Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo Мальцева Валентина Николаевна

Содержание к диссертации

Введение

Глава 1. Обзор литературы 11

1.1. Иммунная система и опухоль 11

1.1.1. Общая характеристика опухолевых клеток, их особенности 11

1.1.2. Классификация опухолей 18

1.1.3. Компетентность иммунной системы в отношении опухолей 20

1.1.4. Способы избегания клетками опухоли надзора иммунной системы 25

1.1.5. Влияние опухоли на компоненты иммунной системы 26

1.1.6. Теории взаимодействия опухоли и иммунной системы. Роль стромы опухоли 29

1.2. Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоцити (нейтрофилы) 37

1.2:1. Общая характеристика 37

1.2.2. Мембранные рецепторы нейтрофилов 40

1.2.3. Респираторный взрыв и его регуляция 42

1.2.3.1. Структура NADPH оксидазы 43

1.2.3.2. Активация NADPHоксидазы, сигнализация 47

1.3. Двойственное поведение активных форм кислорода (АФК) 50

1.3.1. Характеристика А ФК 50

1.3.2. Системы генерации и инактивации активных форм кислорода 51 /. 3.3. А ФК - польза или вред? 53

1.3.4. Участие АФК в процессах канцерогенеза 54

7.3.4. Влияние активных форм кислорода на сигнальные системы 55

1.4. Неоднозначность роли нейтрофила в канцерогенезе 5 8

1.4.1. Антиопухолевая активность 58

1.4.2. Проопухолевая активность 59

Глава 2. Материалы и методы исследования 64

2.1. Материалы 64

2.2. Биологический объект 64

2.2.1. Изоляция перитонеалъных нейтрофилов мыши 64

2.2.2. Подготовка проб крови 65

2.3. Модель экспериментальной опухоли 65

2.3.1. Линии клеток 65

2.3.2. Формирование солидной формы опухоли 65

2.4. Регистрация хемилюминесценции 66

2.4.1. Хемилюминометр, программы и режим измерения 66

2.4.2. Измерение хемилюминесценции цельной крови 66

2.4.3. Измерение хемилюминесценции изолированных клеток 66

2.5. Микроскопия клеток 67

2.6. Гистологический анализ тканей 68

2.7. Анализ спектра белков методом электрофореза 68

2.8. Обработка результатов 69

Глава 3. Результаты 70

3.1. Модель экспериментальной опухоли на мышах 70

3.2. Оценка статуса лейкоцитов периферической крови 72

3.2.1. Популяционный состав клеток крови 72

3.2.2. Продукция А ФК клетками крови 13

3.3. Анализ клеток, изолированных из очага острого воспаления 74

3.4. Морфологические изменения нейтрофилов 75

3.5. Функциональные изменения нейтрофилов 11

3.5.1. Оценка адгезивных свойств 11

3.5.2. Продукция А ФК периферическими нейтрофилами мыши 78

3.5.2.1. Спонтанная продукция АФК 78

3.5.2.2. Активированная ФМЛФ продукция А ФК 79

3.5.2.3. Оценка вклада отдельных активных форм кислорода в спонтанную и активированную продукцию АФК 81

3.6. Ингибиторный анализ регуляции респираторного взрыва нейтрофилов 84

3.6.1. Оценка вклада рецепторов ФМЛФ с разным сродством в инициацию респираторного взрыва 84

3.6.2. Ингибирование киназ 86

3.6.2.1.Действие тирфостина 51, ингибитора тирозиновых протеинкиназ

3.6.2.2. Влияние GF109203Х, ингибитора протеинкиназы С 88

3.6.2.3. Действие SB 203508, ингибитора р38 МАРК 89

3.6.2.4. Действие вортманнина и LY294002, ингибиторов фосфатидилинозит-3-киназы 90

3.6.2.5. Влияние ортованадата натрия, ингибитора тирозиновых протеинфосфатаз 92

3.7. Оценка количества и спектра белков периферических нейтрофилов 94

3.7.1. Роль синтеза белка в способности нейтрофилов продуцировать АФК 94

3.7.2. Количество и спектр белков в цитоплазматической и ядерной фракциях 95

3.8. Сравнение функциональной активности нейтрофилов на моделях солидных опухолей 96

Глава 4. Обсуждение результатов 102

Выводы 113

Список литературы

• Компетентность иммунной системы в отношении опухолей
• Изоляция перитонеалъных нейтрофилов мыши
• Популяционный состав клеток крови
• Оценка вклада рецепторов ФМЛФ с разным сродством в инициацию респираторного взрыва

Введение к работе

Актуальность проблемы. Выяснение взаимоотношений между иммунной системой и развивающейся в организме опухолью является актуальной и волнующей проблемой современной биологии клетки и онкоиммунологии. Иммунная система играет важную роль в задержке роста и регрессии опухолей [O'Beirne, Harrison, 2004; Mocellin, 2005]. Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) вовлечены в развитие противоопухолевого иммунного ответа [Di Carlo et al, 2001; Jablonska et al., 2005]. Они считаются важными при определенных видах противоопухолевой терапии [Chasseing et al., 1993; Castano et al., 2006]. Нейтрофилы подавляют рост экспериментальных опухолей in vivo [Fujii et al.,1987; Wang et al., 1989]. Прямое цитостатическое и цитотоксическое действие нейтрофилов на опухолевые клетки подтверждено in vitro [Pericle et al., 1996; Igney et al., 2004]. Нейтрофилы первыми мигрируют к опухоли на ранних стадиях ее формирования [Stoppacciaro et al., 1993; Nakao et al., 2005] и являются активными компонентами стромы [Mueller, Fusenig, 2004]. Однако роль нейтрофилов, как и других клеток врожденного иммунитета, в возникновении и развитии опухолей неоднозначна [de Visser et al., 2006]. Показано, что на поздних стадиях инфильтрация опухоли нейтрофилами способствует прогрессу опухоли, усиливая ангиогенез и метастазирование с помощью селектинов [Borsig et al., 2002], цитокинов и ферментов [Nielsen et al., 1996; Wu et al, 2001; Sun, Yang, 2004].

Рост большинства злокачественных новообразований сопровождается изменениями основных звеньев иммунного ответа [Chen et al, 2003; Motta et al, 2003; Chang et al, 2004]. Имеются сведения о модуляции функций нейтрофилов при развитии опухоли: уменьшение хемотаксической активности, стимулированной формилированным пептидом [Ueta et al, 1994], возрастание либо понижение уровня продукции АФК [Чердынцева и др, 1992; Asian et al, 1998; Szuster-Ciesielska et al, 2004]. Однако сведения о влиянии опухоли на функциональную активность нейтрофилов противоречивы. Изменения зависят

6 от типа, локализации и стадии онкологического заболевания [Kasimir-Bauer et al., 1994; Мальцева и др., 2005].

Цитотоксическая активность нейтрофилов опосредована

протеолитическими ферментами гранул и активными формами кислорода (АФК). АФК продуцируются в респираторном взрыве, который инициируется активацией NADPH оксидазы [Babior, 2002; Segal, 2005]. Хемотаксический пептид N-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ) активирует респираторный взрыв, связываясь со специфическим рецептором [Thelen, 1993]. Показано, что в трансдукции сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу участвуют гетеротримерный Gj-белок, малые ГТФазы, протеинкиназа С (ПКС), каскад митоген-активируемых протеинкиназ (МАРК), фосфатидилинозит 3-киназа (ФИ-З-К) [Thelen, 1993; Hallett, Lloyds, 1997; Kyriakis, Avruch, 2001].

