Содержание к диссертации
Введение
2. Обзор литературы. 6
2.1. Модели экспрессии генов. 6
2.2. Структура и функции инсуляторов . 14
2.3. Модели действия инсуляторов. 20
2.4. Белки с ВТВ доменами . 24
2.5. Структура и свойства белков su(Hw) инсулятора. 32
3. Материалы и методы. 41
3.1. Реактивы. 41
3.2. Ферменты. 41
3.3. Праймеры. 41
3.4. Бактериальные и дрожжевые штаммы и плазмидные ДНК. 42
3.5. Культивирование бактерий и дрожжей. 42
3.6. Получение компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК методом электропорации . 43
3.7. Трансформация компетентных клеток плазмидной ДНК (электропорация). 43
3.8. Выделение плазмидной ДНК. 44
3.9. Электрофорез ДНК в агарозном геле. 45
3.10. Расщепление ДНК эндопуклеазами рестрикции. 45
3.11. Лигировапие ДНК. 45
3.12. Тупление выступающих концов ДНК. 45
3.13. Получение мутаций в гене mod(mdg4). 46
3.14. Получение делеции BTcmmod(mdg4). 47
3.15. Получение векторов для двугибридной системы. 47
3.16. Трансформация дрожжевых клеток. 48
3.17. Анализ взаимодействий в двугибридной системе. 48
3.18. Синтез и выделение белков. 49
3.19. Электрофорез белков в денатурирующем 8% ПААГ. 50
3.20. Электрофорез белков в нативном 7% ПААГ. 50
3.21. Перенос и детекция белков на мембране, 51
3.22. Генетические скрещивания. 51
3.23. Детекция белков на политенных хромосомах дрозофилы. 52
3.24. Детекция белков в клетках имагинальных дисков дрозофилы. 52
4. Результаты. 54
4.1. Наличие точечных замен в "заряженном кармане" не влияет на способность белка взаимодействовать с Su(Hw) и димеризоваться. 54
4.2. Белок Mod(mdg4) содержит второй домен, отвечающий за димеризацию . 57
4.3. Функциональная активность мутантных форм белка в работе инсулятора Su(Hw). 60
4.4. Локализация белков на политенных хромосомах и в ядерных тельцах диплоидных клеток. 70
5. Обсуждение результатов. 71
6. Выводы. 75
7. Список использованной литературы.
- Структура и функции инсуляторов
- Белки с ВТВ доменами
- Получение компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК методом электропорации
- Белок Mod(mdg4) содержит второй домен, отвечающий за димеризацию
Структура и функции инсуляторов
В 1991г. были открыты первые два инсулятора дрозофилы, scs и scs\ которые окружают ген теплового шока hsp70 дрозофилы [101]. Почти одновременно в регуляторной области ретротранспозона дрозофилы МДГ4 был обнаружен su(Hw) инсулятор [66]. В дальнейшем у курицы был описан еще один инсулятор, который ограничивает глобиновые гены [25]. Этот инсулятор работает и в дрозофиле. Существуют данные, что scs инсулятор дрозофилы может функционировать в клетках мыши и ооцитах морского ежа [47]. Таким образом, инсуляторы из разных организмов должны иметь общие механизмы действия.
В выяснении механизма действия иисуляторов большую роль сыграло определение белков, ответственных за функцию иисуляторов. Впервые белки, которые блокируют взаимодействие между энхансером и промотором, были охарактеризованы для инсулятора su(Hw). Этот инсулятор содержит 12 сайтов связывания для одного белка, кодируемого геном su(Hw) [126]. Инактивация данного гена приводит к потере инсуляции. Сила инсулятора напрямую зависит от количества сайтов связывания белка Su(Hw). Делеция даже нескольких сайтов связывания резко снижает эффективность действия инсулятора. Белок Su(Hw) имеет на концах домены, обогащенные кислыми аминокислотными остатками, и ДНК-связывающий домен, состоящий из 12 цинковых пальцев [105]. С помощью делеционного анализа было выявлено, что за инсуляцию отвечает домен, расположенный между цинковыми пальцами и С-концевым кислотным доменом [105]. В то же время, кислые домены не имели большого значения для инсуляции.
