов цитохрома в и цитохром-оксидазы, расположенных во 2 и 3 пунктах сопряжения [I00-I04J .
Из вышесказанного следует, что в основе конформационной и хемиосмотической концепции мембранного фосфорилирования лежат существенно различные физические принципы трансформации энергии. В первой, трансформация энергии, освобождающейся при переносе электрона в энергию "макроэргической" связи АТФ, осуществляется с помощью трансмембранного электрохимического потенциала. В конформационной теории этот процесс осуществляется с участием электронных переносчиков-трансформаторов в энергизованных кон-формационно-неравновесных состояниях.
Концепция Митчелла стимулировала постановку большого количества экспериментов и подверглась экспериментальной проверке. Многие экспериментальные данные находят удовлетворительное объяснение в рамках этой концепции. Однако, трудности, с которыми столкнулась эта концепция при интерпретации ряда данных (см. обзор стр. 27, 28) указывают на необходимость более осторожного к ней отношения. На наш взгляд физически не менее привлекательной является конформационно-релаксационная гипотеза, которая, однако является более феноменологической и еще не подверглась столь тщательной экспериментальной проверке. В связи с этим представлялось интересным исследовать возможность участия таких конформационно-неравновесных состояний в процессах мембранного фосфорилирования. По конформационно-релаксационной концепции требуемое конформационное изменение АТХ&синтетазы можно в принципе инициировать и без участия переносчика-трансформатора, с помощью других возмущающих воздействий, например, скачкообразным изменением гидрофобных свойств окружения, температуры, ионной силы, рН [l07] .
Целью настоящей работы являлось изучение фосфорилирования митохондрий при скачкообразном повышении рН среды, т.е. в условиях, противоположных требуемым хемиосмотическим механизмом.
Строение электронтранспортной цепи митохондрий
Окислительное фосфорилирование играет важную роль в биоэнергетике клетки.При окислительном фосфорилировании энергия окисления субстратов преобразуется в энергию ,так называемой, макроэргической связи AT , которая затем используется в различных энергоакцепторных процессах клетки. Ферменты окисления субстратов и фосфорилирования сосредоточены в митохондриях.
Строению митохондрий и механизму их функционирования посвящено большое количество работ. 7 8 Поэтому в данном обзоре мы лишь кратко остановимся на этом вопросе. Как известно, митохондрии представляют собой замкнутые везикулы,образованные липопротеиновыми структурами. Различают внешнюю и внутреннюю мембраны .Внешняя мембрана митохондрий проницаема для большинства низкомолекулярных соединений. Внутренняя мембрана проницаема только для очень ограниченного числа малых нейтральных, молекул и непроницаема для большинства заряженных ( Н, ОН ). 9,10,IIJ . Окисление субстратов кислородом осуществляется сложной полиферментной системой,электронтранспортной цепью,строение которой представлено на рис.1. ЭТЦ митохондрий представляет собой последовательность более или менее фиксированных структурно различных переносчиков электронов,расположенных в порядке увеличения их окислительно-восстановительных потенциалов. НАДНдегидрогеназа и сукцинатдегидрогеназа l2,I3j ,катализирующие перенос электронов от соответствующих субстратов на уби-хиноны представляют собой сложные субъединичные ферменты,содержащие железосерные центры и флавиновые коферменты.
Выделение митохондрий
Митохондрии из печени крыс (линии Ввстар) выделяли по несколько модифицированному методу, описанному в работе (108J .
У декантированных крыс извлекали печень и помещали в стакан с охлажденной ( t = 4-6С) средой выделения, содержащей 0,25 М сахарозы, 0,03 М ТРИС НЯ рй 7,4 и 0,001 М этилендиамин-тетрауксусной кислоты. Печень разрушали с помощью Френч-пресса. Измельченную печень гомогенизировали в среде выделения в течение 30-40 секунд в стеклянном гомогенизаторе с тефлоновым пестиком при t = 4 6С, а затем центрифугировали на центрифуге Т-24 в течение 10 минут при 600 об/мин. При этом осаждаются ядра и клеточные мембраны. Надосадочную жидкость осторожно декантировали и центрифугировали в течение 15-20 минут при 6000 об/мин. Осадок митохондрий ресуспензировали с 1-2 мл среды инкубации, содержащей 0,25 М сахарозы, 0,03 М ТРИС HCIpH 7,4, 0,001 М ЭДТА в стеклянном гомогенизаторе. Последний процесс повторяли два раза и хранили при 0С.