На данный момент остается малоизученным влияние опухоли и ее продуктов на активность и регуляцию NADPH оксидазы, ответственной за продукцию АФК. Этот вопрос является важным из-за двойственной роли АФК в организме. Они обеспечивают защиту от патогенов и трансформированных клеток, но и участвуют в мутагенезе, повреждая белки и нуклеиновые кислоты, и содействуют пролиферации опухолевых клеток [Zhang et al., 1998; Sapone et al., 2003; De Larco et al., 2004]. Для нормального функционирования организма важно поддержание оптимального уровня генерации АФК нейтрофилами, что обеспечивается координированным взаимодействием компонентов внутриклеточных сигнальных систем. Исследования внутриклеточной сигнализации широко проводятся на линиях культур клеток и на опухолевых клетках [Alessi et al., 1995; Droge et al., 2001; Dong-Yun et al., 2003; Patz et al., 2007]. Внутриклеточная сигнализация в периферических по отношению к опухоли клетках с высоким цитотоксическим потенциалом - участниках врожденного иммунитета, в том числе в нейтрофилах, при росте опухоли в организме остается не исследованной. Возможно, именно на уровне передачи сигнала происходит модификация функционального поведения нейтрофилов таким образом, что они начинают способствовать росту опухоли. В целом

участие нейтрофилов в процессах канцерогенеза на сегодняшний день мало изучено. Полученные в ходе данного исследования результаты помогут прояснить механизмы модификации клеток и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний.

Цели и основные задачи исследования. Цель данной работы состояла в выявлении особенностей в генерации активных форм кислорода и ее регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo.

Были поставлены следующие задачи:

1. разработать экспериментальные модели солидных опухолей из клеток карциномы Льюиса (LLC) на мышах линии C57BL/6; асцитной карциномы Эрлиха (АКЭ) на мышах линии MNRI и культур J 774, WEHI 164, NS0 на мышах линии BALB/c;

2. оценить параметры воспалительной реакции, такие как популяционный состав и количество перитонеальных воспалительных клеток;

3. охарактеризовать морфологические и функциональные свойства периферических нейтрофилов на разных сроках роста опухоли;

4. оценить спонтанную и вызванную продукцию АФК нейтрофилами животных с солидной опухолью на разных стадиях ее роста;

5. изучить роль рецепторов хемотаксического пептида ФМЛФ с высоким и низким сродством в инициации респираторного взрыва нейтрофилов мышей при росте опухоли;

6. исследовать внутриклеточную сигнализацию от рецепторов ФМЛФ на NADPH оксидазу с участием р38 МАРК, ГЖС и ФИ-З-К нейтрофилов мышей в динамике роста опухоли;

7. оценить спектр цитоплазматических и ядерных белков нейтрофилов при развитии опухоли в организме животного.

Научная новизна.

Впервые установлено, что развитие опухоли в организме животного сопровождается последовательным изменением морфологии и функциональной активности периферических нейтрофилов. Получены однозначные новые

данные, свидетельствующие о том, что интенсивность респираторного взрыва периферических нейтрофилов и его регуляция меняется в динамике опухолевого процесса. Впервые показаны участие рецепторов ФМЛФ с разной аффинностью в инициации респираторного взрыва нейтрофилов на разных стадиях роста опухоли и модификация роли тирозиновых протеинкиназ, ПКС, р38 МАРК, ФИ-З-К в его регуляции. Впервые установлены общие закономерности изменения параметров воспалительной реакции при развитии солидных опухолей разной этиологии. Получены новые факты о характерных особенностях изменений продукции АФК и роли киназ в зависимости от типа опухоли и фазы ее развития. Результаты работы свидетельствуют о модификации периферических иммунных клеток во время роста опухоли.

Научно-практическая ценность. Исследование молекулярных механизмов, лежащих в основе модификации функциональной активности клеток иммунной системы, включая нейтрофилы, относится к фундаментальным проблемам биологии клетки и онкоиммунологии. Полученные результаты существенно расширяют представление о взаимоотношениях между клетками иммунной системы и растущей в организме опухолью. Считается, что важнейшей задачей современных исследователей в области онкологии является поиск новой стратегии в лечении онкологических заболеваний, которая будет основана в значительной степени на иммунотерапии, усиливающей противоопухолевый иммунитет и подавляющей процессы, которые способствуют развитию опухоли. Полученные в ходе данного исследования результаты помогают понять механизмы модификации клеток иммунной системы и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний.

Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях и школах: 7-9 Пущинская конференция молодых ученых (Пущино, 2003-2005); XV зимняя международная молодежная научная школа "Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии" (Москва, 2003); FEBS Special

Meeting on Signal Transduction (Бельгия, 2003); отчетная годичная научная конференция ИБК РАН (Пущино, 2003); Physiological Society spring Workshop "Receptors and Cell Signalling in Oxidative Stress" (Венгрия, 2003); Международный междисциплинарный Конгресс «Прогресс в фундаментальных и прикладных науках для здоровья человека» (Украина, 2004); III съезд биофизиков России (Воронеж, 2004); IX-XI Всероссийский научный форум с международным участием «Дни иммунологии в Санкт-Петербурге» (Санкт-Петербург, 2005-2007); 49^th Annual Meeting of Biophysical Society (USA, 2005); 2-ая Международная конференция «Наука - бизнес - образование» (Пущино, 2005); I Съезде физиологов СНГ (Сочи, 2005); Научная школа-конференция «Сигнальные системы клетки: рецепторы, ионные каналы, вторичные мессенджеры - физиологические функции и роль в онтогенезе» (биостанция Кропотово, Московская область, 2005); 2 World Conference of Stress (Венгрия, 2007); The EMBO/FEBS Advanced Lecture Course "Molecular mechanisms in signal transduction and cancer" (Греция, 2007).

Публикации. По материалам диссертации опубликовано 17 печатных работ, из них 3 статьи (1 статья в печати).

Список сокращений:

АГ - антиген;

АКЭ - асцитная карцинома Эрлиха; АО - акридиновый оранжевый; АФК - активные формы кислорода; АФП - а-фетопротеин; ИЛ - интерлейкины; ИНФ - интерфероны;

МАРК - митоген-активируемые протеинкиназы (mitogen-activated protein kinases);

МИФ - макрофаг-ингибирующий фактор; МНС - главный комплекс гистосовместимости; ОАА - опухоль-ассоциированные антигены; 03 - опсонизированный зимозан; ОС - окислительный стресс; ПКС - протеинкиназа С; СОД - супероксиддисмутаза; ФИ-З-К - фосфатидилинозит 3-киназа; ФЛС - фосфолипаза С;

ФМЛФ - N-формил-метионил-лейцил-фенилаланин; ФНО - фактор некроза опухоли; ХЛ - хемилюминесценция;

ERK - киназы регулируемые внеклеточными сигналами (extracelluler signal-regulated kinases);

HLA - антигены лейкоцитов человека (human-leucocyte-associated antigens); JNK - c-Jun киназа;

LLC - карцинома Льюиса (Lewis Lung Carcinoma); NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат восстановленный; NK - натуральные киллерные клетки; t-boc-МЛФ - TV-терт-бутоксикарбонил-Мет- Лей-Фен; TCR - Т-клеточный рецептор; TGF - фактор роста тромбоцитов.

и Глава 1. Обзор литературы /. Иммунная система и опухоль

1.1.1. Общая характеристика опухолевых клеток, их особенности

Опухолевая клетка — потомок нормальной клетки, утратившей контроль над собственной пролиферацией и дифференцировкой. Считается, что злокачественные опухоли возникают из единственной клетки, подвергшейся трансформации и сформировавшей клон злокачественных клеток. Клетки опухоли в процессе трансформации приобретают ряд свойств, отличающих их от нормальных клеток организма: способность к бесконтрольному делению и росту, утрата специфической структуры и функции, изменение антигенного состава, агрессивный рост с разрушением окружающих тканей и способность активно противостоять системе иммунитета [Jiang et al., 2005]. Приобретение клетками вышеуказанных свойств носит название опухолевой конверсии (трансформации). В процессе опухолевой конверсии клетки приобретают характерные признаки и вовлекаются в описываемые далее процессы.

Опухолевым клеткам свойственен тканевый и клеточный атипизм, т.е. утрата клетками первоначальной тканевой специфичности, способности к дифференцировке с нарушением структуры ткани, из которой происходит опухоль.