Недавно были получены мутации в регуляторном гене mod(mdg4) [59]. Один из белков, который кодируется геном mod(mdg4), взаимодействует с доменом белка Su(Hw), отвечающим за инсуляцию [57]. В общей сложности с гена mod(mdg4) транскрибируется около 20 различных мРНК, образующихся в результате альтернативного сплайсинга на З -конце [42]. В двух лабораториях [41] и [189] , было показано, что на N-конце всех белков, кодируемых геном mod(mdg4), находится BTB/POZ-домен, который был найден у целого семейства белков, являющихся регуляторами транскрипции [109, 142, 205]. Таким образом, все белки, кодируемые геном mod(mdg4), имеют одинаковый ВТВ-домен на N-конце и разные С-концы. Предполагается, что именно С-концы определяют специфичность взаимодействия различных Mod(mdg4)- белков с другими белками.
В нашей лаборатории была описана мутация mod(mdg4)u , которая приводит к потере инсуляторных свойств белка Su(Hw). Эта мутация вызвана инсерцией мобильного элемента stalker, что приводит к делеции С-концевой области только у одного белкового продукта гена mod(mdg4) [59]. Таким образом, мутация mod(mdg4)u нарушает взаимодействие между белками Su(Hw) и Mod(mdg4), при этом все остальные белковые продукты гена mod(mdg4) сохраняются. Нужно отметить, что полная инактивация гена mod(mdg4) имеет летальное проявление на стадии личинки, в то же время мутация mod(mdg4)ul не оказывает видимого влияния на жизнеспособность, что позволяет легко изучать роль белка Mod(mdg4) в процессе инсуляции. В литературе появляется все больше информации о роли белковых продуктов гена mod(mdg4) в совершенно различных процессах - апоптозе, формировании мышечных волокон, правильной экспрессии гомеозисных генов, супрессии эффекта гетерохроматина [63, 77]. Таким образом, ген mod(mdg4) кодирует регуляторные белки, которые являются общими факторами транскрипции.
Интересно, что в присутствии мутации mod(mdg4)" su(Hw) инсулятор может ингибировать активность некоторых промоторов [59]. Ранее [66], было детально исследовано взаимодействие su(Hvv) инсулятора с регуляторными элементами rem yellow (у). Транскрипция данного гена регулируется набором тканеспецифичных энхансеров, уровень экспрессии можно наблюдать визуально, по степени пигментации кутикулы имаго. В у -мутации мобильный элемент МДГ4 встроился в регуляторную область гена yellow. В результате энхансеры, ответственные за экспрессию гена в теле и крыльях, оказываются отделенными от промотора su(Hw) иисулятором. В то же время ген yellow нормально экспрессируется в других зонах кутикулы, так как соответствующие энхансеры находятся либо непосредственно в зоне промотора, либо в интропе гена, как, например, энхансер, ответственный за экспрессию гена yellow в щетинках. Комбинирование мутации mod(mdg4)u! с аллелем у2 приводит к усилению мутантного фенотипа и инактивации гена yellow в щетинках, что можно объяснить прямым иигибированием промотора тет yellow [59]. При этом ингибирование транскрипции тепа, yellow зависит от наличия С-концевого домена белка Su(Hw). Можно предположить, что Mod(mdg4), связываясь с белком Su(Hw), маскирует его С-концевой домен, который в присутствии мутации mod(mdg4)" может непосредственно ингибировать транскрипцию с промотора yellow.
Другим свойством инсулятора su(Hw) является его способность определять границу между активным и неактивным хроматином [71]. По современным представлениям неактивный хроматин отличается от активного степенью упаковки ДНК в нуклеосомах, что характеризуется потерей чувствительности к обработке нуклеазами и снижением уровня ацетилировапия коровых гистонов. Предполагается, что компактная структура хроматина распространяется кооперативно, а для разделения активного и неактивного хроматина должны существовать специальные элементы. Такие элементы были найдены у дрожжей S.cerevisiae на границе между репрессированными локусами HMR и HML и активным окружающим хроматином [39]. Было показано, что один из регуляторных элементов состоял из кластера сайтов связывания для белка Rapl [13]. Предполагается, что этот белок может активно конкурировать с нуклеосомами за связывание с ДНК и, тем самым, препятствовать распространению компактного хроматина. Кроме того, существуют данные, что многие, хотя и не все, инсуляторы, способны защищать ограниченный ими ген от репрессирующего действия окружающего хроматина [25, 178]. Как упоминалось выше, такими свойствами, в частности, обладает инсулятор su(Hw). Транскрипция гена white, ограниченного двумя копиями инсулятора su(Hw), наблюдается даже при инсерции конструкции в прецентромериый гетерохроматин [71].