Качество выделения проверяли путем измерения дыхательного контроля (К). Величина К свежевыделенных препаратов митохондрий варьировала от 4-7.
Часть экспериментов была выполнена на митохондриях из сердца быка, любезно предоставленных М.Маршак (лаборатория Скулачева). Дыхательный контроль этих препаратов митохондрий К = I.
Для получения не фосфорилирующих митохондрий из печени крыс использовали два способа: I) замораживание и оттаивание, 2) выдерживание при 4с в течение 2-7 дней. Результаты экспериментов не зависели от способа разобщения.
Определение белка в суспензии митохондрий проводили микро-биуретовым методом [109] .
Концентрацию электронтранспортных цепей регистрировали спектрофотометрически.
Влияние скачкообразного изменения рН на фосфорилирование в нативных митохондриях
При добавлении к анаэробной суспензии нативных митохондрий (Д К =4-7) с исходньпл рН 7,4 (анаэробиоз достигался самими митохондриями при выдерживании их в плотной суспезии), содержащего кислород буферного сахарохного раствора сЛаОН, рН 12 ( конечное рН среды митохондрий составляло 9,6) за I сек. до фиксации митохондрий синтезируется около 0,6 нмолей Ш на мг митохондриального белка. Количество, синтезируемого АТФ не зависит от того добавляли ли первоначально субстраты фосфори-лирования в суспензию митохондрий или в буферный раствор. В аналогичных условиях, но при использовании буферного раствора с рН 7,4 синтез АТФ составлял 0,15 нмолей АТФ/мг белка. Таб.1.
Из проведенных экспериментальных данных видно, что в суспензии митохондрий, подвергшихся скачкообразному повышению рН наблюдается увеличение синтеза АТЗ на 0,45 нмолей/мг белка. В пересчете на одну электронтранспортную цепь дополнительный к обычному синтезу в нативных митохондриях синтез АЇФ, при скачкообразном повышении рН соответствует 2-3 молекулам АТФ. Уменьшение конечного рН от 9,6 до 8т5 не влияет на количество дополнительно синтезируемого АТФ.
Индуцируемое быстрым изменением рН фосфорилирование в разобщенных митохондриях
В работе использовали разобщенные митохондрии, которые получали путем инкубации при температуре 0-2С в течение 4-7 дней, либо путем повторного замораживания и оттаивания.
Экспериментальные результаты не зависели от способа разобщения [П7] . В работе было показано, что при старении митохондрий увеличивается содержание свободных жирных кислот, которые разобщают окисление и фосфорилирование. Следует, однако, отметить, что действие жирных кислот отличается от эффекта классических разобщителей одной важной особенностью. Такой разобщитель как олеиновая кислота наряду с собственно разобщающим действием, вызывает торможение транслокации адениннук-леотидов, ответственной за перенос АТФ и ДЦФ через митохондри-альную мембрану. Тем самым разобщение в присутствии не слишком высоких концентраций олеата, в отличие от разобщения синтетическими веществами-переносчиками протонного типа (ДНФ), может происходить без активации расщепления АТФ, который становится недоступным для внутримитохондриальной АТФазы.
Нарушение функций митохондрий при перемораживании обусловлено частичным повреждением структурных элементов мембран, вызывающем значительные изменения в мембранной проницаемости и в работе ряда ферментов и систем, связанных с мембраной Гіів] . Предполагается, что процедура замораживания и оттайвания может сопровождаться выходом наружу липолитических ферментов, которые вызывают химическую модификацию липидов и отдельных ферментов. Кроме того, изменению структурной организации мембран и ее проницаемости могут также способствовать пе-рекисное окисление липидов / 119/ и, образующиеся при действии фосфолипаз жирные кислоты. К сожалению, механизм повреждающего действия перемораживания на митохондрии остается невыясненным.
При быстром повышении рН от 7,4 до 9,0 в суспензии разобщенных таким способом митохондрий в присутствии сукцината и субстратов фосфорилирования образуется 0,5 нмолеи АТФ на мг мито-хондриального белка, что в пересчете на одну электронтранспорт-ную цепь составляет 2,5 молекулы АТФ. Легко видеть, что количество , синтезируемого в ятих экспериментах АТФ по величине близко дополнительно синтезируемому АТФ в аналогичных опытах с нативными митохондриями.
Похожие диссертации на Синтез АТФ митохондриями, индуцированный скачкообразным повышением рН