Автономность клеток опухоли характеризуется отсутствием контроля над пролиферацией и дифференцировкой клеток организмом-опухоленосителем [Коган, 2002]. Клетки продолжают делиться в условиях, когда нормальные клетки не делятся. Это связано с уменьшением потребности в ростовых факторах, которая определяется переходом на аутокринный или паракринный механизм регуляции роста, либо к синтезу дополнительного числа рецепторов к ростовым факторам и специфическим хемокинам [Kulbe, 2004]. Рецептор инсулиноподобного фактора роста сверхэкспрессируется на различных опухолевых клетках: миеломных, клетках опухоли простаты и молочной железы [Bertrand et al., 2006]. Высокий уровень инсулиноподобного фактора роста в крови человека коррелирует с риском развития солидной опухоли. При

связывании инсулиноподобного фактора роста с рецептором опухолевой клетки передается сигнал, приводящий к пролиферации, метастазированию и ангиогенезу в солидной опухоли [Bertrand et al., 2006]. Трансформированные клетки теряют способность к остановке делений и переходу в покоящееся состояние при голодании или дефиците одного из факторов питания. При аутокринной стимуляции роста опухолевая клетка сама продуцирует факторы роста или онкобелки-аналоги факторов роста, а также рецепторы или онкобелки - аналоги рецепторов факторов роста [Obennueller et al., 2004]. Так происходит, например, при мелкоклеточном раке легкого, клетки которого продуцируют ростовой гормон бомбезин и одновременно рецепторы к нему. При этом происходит и паракринная стимуляция, поскольку бомбезин может взаимодействовать с соседними клетками. Яркий пример паракринной стимуляции опухоли - продукция инсулиноподобного фактора роста 2 фибробластами стромы рака легкого. Фактор роста взаимодействует с рецепторами на раковых клетках и стимулирует их пролиферацию. Автономный рост опухоли выражается в утрате контактного торможения и переходу к иммортализации (приобретение бессмертия) опухолевых клеток, что может быть объяснено переходом клеток на аутокринный и паракринный пути регулирования своего роста [Коган, 2002]. Опухолевые клетки вырабатывают вещества, угнетающие противоопухолевый иммунитет (токсины), и вещества, индуцирующие ангиогенез в опухоли. Клетки секретируют простагландины, ростовые факторы, паратгомоноподобный белок, цитокины [Heim et al., 2006], а также ростовые факторы, в норме стимулирующие эмбриональный рост [Szatworski and Wathan 1991; Patamalai et al., 1994; Kage et al., 1999; Luczynsk et al., 2002]. Эти продукты трансформированных клеток активируют рост нормальных клеток. Опухолевые клетки синтезируют фактор, ингибирующий миграцию макрофагов, который является необходимым компонентом опухолевого роста [Ярилин, 1999]. Интактные опухолевые клетки секретируют в окружающую среду низкомолекулярные РНК, которые стимулируют прививаемость и рост

гомологичной опухоли [Graf et al., 2001]. Клетки синтезируют протеазы, в частности, коллагеназу и активатор плазминогена, под действием которого циркулирующий в крови плазминоген превращается в активную протеазу плазмин [Graf et al., 2001].

Прогрессия опухоли отражается в постоянном стадийном прогрессирующем росте опухоли с прохождением ею ряда качественно отличных стадий [Ruegg et al., 2006]. Теория прогрессии опухолей разработана L. Foulds в 1969 г. на основе данных экспериментальной онкологии. Опухоль постоянно изменяется: происходит прогрессия, как правило, в сторону повышения ее злокачественности, которая проявляется как инвазивный рост и развитие метастазов. Стадия инвазивной опухоли характеризуется возникновением инфильтрирующего роста. В опухоли появляются развитая сосудистая сеть и формируется строма, выраженная в различной степени. Границы с прилежащей неопухолевой тканью отсутствуют из-за прорастания в нее опухолевых клеток. Инвазия опухоли протекает в три фазы и обеспечивается определенными генетическими перестройками. Первая фаза инвазии опухоли характеризуется ослаблением контактов между клетками эндотелия и межклеточного матрикса, о чем свидетельствуют уменьшение количества межклеточных контактов, снижение экспрессии некоторых адгезивных молекул из семейства CD44 на поверхности клеток и других и, наоборот, усиление экспрессии прочих адгезивных молекул, обеспечивающих мобильность опухолевых клеток и их контакт с внеклеточным матриксом. На клеточной поверхности снижается концентрация ионов кальция, что приводит к повышению отрицательного заряда опухолевых клеток. Усиливается экспрессия интегриновых рецепторов, обеспечивающих прикрепление клетки к компонентам внеклеточного матрикса - ламинину, фибронектину, коллагенам. Во второй фазе опухолевая клетка секретирует протеолитические ферменты и их активаторы, которые обеспечивают деградацию внеклеточного матрикса, освобождая тем самым путь для инвазии. В то же время продукты деградации фибронектина и ламинина являются хемоаттрактантами для опухолевых

клеток, которые мигрируют в зону деградации в ходе третьей фазы инвазии, затем процесс повторяется в новой области [Коган, 2002].

Метастазирование - заключительная стадия морфогенеза опухоли, сопровождающаяся определенными гено- и фенотипическими перестройками опухоли. Способность к метастазированию является отличительной особенностью злокачественных опухолей и основным способом их распространения. Процесс метастазирования связан с распространением опухолевых клеток из первичной опухоли в другие органы по лимфатическим и кровеносным сосудам, периневрально, имплантационно, что стало основой выделения видов метастазирования. Процесс метастазирования объясняет теория метастатического каскада, в соответствии с которой опухолевая клетка претерпевает цепь (каскад) перестроек, обеспечивающих распространение в отдаленные органы [Коган, 2002]. Процесс метастазирования начинается с возникновения метастатического субклона опухолевых клеток с измененной плазмолеммой, в результате чего теряются межклеточные контакты, и появляется способность к передвижению. Затем опухолевые клетки мигрируют через внеклеточный матрикс, прикрепляясь интегриновыми рецепторами к ламинину, фибронектину, коллагеновым молекулам базальной мембраны сосуда, осуществляют ее протеолиз за счет выделения коллагеназ, катепсина, эластазы, гликозаминогидролазы, плазмина и др. Это позволяет опухолевым клеткам проникать через базальную мембрану сосуда и прикрепляться к его эндотелию. Затем, клетка изменяет свои адгезивные свойства (супрессия адгезивных молекул семейства cell adhesive molecules - САМ) и отделяется как от опухолевого пласта, так и от эндотелия сосуда. На следующем этапе формируются опухолевые эмболы, которые могут состоять только из опухолевых клеток или же из опухолевых клеток в сочетании с тромбоцитами и лимфоцитами. Фибриновое покрытие таких эмболов может защищать опухолевые клетки от элиминации клетками иммунной системы и действия неспецифических факторов защиты. На заключительном этапе происходят взаимодействие опухолевых клеток с эндотелием венул за счет рецепторов и

молекул CD44 и прикрепление, затем протеолиз базальной мембраны, инвазия в периваскулярную ткань и рост вторичной опухоли. В ходе прогрессии опухоли может происходить ее клоналъная эволюция, то есть могут появляться новые клоны опухолевых клеток в результате вторичных мутаций, что приводит к поликлоновости опухоли и доминированию наиболее агрессивных клонов как итог клональной селекции. Доброкачественные опухоли характеризуются доминированием опухолевых клеток одного клона на протяжении всего времени существования, тогда как в злокачественных опухолях постоянно прогрессирует поликлоновость, особенно в низко дифференцированных высокозлокачественных вариантах [Коган, 2002].

В результате вышеописанных процессов опухолевые клетки приобретают следующие морфологические и метаболические особенности.

1. Изменяется мембрана клеток, что выражается в повышенной подвижности мембранных белков, при этом латеральная подвижность мембранных липидов остается нормальной. Это приводит к потере связи поверхностных белков с белками цитоскелета, что является наиболее вероятной причиной изменения формы клеток [Извекова, 1991]. Показано изменение цитоскелета, исчезновение цитоплазматических фибрилл, локализация полимеризованного актина в мембранной области [Лю и др., 2002]. Морфологические изменения клеток, связаны с уменьшением количества или отсутствием фибронектина в межклеточном матриксе. Так, многие раковые клетки приобретают нормальный вид, если их поместить на подложку из фибронектина. На плазматической мембране трансформированных клеток экспрессируется в значительных количествах гликопротеин Р (от англ. permeability - проницаемость), который служит для удаления из клеток метаболических токсинов. Благодаря значительному количеству этого гликопротеина у опухолевых клеток развивается феномен множественной лекарственной устойчивости. Опухолевые клетки быстро и эффективно выводят применяемые для их уничтожения химиотерапевтические средства [Копнин, 2002].