Наиболее вероятно, что для блокирования эффекта гетерохроматина необходимо нарушить кооперативное взаимодействие между нуклеосомами. Большое число сайтов для белка Su(Hw) может дать такой эффект. Этот механизм объясняет также роль инсулятора su(hw) в активации экспрессии мобильного элемента МДГ4. Белок Su(Hw) не является непосредственным активатором транскрипции, но большая масса этого белка разрушает организованную структуру нуклеосом в районе "слабого " промотора МДГ4, что приводит к его активации. Нужно отметить, что большая часть копий МДГ4 находится в области прецентромерного гетерохроматина, что делает роль белка Su(Hw) в активации транскрипции промотора МДГ4 особенно актуальной.
Белки с ВТВ доменами
Человеческий геном кодирует 205 белков с ВТВ доменом, которые примерно равномерно распределены среди этих трех классов: 47 белков из них содержат "цинковые пальцы", 53-Kelch повторы и 57 - ионные каналы. Оставшиеся белки содержат помимо ВТВ доменов различные домены и не попадают в отдельную группу. Недавно идентифицированное подсемейство ВТВ белков включает в себя Rho-ГТФазу. Это подсемейство мало охарактеризовано, но Rho-ГТФазы включены во многие клеточные процессы, такие как перестройка цитоскелета, клеточный цикл, морфогенез и апоптоз [152], Существуют также доказательства связи Rho-опосредованной передачи сигналов и образования опухолей и метастаз. Например, DBC2 (deleted in breast cancer) - недавно идентифицированные RhoBTB белок, полностью отсутствующий у 3.5% больных раком молочной железы [85].
Подкласс ВТВ белков, содержащих цинковые пальцы, в основном содержит транскрипционные факторы. Некоторые из них были подробно изучены, т.к. вовлечены в развитие рака у человека. Два наиболее изученных белка - PLZF и Вс16 являются транскрипционными репрессорами, вовлеченными в АР- лейкемию (acute promyelocytic) и DLC-лимфому (diffuse large cell), соответственно. Кристаллическая структура аминокислотных остатков 6-126 белка PLZF послужила основой для идентификации структурных свойств белков с BTD доменами [2]. Она представляет собой гомодимер с плотно прилегающими пептидными цепями. Поверхность взаимодействия гидрофобная и занимает примерно по одной четверти от каждого мономера. Это позволяет сделать вывод, что PLZF связан в димер. Структурное выравнивание белков, содержащих ВТВ домен, выявило область из 90 аминокислотных остатков, общих для всех типов доменов. Идентичность аминокислотных остатков при сравнении попарно каждого из классов менее 20%, и гомология находится иа пределе обнаружения при использовании выравнивания только по аминокислотной последовательности. Хотя все эти белки содержат общее ядро, они собираются в различные четвертичные структуры. Так, ВТВ домены PLZF и Вс16 формируют гомодимер, в котором основное взаимодействие приходится на N-концевые остатки, в то же время домен белка ТІ ионных каналов формирует гомотетрамер [112], a Skpl/ElonginC -образует гетеротетрамер [166] [175], используя совершенно различные поверхности молекулы для олигомеризации.
Биологические свойства белков с ВТВ доменами в основном являются результатом белок-белкового взаимодействия между ВТВ доменами. Основополагающей функцией ВТВ доменов, как было обнаружено у белков подкласса цинковые пальцы и Kelch повторы, является осуществление гомодимеризации, т.к. эта роль критически важна для функционирования этих белков. Например, у PLZF ВТВ домен нужен для димеризации [2, 122], репрессии транскрипции [181], формирования высокомолекулярных ДНК-белковых комплексов [6] и локализации белка в ядерные "пятнышки" [38]. Мутации, которые нарушают поверхность взаимодействия и димеризацию ВТВ доменов PLZF или полное удаление домена, приводят к тому, что белок становится полностью нефункциональным [102].
Димеры ВТВ доменов потенциально могут формировать комплексы из нескольких димеров, такие как наблюдаются при полимеризации SAM доменов транскрипционного супрессора TEL [104] и полихомеотик [103], Основным структурным доказательством этого является очень плотный контакт между гомодимерами ВТВ доменов у PLZF, который включает в себя PI-РЗ слои "снизу " домена. Это взаимодействие наблюдалось в двух различных кристаллических решетках, что подтверждает биологическую значимость этих димер-димериых взаимодействий. Если гомодимеры ВТВ доменов собираются в повторяющуюся цепь, то лолноразмерный белок PLZF может собираться в большой комплекс, с множественными цинковыми пальцами. У многих транскрипционных факторов, содержащих ВТВ домен, он отделен от С-концевого ДНК-связывающего домена несколькими сотнями аминокислотных остатков, которые по предсказанию почти не имеют фиксированной структуры. Это приводит к модели, в которой олигомерная цепь ВТВ домепов связывается в нескольких местах с ДНК. Было продемонстрировано, что способность PLZF формировать высокомолекулярный ДНК-белковый комплекс зависит он наличия ВТВ домена. Более того, ВТВ домен необходим для рекрутирования PLZF[38], Bcl-6 [33] и ZID [7] в ядерные "пятнышки", что предполагает, что эти белки являются частью больших образований.
В случае GAF фактора (GAF) у дрозофилы, множественное связывание с последовательностью природной оператора также зависит от формирования высокомолекулярного белкового комплекса, образованного N-концевым ВТВ доменом [48], [99]. GAF фактор - коиститутативно экспрессируемый транскрипционный фактор, кодируемый жизненно необходимым геном Triihorax-like (Ttl) [50]. Он связывается с GA богатой последовательностью ДНК единственным цинковым пальцем [147]. Однако, в отличие от многих белков с ВТВ доменом, GAF фактор активирует транскрипцию [78]. При помощи электронной микроскопии было непосредственно показано, что GAF фактор связывается с множественными участками ДНК в виде большого олигомерного комплекса. ДНК в этом комплексе изогнута и может быть накручена на поверхность олигомера, образованного GAF [99].
Получение компетентных клеток для трансформации плазмидной ДНК методом электропорации
Для получения точечных аминокислотных замен в ВТВ домене, плазмидпая ДНК (вектор pGEX2T, содержащий кДНК mod(mdg4)-67.2 был любезно предоставлен D.Dorsett) с геном mod(mdg4) была обработана эндонуклеазами рестрикции ЕсоК I и Dra II (Рис. 5), полученный фрагмент был лигирован в вектор pUC19, обработанный теми же эндонуклеазами рестрикции. Полученная конструкция использовалась в качестве матрицы для проведения двух ПЦР, в каждой из которых амплифицировали по половине ВТВ домена. Первую ПЦР проводили в 50 мкл раствора, содержащего 50 мМ трис-НС1, рН 9,0, 50 мМ NaCl, 10 мМ MgCb, 0,2 мМ dNTP, 5 нг ДНК-матрицы, 10 пмоль одного из праймеров, содержащих замену (H46D или R47Q), 10 пмоль праймера Ml3 reverse sequencing primer, 2 единицы Taq ДНК-полимеразы. 30 циклов ПЦР проводили в следующем режиме: 95С - 15 секунд (денатурация), 65С - 15 секунд (отжиг праймера) и 72С - 15 секунд (полимеризация). Далее делали достройку в режиме 72С - 10 минут. Вторую ПЦР проводили также, но со следующими праймерами: М13 forward sequencing primer, а второй праймер был либо полностью комплиментарен гену (в случае одинарной аминокислотной замены), либо содержащий вторую аминокислотную замену (D33N). Первый ПЦР продукт был обработан эндонуклеазой рестрикции ЕсоК I, второй - Dra II, и оба ПЦР продукта были одновременно лигированы в вектор pUC19, обработанный теми же эндонуклеазами. Затем этот вектор гидролизовался эндонуклеазами рестрикции ЕсоК I и Dra II и полученный фрагмент, содержащий замену, был лигирован назад в вектор pGEX2T mod, обработанный этими же эндонуклеазами. Полученные вектора были названы pGEX2Tmod33, pGEX2Tmod33/25, pGEX2Tmod33/46, pGEX2Tmod33/47, pGEX2Tmod46, PGEX2Tmod47 (в дальнейшем по тексту, если не важна замена - pGEX2Tmod .