2. Наблюдается увеличение трансмембранного транспорта глюкозы, что связано с экспрессией и включением в плазматическую мембрану транспортного белка, обладающего большим сродством к глюкозе, чем его аналог в нормальных клетках. Важно также, что наряду с транспортом глюкозы в раковых клетках возрастает гликолитическая активность. Для опухолевых клеток характерен ускоренный метаболизм^ вследствие чего повышается потребность в энергии и питательных веществах. Наблюдается дефектность, неполноценность или неэффективность метаболизма опухолевой клетки. Например, повышается образование молочной кислоты в результате интенсивного гликолиза при сравнительно малой интенсивности более эффективного аэробного окисления.

3. На опухолевых клетках идентифицированы два типа антигенов (АГ): 1) специфические опухолевые; 2) ассоциированные с опухолью. АГ первого типа обнаруживаются в опухолях, индуцированных химическими канцерогенами и онкогенными вирусами. Эти уникальные АГ являются результатом мутации или реаранжировки генов в процессе злокачественной трансформации. Большинство же опухолевых АГ не являются уникальными. Они экспрессируются и многими нормальными клетками, возможно, в меньшей степени, чем опухолевыми. Такие АГ называются ассоциированными с опухолью. К АГ этого типа принадлежат рецепторы ростовых факторов, экспрессирующиеся в опухолях в гораздо большей степени, чем в нормальных клетках, а также стадиоспецифические АГ, такие, как а-фетопротеин (АФП), который синтезируется клетками печени и желточного мешка эмбрионов млекопитающих. В период постнатального развития его синтез прекращается. Но в опухолях печени, а также в определенных опухолях яичка и яичников синтез АФП в постнатальный период возобновляется. Тесты, выявляющие АФП в сыворотке крови, вошли в клиническую практику для диагностики указанных опухолей. Их ценность состоит в том, что они позволяют контролировать результат лечения и выявлять в группах высокого риска опухоли на стадиях, доступных оперативному вмешательству. К

опухолеассоциированным АГ относятся также структуры, кодируемые онкогенами и генами-супрессорами. Впервые онкогены были обнаружены в составе генома онкогенных вирусов. Однако впоследствии было выяснено, что они не вирусного, а клеточного происхождения, и что они очень важны для функционирования нормальных клеток организма, так как контролируют рост и пролиферацию клеток. Мутации этих нормальных клеточных генов (их называют протоонкогенами) или их аномальная экспрессия, вызываемые канцерогенами или вирусами, могут явиться пусковым механизмом малигнизации клетки. Очевидно, в процессе эволюции вирусы позаимствовали эти гены у клеток организма-хозяина, в которых они реплицировались. Вместе с этими генами вирусы приобрели и способность трансформировать клетки, которые они заражают. Во многих опухолевых клетках обнаруживаются мутации в онкогенах. Например, мутантный онкоген ras находят у пациентов с опухолями желудочно-кишечного тракта [Попова, 2001]. В клетках есть также антионкогены, в норме запускающие апоптоз клеток, в которых произошли мутации, что предотвращает развитие опухоли. Мутации в антионкогенах нарушают их охранительную функцию. Главный представитель антионкогенов - р53. Показано, что мутации р53 обнаруживаются в 50% опухолей человека. Белки, кодируемые мутантными онкогенами и антионкогенами, являются АГ опухолевых клеток [Попова, 2001].

Цитологическими признаками опухолевых клеток являются: анаплазия, утрата клетками способности к дифференцировке; отсутствие полярности относительно нормальной эпителиальной выстилки; увеличение размеров и удельного объема ядра в клетке; наличие выраженного ядрышка; высокий уровень анеуплоидии и полиплоидии, что является результатом нарушения митоза; высокая вероятность нахождения клеток в фазе пролиферации. Морфологические изменения служат основой гистологической или цитологической диагностики злокачественных опухолей. Решающую роль в лечебно-диагностическом процессе играет классификация опухолей,

выступающая в каждом конкретном случае в качестве ключа к раскрытию сущности опухолевого процесса.

1.1.2. Классификация опухолей

Существует множество критериев для классификации опухолей. Объединяя гистологические (тканевая принадлежность опухоли), клинические (течение заболевания) и патоморфологические (структура опухолевой ткани) характеристики, опухоли делят на две большие группы.

1. Доброкачественные опухоли. Клетки доброкачественных опухолей в процессе опухолевой (неопластической) трансформации утрачивают способность контроля клеточного деления, но сохраняют способность (частично или почти полностью) к дифференцировке. По своей структуре доброкачественные опухоли напоминают ткань, из которой они происходят (эпителий, мышцы, соединительная ткань). Характерно частичное сохранение специфической функции ткани. Клинически доброкачественные опухоли проявляются как медленно растущие новообразования различной локализации. Доброкачественные опухоли растут медленно, постепенно сдавливая прилежащие ткани, но никогда не проникают в них. Они, как правило, хорошо поддаются хирургическому лечению и редко рецидивируют.

2. Злокачественные опухоли. Клетки злокачественных опухолей претерпевают значительные изменения, ведущие к полной утрате контроля над делением и дифференцировкой. По степени дифференцировки различают высоко-, средне-, мало- и недифференцированные опухоли. Порой определить источник опухоли довольно трудно из-за высокой степени атипизма. Гистологический анализ позволяет определить ткань - источник опухоли только в случае высоко- и среднедифференцированных опухолей. Клинически злокачественные опухоли проявляются весьма разнообразно. Им свойственен как очаговый рост, так и диффузная инфильтрация окружающих тканей и органов. Злокачественные опухоли характеризуются быстрым и агрессивным ростом и способностью прорастать в окружающие органы и ткани, кровеносные и лимфатические сосуды с образованием метастазов.

Злокачественные опухоли, как правило, трудно поддаются лечению и часто рецидивируют. Прогноз заболевания при наличии метастазов в отдаленных органах неблагоприятный [Налескина, 2003].

В зависимости от преобладания в структуре опухоли стромы (соединительной ткани) или паренхимы (раковых клеток) различают: простой рак, в котором строма и паренхима развиты в одинаковой степени; медуллярный рак, в структуре которого преобладает паренхима; фиброзный рак (скирр), в котором преобладает строма. Многие раковые клетки (особенно с высоким уровнем дифференцировки) сохраняют за собой функцию исходной ткани. Так, клетки аденокарциномы (рак железистой ткани) могут продуцировать слизь [Налескина, 2003].

Наиболее употребляемая классификация опухолей основана на типе ткани, из клеток которой развилась опухоль. Злокачественные опухоли, развившиеся из эпителиальной ткани, носят общее название «рак», или «карцинома». Строение карциномы в значительной степени зависит от структурно-функциональных особенностей клеток органов, из которых она развилась. Так, из клеток, контактирующих с внешней средой (эпителий кожи, слизистой оболочки рта, пищевода, гортани, прямой кишки), развивается опухоль, состоящая из многослойного плоского эпителия (ороговевающего и неороговевающего), которая носит название плоскоклеточной карциномы (плоскоклеточный рак). Из эпителия железистых тканей (железы бронхов, молочная железа, простата) развивается опухоль железистой структуры (железистый рак) - аденокарцинома. Саркомы — злокачественные опухоли из клеток соединительной ткани и других тканей мезенхимального происхождения, таких как мышечная, костная или сосудистая. Тератомами называют многокомпонентные опухоли из незрелых тканевых закладок. Эти опухоли встречаются в яичках, яичниках и средостении [Налескина, 2003].