Для делеции глутамин богатого района белка Mod(mdg4), вектор pGEX2Tmod, была обработана эндонуклеазой рестрикции В1р\ выступающие концы были достроены ДНК полимеразой фага Т4, и вектор был лигирован сам на себя, в результате была получена плазмида, названная pGEX2TmodAQ (Рис. 5).
Для получения векторов, необходимых для изучения взаимодействия между различными мутантными формами белка Mod(mdg4) и белком Su(Hw), плазмиды pGEX2Tmod и pGEX2TmodAQ были обработаны эндонуклеазами рестрикции EcoR. I и ВатН I, при этом получились фрагменты, содержащие полноразмерную кДНК гена mod(mdg4) либо с. аминокислотными заменами, либо с делецией глутамин богатого района. Эти фрагменты были лигированы в вектора pGAD424 и pGBT9 , которые были обработаны теми же эндонуклеазами рестрикции. Полученные вектора были названы pGAD(pGBT9)mod . Ген su(Hvv) был ПЦР амплифицирован, а в качестве матрицы использовали вектор pGEM3Zf, содержащий кДНК su(Hw). ПЦР проводили в 50 мкл раствора, содержащего 10 мМ трис-HCl, рН 8.85, 25 мМ KCI, 50 мМ (NH4)2S04, 2 мМ MgS04, 5 нг ДНК-матрицы, 50 пмоль праймера, 50 пмоль, 0,2 мМ dNTP и 0,5 единицы Pfu Turbo ДНК-полимеразы. 25 циклов ПЦР проводили в следующем режиме: 95С-30 секунд (денатурация), 58С -30 секунд (отжиг праймеров) и 72С - 6 минут (полимеризация). Далее делали достройку в режиме 72С - 10 минут. Далее полученный ПЦР продукт был обработан эндонуклеазами рестрикции Sal I и Sma I и лигирован в вектора pGAD424 и pGBT9, обработанные теми же эндонуклеазами рестрикции.
Для трансформации дрожжевых клеток, сначала выращивали ночную культуру в среде YPD до стационарной фазы роста. Далее ее разводили в 10 раз по объему в той же среде и выращивали еще 3-4 часа (до плотности). Клетки осаждали центрифугированием, рссуспендировали в равном объеме дистиллированной воды, расфасовывали на равное количество по числу трансформаций, снова осаждали и удаляли надосадочную жидкость. К полученному клеточному осадку последовательно добавляли (из расчета на 1 трансформацию): 240 мкл 50 % PEG-3350, 40мкл Ш LiAc, 50 мкг денатурированной ДНК из спермы лосося, и по 1-5мкг каждой из плазмид(рОАВ и pGBT). Осадок ресуспендировали в этом растворе 30 при +30, затем 15 при +42, охлаждали во льду 5 . Далее клетки осаждали при ускорении не более 3000g, ресуспендировали осадок в дистиллированной воде и высевали на минимальную среду с добавлением смеси аминокислот для селекции трансформантов.
Для анализа взаимодействий белков в двугибридной системе плазмиды с интересующими генами трансформировали в клетки дрожжей (см. предыдущий пункт), и через 2-3 дня после трансформации выросшие клоны (не менее 5 разных) пересевались на минимальную среду с добавлением смеси аминокислот без триптофана, лейцина, гистидина и аденина. Через 5-7 дней эффективность роста колоний сравнивалась с ростом колоний "положительного контроля", в качестве которого использовали взаимодействие Mod(mdg4) с одним из доменов Su(Hw).
Для экспрессии гена mod(mdg4) и его мутантных форм использовали конструкцию на основе вектора рЕТ23а в случае добавления 6His к белку или на основе pGEX2T в случае добавления GST и штамм E.coli BL21(DE3) puBS520. Для вьщелепия белков использовали культуру E.coli, выращенную до ОД5бо=0,5 при 37 С на среде LB с добавлением ампициллина и канамицина, после чего добавляли 1 мМ IPTG и выращивали культуру еще 4 часа при 30С, 100 мл культуры собирали центрифугированием при 4,5-Ю3 g, и осадок ресуспендировали в 5 мл 0,9 % NaCl. Снова центрифугировали, и осадок ресуспендировали в 5мл раствора, содержащего 50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 200 мМ КО, 1% Triton Х-100, 10% глицерин, 1 мг лизоцим, 1 мМ PMSF, Выдерживали во льду 30 минут и проводили разрушение клеток ультразвуком на приборе Sonifier 250 фирмы "Branson" в режиме 2 минуты при 50% мощности импульсов. Далее лизат переносили в пробирки для центрифугирования типа Eppendorf и центрифугировали при 11-Ю3 g 10 минут при +4С. Осветленный лизат переносили в 15 мл пробирки и добавляли 300 мкл 50% суспензии смолы Talon (для б His) или 4В Sepharose (для GST) , уравновешенной буфером (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 200 мМ КС1, 10% глицерин), меркаптоэтанол до концентрации 10 мМ и имидазол до концентрации 10 мМ. Пробирку горизонтально помещали на качалку (70 об/мин) на 1 час. Затем лизат со смолой помещали в колонку со стеклянным фильтром и промывали 3 раза 7 мл буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 200 мМ КС1, 10% глицерин, 10 мМ имидазол (только для 6His), 5 мМ меркаптоэтанол). Элюцию белка с 6His со смолы проводили 3 раза по 0.5 мл буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 200 мМ КС1, 10% глицерин, 100 мМ имидазол, 5 мМ меркаптоэтанол), а белка с GST - тем же буфером без имидазола, но с добавлением глутатиона до 20 мМ. Далее проводили диализ белка против буфера (50 мМ трис-HCl, рН 7,5, 50 мМ КС1, 0,1 мМ ЭДТА), отношение объема белок: буфер 1:2000, 12 часов при +4 С
Белок Mod(mdg4) содержит второй домен, отвечающий за димеризацию
Схема мутаций в Achaete-Scute комплексе, ас, sc, I sc, ase - гены в составе Achaete-Scute, определяющие точное положение щетинок. scmsl, scms2 мутации, вызванные дупликацией yellow. ІА-2 insulator - эндогенный инсулятор, обнаруженный в конце гена yellow.
В мутациях sc и sc этот инсулятор дуплицирован между геном sc и его энхансерами. В отличие от аллеля scDI мутация mod(mdg4)ul почти полностью подавляет мутантный фенотип scms аллелей. Для дальнейшего исследования функциональной значимости мутаций в белке Mod(mdg4)-67.2 мы использовали мутацию ln(l)scv (рис. 7), вызванную инверсией, одна из точек разрыва которой, расположена очень близко к 3 концу кодирующей части гена ас [76]. Несмотря на близость центромерного гетерохроматина, мутация In(l)scv вызывает только слабый мутантный фенотип. Однако на фоне mod(mdg4)u эта инверсия усиливает ас- и jc-фенотип, что показывает вовлеченность белка Mod(mdg4)-67.2 в блокирование репрессионного действия хроматина. Таким образом, ACS комплекс позволяет нам протестировать мутации в белке Mod(mdg4)-67.2 на функции эндогенного инсулятора.