Для обозначения выраженности дифференцировки опухоли используют четырехстепенную оценку злокачественности. Вид клеток, их ядер и числа фигур митозов являются характеристиками, определяющими степень

злокачественности опухоли. Наименьшая степень злокачественности — 1, наивысшая — 4. I стадия - опухоль размером до 2 см без поражения регионарных лимфоузлов. Эта стадия соответствует раннему раку для опухолей внутренних органов. II стадия - небольшая опухоль диаметром от 2 до 5 см без метастазов в регионарных лимфоузлах (стадия II А) или с метастазами в единичных подвижных регионарных лимфатических узлах (стадия II Б). III стадия - опухоль размером более 5 см, прорастающая в окружающие ткани, с ограниченной подвижностью или меньших размеров с метастазами в регионарных лимфоузлах в виде конгломерата. IV стадия - опухоль любого размера с отдаленными метастазами или с глубоким прорастанием в соседние органы и ткани.

Применяется также единая международная классификация с использованием трех букв Т, N, М, определяющих размер опухоли (Т - tumor), состояние регионарных лимфатических узлов (N - nodulus) и отдаленное метастазирование (М - metastasis). Четыре стадии опухоли обозначают: Т_ь Тг, Т₃, Т4. Состояние регионарных лимфатических узлов: N₀ - не увеличены, Ni -имеется единичный метастатический узел, N₂ имеется группа увеличенных лимфатических узлов, спаянных между собой, смещаемых по отношению к окружающим тканям. Метастазирование обозначается: М₀ - метастазы не обнаружены, М] - имеются отдаленные метастазы. Например: стадия TjNoMo соответствует I стадии классификации; стадия T₂NiMo - II стадии; T3N2M0 - III стадии; T4N2M0 или TjNoMj - IV стадии заболевания [Налескина, 2003]. 1.1.3. Компетентность иммунной системы в отношении опухолей Между возникновением опухолевой трансформации и развитием клинических проявлений злокачественной опухоли проходит довольно длительный период, во время которого иммунная система противодействует трансформированным клеткам [Zhong et al., 2003]. Концепция иммунологического надзора активно развивается в последние годы. Она основана на гипотезе о спонтанных мутациях. Смысл иммунного надзора состоит в распознавании чужеродных антигенов опухолевой клетки и в

формировании иммунного ответа, направленного на уничтожение этой клетки [Rosen et al., 2000; Adam et al., 2003; Wu, 2001]. Иммуносупрессия, вызванная у лабораторных животных ионизирующим облучением, удалением вилочковой железы у новорожденных или стероидной терапией, усиливает частоту возникновения и скорость роста опухолей. Показано, что у людей по мере старения частота появления злокачественных опухолей увеличивается, тогда как иммунитет снижается. У лиц с врожденным иммунным дефицитом частота возникновения рака в 10 000 раз выше, чем у лиц того же возраста в целом в популяции. Имеются клинические наблюдения, свидетельствующие об активном противодействии развитию злокачественной опухоли со стороны иммунной системы: спонтанная регрессия уже развившихся опухолей — это редкий, но документально фиксированный феномен. Чаще всего он отмечался при нейробластоме, злокачественной меланоме и аденокарциноме почки [Лакота и др., 2003].

Противоопухолевый иммунитет представляет собой систему, которая включает в себя две линии защиты с характерными функциями и свойствами: 1) природный (естественный, неспецифический) иммунитет реагирует на присутствие в организме чужеродного начала, в том числе измененных (мутировавших) клеток, которые являются потенциальными очагами развития опухоли; 2) адаптивный (специфический) иммунитет служит для реализации иммунного ответа путем формирования популяции (клона) лимфоидных клеток, направленных на борьбу с развивающейся опухолью [de Visser et al., 2006]. Характерными свойствами адаптивного иммунитета является наличие иммунологической памяти к конкретному опухолевому фактору (антигену) и способность распознавать этот фактор (т. е. специфичность), в результате чего формируется и поддерживается иммунный ответ, в конечном счете приводящий к разрушению нетипичных для организма клеток [Roitt et al., 2001].

Природный иммунитет реализуется за счет нескольких типов клеток: натуральных киллерных клеток (NK-клетки от англ. nature killer), мононуклеарных фагоцитов, нейтрофильных гранулоцитов [Jakobisiak et al.,

2003; Szuster-Ciesieiska et al., 2004; Hicks et al., 2006]. На ранних этапах роста опухоли в антиопухолевый ответ вовлекаются эффекторные клетки неспецифического иммунитета, а только потом, на более поздних стадиях, опухоль инфильтрируют лимфоциты [Graf et al., 2001]. Особая роль в раннем противоопухолевом иммунном ответе отводится NK-клеткам. В крови здорового человека содержиться 170 NK-клеток/мл. Эти клетки принимают активное участие в противовирусной и противоопухолевой защите. После плотного контакта с опухолевой клеткой NK-клетка выбрасывает белки перфорины, которые встраиваются в мембрану опухолевой клетки и образуют пору. После этого NK-клетка отходит от опухолевой клетки, через поры поступает межклеточная жидкость, вследствие чего опухолевая клетка набухает и разрушается [Попова, 2001].

Мононуклеарные фагоциты (моноциты циркулирующей крови и тканевые макрофаги) являются мощными цитотоксическими. Они присутствуют в селезенке, лимфатических узлах, легочных альвеолах. Специализированные макрофаги печени получили название «купферовские клетки». Макрофаги участвуют в запуске иммунного ответа в качестве антиген-презентирующих клеток. Они обладают широким спектром регуляторных, противоопухолевых и бактерицидных свойств, благодаря продукции фактора некроза опухоли-а (ФНО-а) [Roitt et al., 2001; Lamagna et al., 2006]. Макрофаги и дендритные клетки фагоцитируют апоптические раковые клетки через опосредованный рецептором путь, в результате чего опухолевый антиген попадает в цитоплазму, а затем представляется совместно с белками главного комплекса гистосовместимости І Т клеткам, которые обеспечивают антиопухолевый иммунитет [Feng et al., 2003]. Макрофаги могут способствовать также развитию опухоли. Активированные ассоциированные с опухолевыми клетками макрофаги, которые инфильтрируют опухоль, влияют на ангиогенез, продуцируя факторы роста, протеолитические ферменты и цитокины. Их наличие в строме опухоли коррелирует с неблагоприяным прогнозом при раке легкого, простаты, молочной железы [Bingle et al., 2002; Nakao et al., 2005]. NK

клетки, макрофаги и нейтрофилы связывают опухолевые клетки в розетки, в результате чего происходит их быстрый лизис [Hicks et al., 2006].

Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоцити (нейтрофилы) вовлечены в развитие противоопухолевого иммунного ответа [Di Carlo et al., 2001; Caruso et al., 2002; Adam et al., 2003], в том числе, при долговременном опухолевом росте [Chasseing et al., 1993], и считаются важными при определенных видах противоопухолевой терапии [Ueta et al., 1994]. Более подробно их роль в противоопухолевом иммунитете будет рассмотрена позже (параграф 1.4.1).

Лимфоциты являются основным компонентом адаптивного иммунитета. Они обладают различными функциями: Т-хелперы вырабатывают факторы, стимулирующие активность Т-киллеров; Т-киллеры продуцируют токсические факторы, разрушающие опухолевые клетки. Т-киллер распознает поверхностные антигены опухолевой клетки и вступает с ней в плотный контакт, после чего выбрасывает белки перфорины [Rodeberg et al., 2005; Castano et al., 2006]. Перфорины встраиваются в мембрану опухолевой клетки и в присутствии Са ⁺ полимеризуются, образуя каналы, через которые в клетку входит избыточное количество воды, и опухолевая клетка разрывается. Т-супрессоры, которые контролируют протекание иммунных реакций, могут дифференцироваться в организме при наличии опухолевых антигенов. Активность Т-супрессоров в свою очередь контролируется контрасупрессорными Т-лимфоцитами [Cormary et. al., 2004; Liu, 2004]. Уничтожать опухолевые клетки могут и активированные лимфоциты, называемые LAK-клетками (от англ. lymphokine activated killer), которые происходят из "нулевой" популяции лимфоцитов. Как и NK-клетки, они уничтожают опухолевые клетки без предварительного распознавания определённого антигена. Поскольку было установлено наличие специфических для опухолей антигенов (поверхностные маркеры опухоли), то в дальнейшем выяснили, что в иммунном ответе на них важную роль играют специфические для данных антигенов антитела. Основные классы противоопухолевых антител

представлены IgM и IgG. Фиксация антител на опухолевых клетках сама по себе не приводит к заметному угнетению их функции или разрушению. Она служит сигналом для эффекторов, вызывающих цитолиз [Roitt et al., 2001].