Третей генетической системой, в которой мы исследовали мутантные форм белка Mod(mdg4)-67.2, было два аллеля - ct6 и cf, которые вызваны инсерцией мобильного элемента МДГ4 в локус cut. В случае аллеля ct МДГ4 встроился близко к энхансеру, который расположен на расстоянии примерно 85 т.п.и. до промотора гена cut [43], [96], и полностью блокирует взаимодействие между промотором и этим энхансером, что приводит к cut фенотипу. Мутации mod(mdg4)u! и mod(mdg4)T6 почти полностью подавляют ct6 фенотип, что указывает на необходимость белка Mod(mdg4)-67.2 для блокирования энхаисеров, тканеспецифичных для крыльев. В случае аллеля сг МДГ4 только частично блокирует энхансер гена cut, приводя к промежуточному cut фенотипу, возможно из-за того, что там находится меньше сайтов связывания для белка Su(Hw), чем у большинства мобильных элементов МДГ4 [92]. Фенотип с/ наиболее чувствителен к степени активности белков Su(Hw) и Mod(mdg4)-67.2 по сравнению с остальными инсерциями мобильного элемента МДГ4 и больше всего подавляется гетерозиготными мутациями su(Hw) или mod(mdg4f [57].Таким образом, сг представляет собой модель, очень сильно реагирующую на изменение функциональных свойств мутантних форм белка Mod(mdg4)-67.2 в блокировании тканеспецифичных энхаисеров крыльев.
Для выяснения роли мутантных белков были получены трансгенные мухи, экспрсссирующие белки под промотором hsplO (для белков Mod(mdg4)-67.2; Mod(mdg4) Q, Mod(mdg4) iQ, ModH46D, ModH46D/D33N и ModS25A/D33N) или под повсеместно экспрессируемым промотором su(Hw) (для белков Mod(mdg4)-67.2; ModR47Q, ModD33N, ModD33N/R47Q и Mod(mdg4)Ga). Исследование функции этих белков производили на фоне мутации mod(mdg4)ul. Для исключения эффекта положения, по крайней мере, 8 независимых линий были протестированы. В 14 трансгенных линиях, экспрессирующих белок дикого типа под контролем промотора hsp70 или Su(Hw), полностью восстанавливается фенотип, вызванный mod(mdg4)ul(puc. 8-10).
Далее мы исследовали действие мутаций в "заряженном кармане". ModR47Q действует аналогично белку дикого типа, более того эта мутация индуцирует более сильное блокирование энхансеров крыльев в случае сг, чем действие белка "дикого типа" на эту же мутацию. Таким образом, изменение положительного заряда аминокислотного остатка на нейтральный не приводит к ухудшению свойств белка в работе инсулятора.
И напротив - нейтрализация отрицательно заряженного аминокислотного остатка аспартата в положении 33 заменой на нейтральный аспарагин приводит почти к полной инактивации инсуляциониых и антирепрессорных свойств белка (рис. 8-10).
ModD33N лишь слегка восстанавливает эпхансер блокирующую активность su(Hw)-инсулятора в с/ аллеле (рис. 10), но не изменяет фенотип мутаций scms, sc , !n(l)sc (рис.8) и cf (рис. 9). Двойная мутация ModS25A/D33N, содержащая дополнительную аминокислотную замену на поверхности ВТВ домена, приводит к полной инактивации белка в инсуляции и стимуляции транскрипции.
Так как оба белка ModD33N и ModS25A/D33N неспособны гомодимершоваться и частично теряют способность взаимодействовать с немутантной формой белка Mod(mdg4)-67.2, был сделан вывод, что целостность ВТВ домена нужна для всех активностей (инсуляционной и стимуляции транскрипции) белка Mod(mdg4)-67.2.
В двойной мутации ModD33N/R47Q оба - отрицательный и положительный - заряды аминокислотных остатков заменены нейтральными. Это приводит к умеренному уровню инсуляционной активности и способности стимулировать транскрипцию (рис. 8-Ю). Например, ModD33N/R47Q восстанавливает энхансер блокирующую активность зи(Н\у)-инсулятора на аллеле ct6, но не изменяет фенотип с/ , scDI и scms аллелей. ModD33N/R47Q подавляет мозаичную пигментацию брюшка, но лишь частично подавляет ингибирование экспрессии yellow в щетинках. Так же ModD33N/R47Q только слегка подавляет репрессию, вызванную гетерохроматином в аллеле In(I)sc .