Наиболее важными неклеточными эффекторами иммунной системы являются цитокины. Интерлейкин 1 (ИЛ-1) является цитокином, выделяемым активированными макрофагами. В Т-лимфоцитах ИЛ-1 вызывает продукцию ИЛ-2, а в других клетках — экспрессию рецепторов к ИЛ-2. ИЛ-1 стимулирует созревание В-лимфоцитов и участвует в пролиферации этих лимфоцитов. Он также играет роль в синтезе печенью белков острой фазы и активации в скелетных мышцах процессов катаболизма в период стресса. ИЛ-1 стимулирует миграцию и пролиферацию эндотелиальных клеток, экспрессию адгезивных молекул, продукцию медиаторов воспаления и привлечение лейкоцитов, модулирует ангиогенез через активацию продукции проангиогенных факторов эндотелиальными клетками [Nakao et al., 2005]. Сигнальные события с рецептора этого интерлейкина вовлекаются в воспалительные процессы и рост опухоли. ИЛ-2 — гликопротеин, синтезируемый Т-хелперами, первоначально был назван «фактор роста Т-лимфоцитов». Было установлено, что в культуре ткани ИЛ-2 поддерживает пролиферацию Т-лимфоцитов и усиливает дифференцировку NK-клеток и Т-киллеров, активируемых лимфокинами. ФНО-а - полипептид, впервые был обнаружен в сыворотке крови мышей, сенсибилизированных вакциной БЦЖ, которым затем вводились бактериальные эндотоксины [Nakao et al., 2005]. Было установлено, что это вещество способно вызывать геморрагический некроз некоторых экспериментальных опухолей. Позже был описан широкий спектр его биологических свойств. В ряду последних — цитотоксичность ФНО-а по отношению к определенным клеткам, активация адгезии нейтрофилов и фагоцитоза, активирование лихорадки за счет непосредственного воздействия на терморегуляторный центр гипоталамуса. ФНО-а является одной из главных молекул цитотоксичности макрофагов. Он играет центральную роль в патогенезе эндотоксинового шока и может рассматриваться как фактор,

обусловливающий активацию катаболизма при хронических заболеваниях и злокачественных опухолях, что приводит к истощению.

Природный и адаптивный иммунитет - это звенья единого механизма иммунной защиты, реализация которого направлена на поддержание постоянства внутренней среды организма и обезвреживание чужеродных субстанций, в том числе трансформированных клеток. Различные типы клеток, участвующих в иммунных реакциях, взаимодействуют между собой с помощью соответствующих тканевых медиаторов - цитокинов (лимфокинов - для лимфоцитов, монокинов - для моноцитов и макрофагов). Все необходимые факторы противоопухолевой защиты заложены в системе иммунитета здорового организма, и, тем не менее, опухоли удается преодолеть этот барьер. 1.1.4. Способы избегания клетками опухоли надзора иммунной системы Опухолевые клетки обладают рядом защитных механизмов, которые затрудняют распознавание и их последующую элиминацию клетками иммунной системы. Во-первых, опухоль происходит из тканей организма и ее отличие от здоровых клеток (т.е. степень чужеродности или антигенность) не столь значительно, чтобы вызвать развитие выраженного иммунного ответа. Антигены опухоли (ОАА - опухоль-ассоциированные антигены) - это более слабые антигены по сравнению с антигенами бактерий или вирусов Опухоль может маскировать свои АГ, быстро изменять их за счет мутационного процесса. Во-вторых, со стороны формирующейся опухоли действует механизм отбора клеток, способных наиболее эффективно избегать иммунный надзор. В-третьих, растущая опухоль угнетающе воздействует на организм массой своих клеток и продуктами их жизнедеятельности, включая те, которые оказывают общее токсическое влияние и подавляют иммунитет. Под действием МИФ (макрофаг-ингибирующий фактор), выделяемого опухолевыми клетками, макрофаги, привлеченные к опухоли, теряют свою подвижность, но сохраняют способность синтезировать хемокины и цитокины. Обездвиженный макрофаг синтезирует большое количество активатора плазминогена, благодаря которому опухолевые клетки приобретают способность проникать в кровеносное русло и

распространяться по организму. Секретируемые опухолевыми клетками низкомолекулярные РНК также обладают иммуномодулирующей активностью: ингибируют регуляторную функцию макрофагов в отношении делящихся лимфоцитов, стимулируют бласттрансформацию лимфоцитов. Таким образом, причинами недостаточной эффективности иммунологических механизмов защиты при развитии опухоли являются: слабая антигенность ОАА; отбор опухолевых клеток по мере усиления злокачественности; продукция опухолью иммуносупрессивных факторов; общее токсическое воздействие опухоли на организм; множественные перекрестные реакции с антигенами хозяина; антигенная изменчивость клеток опухоли. Многие опухоли успешно ускользают от Т-киллерных клеток, за счет снижения синтеза молекул МНС-І. Вследствие этого Т-киллерный ответ на опухоль не развивается, поскольку Т-киллеры распознают АГ только в комплексе с молекулами МНС-І.

Все изложенное свидетельствует о том, что иммунная система реагирует на опухолевые клетки, но ее реакции в отношении многих опухолей оказываются недостаточными, чтобы предотвратить их развитие.

1.1.5. Влияние опухоли на компоненты иммунной системы Рост большинства злокачественных новообразований сопровождается изменениями показателей основных звеньев иммунного ответа [Куспаев и др., 2006, Szatworski and Wathan, 1991]. Иммунный ответ при развитии опухоли нарушается как на этапе презентации антигена, так и на этапе реализации эффекторной функции. Дендритные клетки первыми подвергаются атаке со стороны опухоли [Zhong et al., 2003]. Дендритные клетки - это субпопуляция высокоспециализированных клеток, основной функцией которых является поглощение, процессинг и презентация антигенов эффекторным клеткам в составе молекул МНС в комбинации с костимулирующими молекулами. В норме для адекватного иммунного ответа необходимо контактное и дистантное взаимодействие дендритной клетки и Т-хелпера [Banchere et al., 1998]. Контактное взаимодействие осуществляется группой молекул на поверхности клеток. В частности, происходит последовательное взаимодействие CD2, МНС

II в комплексе с антигеном, CD40, ICAM-1, CD80/86 на поверхности антигенпрезентирующеи клетки с соответствующими молекулами на поверхности Т-хелпера: CD58, TCR5, CD154, CDlla/CD18, CD28, CD152. В передаче сигнала внутрь клетки участвуют гетеротримерные G-белки, малые ГТФазы, ПКС, каскад митоген-активируемых протеинкиназ, фосфатидилинозит 3-киназа (ФИ-З-К), кальций-кальмадулин система, а также группа киназ, связанных с Т-клеточным рецептором. Показано, что при онкологических заболеваниях взаимодействие клеток сохраняется, но передача сигнала внутрь клетки нарушается. Особенно это касается клеток, которые инфильтрируют опухоль. В частности, обнаружено снижение уровня экспрессии MHC-I и -II, CD80, CD86, CD154 на поверхности антигенпрезентирующих клеток из опухоли, а также снижение уровня экспрессии z-цепи TCR5 Т-хелперов. Нарушение экспрессии, соотношения и структуры интегринов выявляются как на лимфоцитах, так и на опухолевых клетках, что может способствовать уменьшению силы взаимодействия клеток между собой [Wang et al., 1989; Adam et al., 2003]. На мембране опухолевых клеток также нарушена экспрессия селектинов (CD44, ELAM-1), что коррелирует с плохим прогнозом заболевания [Miyake et al., 1988; Adam et al., 2003]. Одним из основных факторов, подавляющих функции лимфоцитов, находящихся в микроокружении опухоли, являются ганглиозиды (GDI a, GD2, GD3, GM1, GM2), которые экспрессируются на поверхности опухолевых клеток и слущиваются в межклеточное пространство. Нарушения эффекторной функции лимфоцитов проявляются в виде снижения уровня экспрессии гранзима В8 и киназ p59fyn и ZAP-70, находящихся в комплексе с TCR. Среди интегральных показателей функционирования иммунной системы наиболее значимы: снижение пролиферативного индекса, экспрессии а- и (3-субъединиц рецептора ИЛ-2, степень фосфорилирования белка, кодируемого геном Rb [Miyake et al., 1988]. Все эти изменения характерны как для периферических, так и для инфильтрирующих опухоль лимфоцитов, однако выражены они в разной степени. Уровень экспрессии рецептора ИЛ-2, z-цепи TCR, CD54 в

периферических лимфоцитах составляет примерно 80% от уровня экспрессии в лимфоцитах здоровых людей и 30% в лимфоцитах, инфильтрирующих опухоль. Это подтверждает тот факт, что данные изменения носят вторичный характер при росте опухоли [Van Egmond et al, 2001].

В последнее время активно обсуждается концепция, согласно которой в процессе возникновения и развития опухоли происходит нарушение баланса между секрецией "проопухолевых" - (ИЛ-6, ИНФ-а/р), "противоопухолевых" -(ИЛ-2, ФНО-Р) и регуляторных (ИНФ-у) цитокинов. При раковых заболеваниях также выявлены изменения в соотношении иммунорегуляторных субпопуляций Т-лимфоцитов, уменьшение их количества и снижение функциональной активности [Szatworski and Wathan, 1991; Schmielau, 2001; Segura-Huerta et al., 2003]. Наблюдается изменение липидного состава мембраны Т-лимфоцитов, что приводит к ослаблению их антинеопластических функций. Влияние развивающейся опухоли на компоненты врожденного иммунитета, которые реализуют первую линию защиты против проникающих микроорганизмов и собственных дефектных клеток, может проявляться в изменении активности натуральных киллеров, перитонеальных макрофагов и нейтрофилов [Hallett and Lloyds, 1997; Motta et al., 2003; Shiku, 2003]. Так, было показано, что микроокружение опухоли подавляет цитотоксические функции нейтрофилов, нарушает процесс апоптоза, снижает экспрессию адгезивных молекул [Wu et al., 2001].

Активность гуморального звена иммунитета остается нормальной и достаточно долго вообще не зависит от степени опухолевой прогрессии. Более того, нормальная активность гуморальной составляющей иммунитета оказывается фактором, способствующим прогрессированию злокачественного новообразования. Противоопухолевые антитела не только не обладают защитными свойствами, но и экранируют опухолевые клетки от действия эффекторов клеточного иммунитета. Говоря об иммунодепрессии, свойственной любому онкологическому заболеванию, следует иметь в виду, что ее выраженность и механизмы различны на последовательных этапах

появления единичных малигнизированных клеток, пролиферирующего опухолевого клона и материнской опухоли значительной массы, которая метастазирует в другие органы и ткани. Для начальных стадий развития рака наибольшее значение имеет нарушение экспрессии антигенов МНС I и II классов, а также костимулирующих молекул на дендритных клетках и несостоятельность антигенраспознающего рецептора Т-хелперов. Для поздних стадий опухолевого роста характерно снижение значений количественных и качественных показателей клеточного иммунитета, затрагивающих Т-лимфоциты, NK-клетки, цитотоксические моноциты/макрофаги и LAK-клетки.

Таким образом, общая иммунодепрессия при онкологических заболеваниях имеет многофакторное происхождение и обычно сочетается со способностью клеток опухолевого клона активно противостоять направленному на них воздействию эффекторов иммунной системы. Это свойство опухолевых клеток определяют как «иммунная толерантность», или «иммунная резистентность» [Антонов, 2004]. Клинические и экспериментальные данные демонстрируют двунаправленное модифицирующее влияние опухолевых и иммунных клеток. Такой характер взаимодействия с опухолевыми клетками присущ, в том числе, нейтрофилам.

1.1.6. Теории взаимодействия опухоли и иммунной системы. Роль стромы опухоли

Существует несколько гипотез для объяснения сложных взаимоотношений опухолевых и иммунных клеток. Одна из ранних - гипотеза иммунологического надзора. Согласно этой гипотезе в нормальных условиях иммунная система реагирует на появление в организме трансформированных клеток и включает свои эффекторные механизмы для их уничтожения. Впервые эта гипотеза была сформулирована в 1900 году Паулем Эрлихом, известным иммунологом, награжденным в 1908 году Нобелевской премией за создание теории гуморального иммунитета. Эрлих полагал, что опухолевые клетки распознаются иммунной системой как чужеродные и элиминируются. Предсказания гипотезы иммунного надзора подтверждаются обширным

зо фактическим материалом [Попова, 2001; Cui et al., 2003]. Другими словами, иммунокомпетентные клетки следят, надзирают, за возникновением трансформированных клеток и уничтожают их [Chiplunkar et al., 2001; Boon et al., 2003; Girardi et al., 2006]. Эта гипотеза была проверена и подтверждена в 1980 году в экспериментах с иммуннодефицитными мышами. У таких животных опухоль развивалась быстрее, чем у иммунокомпетентных животных [Germenis et al., 2007]. Однако эта теория не объясняет, как опухоль избегает надзора иммунной системы, сохраняется в организме и развивается [Dunn et al., 2004]. Исследование механизмов, с помощью которых опухолевые клетки достигают толерантности по отношению к иммунной системе, является необходимым для понимания этих процессов и разработки иммунотерапевтических подходов. Все вышесказанное создало предпосылки для возникновения новых гипотез и теорий.

Гипотеза иммунодепрессивного влияния опухоли. Предполагается, что раковые клетки продуцируют неизвестные биологически активные вещества, подавляющие иммунный ответ. Это предположение не имеет серьезных экспериментальных подтверждений. Однако известно, что раковые антигены могут угнетать активность лимфоцитов, блокируя их рецепторы. В результате, окруженный антигенами лимфоцит не может найти и распознать раковую клетку [Коган, 2002].

Очень популярна гипотеза дисбаланса между скоростью развития иммунного ответа и ростом опухоли. В соответствии с этой гипотезой рост опухолевой массы опережает интенсивность развития и размножения реагирующих на нее лимфоидных клеток. Происходит истощение той части лимфоцитов, которые могут реагировать на опухоль, и развивается иммунная беззащитность против нее [Коган, 2002].

На данный момент, взаимоотношения между развивающейся опухолью и иммунной системой оцениваются иначе. Клинические и экспериментальные данные свидетельствуют, что в определенных обстоятельствах иммунная система не только не отторгает опухоль, но участвует в ее развитии и

способствует этому развитию [Василенко и Кондратюк, 2006]. Особое внимание во взаимоотношениях опухоли и иммунной системы уделяется образуемому опухолью особому микроокружению - строме опухоли [Davies et al., 2000].

Весьма сложными являются взаимоотношения очага опухолевого роста (особенно злокачественного) и организма - хозяина. На самых ранних этапах роста опухоли нормальное микроокружение с помощью гуморальных воздействий и регулирующего влияния межклеточного матрикса препятствует пролиферации опухолевого клона, пока в результате мутаций он не выйдет из-под этого контроля и не приобретет способность к автономному неконтролируемому росту. Опухоль начинает создавать вокруг себя особое микроокружение - строму, которая становится важным структурным компонентом опухоли и играет важную роль в ее росте, прогрессии, инвазии и метастазировании [Stoppacciaro et al., 1993; Bhowmick et al., 2005; Jiang et al, 2005]. Строма в опухоли, как и строма в нормальной ткани, в основном выполняет трофическую, модулирующую и опорную функции. Стромальные элементы опухоли представлены клетками и экстраклеточным матриксом соединительной ткани, сосудами и нервными окончаниями. Возможны также изменения в самой строме, мутации в ее клетках, которые могут способствовать росту атипичных клеток паренхимы [Василенко и Кондратюк, 2006]. Клеточные элементы стромы опухоли образуются из предсуществующих нормальных клеток соединительной ткани, окружающей опухоль. В 1971 г. J. Folkman показал, что клетки злокачественных опухолей продуцируют некий фактор, стимулирующий пролиферацию клеток сосудистой стенки и рост сосудов. Это сложное соединение белковой природы назвали фактором Фолькмана. Как впоследствии было установлено, фактор Фолькмана представляет собой группу факторов роста фибробластов, которых в настоящее время известно более 11. Фолькман первым убедительно показал, что стромообразование в опухоли является результатом сложных взаимодействий между опухолевой клеткой, клетками соединительной ткани и клетками

иммунной системы. Стромальные клетки продуцируют некоторые онкобелки (c-sis, c-myc) и разнообразные факторы роста, стимулирующие пролиферацию клеток мезенхимального происхождения (факторы роста фибробластов, фактор роста тромбоцитов, ФНО-а, фибронектин, инсулиноподобные факторы роста и др.). Одновременно стромальные клетки экспрессируют рецепторы, связывающие факторы роста, и онкобелки, что стимулирует их пролиферацию. Кроме того, клетки стромы выделяют разнообразные протеолитические ферменты, что приводит к деградации экстраклеточного матрикса [Василенко и Кондратюк, 2006]. Клеточный состав стромы разнообразен и зависит от вида рака, он не коррелирует со степенью развития опухоли [Mueller and Fusenig, 2004].

Опухолевые клетки активно участвуют в образовании стромы [Muerkoster et al., 2004; Bhowmick et al., 2005]. Во-первых, трансформированные клетки стимулируют пролиферацию клеток соединительной ткани по паракринному регуляторному механизму, продуцируют факторы роста и онкобелки. Во-вторых, они стимулируют синтез и секрецию компонентов экстраклеточного матрикса клетками соединительной ткани. В-третьих, сами опухолевые клетки секретируют определенные компоненты экстраклеточного матрикса. Экстраклеточный матрикс имеет характерный состав компонентов в определенных опухолях, что можно использовать при дифференциальной диагностике. В-четвертых, опухолевые клетки продуцируют ферменты (коллагеназы, эластазы и др.), а также ингибиторы и активаторы ферментов, что способствует инфильтрирующему и инвазивному росту злокачественных опухолей [Коган, 2002; De Wever and Mareel, 2003]. Кроме того, инвазии опухоли способствуют активатор плазминогена урокиназного типа (иРА) и матричные металлопротеиназы (ММР) [Василенко и Кондратюк, 2006].

Рост опухолей зависит от степени развитости в них сосудистой сети. В новообразованиях диаметром менее 1-2 мм питательные вещества и кислород поступают из тканевой жидкости окружающих тканей путем диффузии. Для питания же более крупных новообразований необходима васкуляризация.

Ангиогенез в опухоли обеспечивается группой ангиогенных факторов роста, некоторые из них могут выбрасываться также активированными эпителиальными клетками в очагах хронического воспаления и регенерации [Saijo et al., 2002]. В группу ангиогенных факторов опухоли входят факторы роста фибробластов, эндотелия, сосудов глиомы, кератиноцитов, эпидермальный фактор роста, ангиогенин и др. [Nelson and Ganss, 2006]. В строме опухоли, как правило, развиваются неполноценные сосуды преимущественно капиллярного типа, имеющие нередко прерывистую базальную мембрану и нарушенную эндотелиальную выстилку. Эндотелий может замещаться опухолевыми клетками, а иногда и вовсе отсутствовать.

Таким образом, образование стромы в опухоли является сложным многостадийным процессом, в результате которого клетки и строма опухоли формируют своеобразный сложный многоклеточный «орган» (Рис. 1), работа которого направлена на поддержание и развитие опухоли [Mueller and Fusenig, 2004; Nelson and Ganss, 2006]. В этом своеобразном «органе» имеется своя клеточная иерархия и происходит обмен информацией между его составляющими.

Рис. 1. Схематичное изображение опухоли с компонентами стромы (по http ://www .nature/revi ews/cancer).

Обмен информацией между клетками опухоли, иммунной системы и стромы осуществляется посредством прямого клеточно-клеточного контакта, а также растворимых факторов (цитокинов и факторов роста) [Obermueller et al., 2004]. Опухолевые клетки сверхэкспрессируют воспалительные цитокины, которые привлекают такие клетки как моноциты, нейтрофилы, Т и В-лимфоциты в строму [Mueller and Fusenig, 2004; Ruegg et al., 2006]. Привлеченные в строму иммунные клетки активно вовлекаются в процессы онкогенеза [Obermueller et al., 2004]. Вначале они препятствуют развитию опухоли, проявляя свою основную, защитную, функцию. Позже строма опухоли влияет на иммунные клетки таким образом, что их функционирование подчиняется «законам опухолевых клеток», и они способствуют развитию опухоли. Постепенно формируется иммунная толерантность опухоли, как результат стромальных взаимоотношений опухолевых и иммунных клеток [Zou, 2005]. Например, макрофаги продуцируют ФНО-а, который оказывает цитотоксическое действие на опухолевые клетки со сверхэкспрессией Мус посредством вовлечения генов р53 дикого типа и Вах, что индуцирует апоптоз. Но поскольку в опухолевых клетках часто происходит мутация р53, этот механизм гибели клеток реализуется не всегда. Макрофаги стромы часто секретируют Н2О2, что нарушает функцию Т-лимфоцитов и даже приводит к их апоптозу. Продуцированные макрофагами стромы оксид азота и тромбоцитарный фактор роста эндотелия могут усиливать рост опухоли, способствуя ангиогенезу [Василенко и Кондратюк, 2006]. Нейтрофилы тоже способствуют ангиогенезу, изменяя экстраклеточный матрикс через секрецию ММР9 и ММР 13 [Mueller and Fusenig, 2004]. Микроокружение опухоли через выработку растворимых факторов поддерживает такие локальные условия, которые способствуют увеличению продолжительности жизненного цикла нейтрофила [Wislez et al., 2001].

На основе вышеописанных фактов в начале этого десятилетия Роберт Шрейдер выдвинул гипотезу иммуноредактирования или, как ее называют в зарубежной литературе, гипотеза «3-х Е» ( английский: elimination - equilibrium

- escape). Гипотеза основана на представлениях, что иммунная система как защищает организм от опухолевого роста, так и способствует формированию неиммуногенной, злокачественной, активно метастазирующей опухоли [Germenis et al., 2007]. Согласно этой гипотезе иммунный надзор является лишь частью иммуноредактирования, т.е. фазой более сложного процесса. Процесс иммуноредактирования состоит из трех стадий: элиминации, равновесия и избегания [Swann et al., 2007]. Эта гипотеза всесторонне определяет роль иммунной системы в канцерогенезе, а взаимодействие между опухолевыми и иммунными клетками представлено более динамично и комплексно, чем это представлялось в ранних теориях. Стадия элиминации характеризуется тем, что иммунные клетки распознают и удаляют возникающие в организме трансформированные клетки. Участниками этого процесса являются, как было описано выше, компоненты врожденного и адаптивного иммунитета. В фазе равновесия иммунные и опухолевые клетки сосуществуют в равновесных отношениях, т.е. опухоль не растет и не распространяется, но иммунные клетки уже не атакуют опухолевые. В течение этой фазы опухолевым клеткам свойственна повышенная генетическая нестабильность. Иммунная система осуществляет своеобразный эволюционный отбор, элиминируя распознаваемые опухолевые клетки, тогда как клетки, несущие новые мутации, не распознаются иммунной системой, в результате чего формируются иммунорезистентные опухолевые фенотипы, образуемые вследствие чрезвычайной динамической изменчивости опухолевых клеток. Таким образом, иммунная система осуществляет селекцию опухолевых вариантов, способных выжить во взаимодействии с иммунной системой [Zitvogel et al., 2006; Germenis et al., 2007]. Избегание - это последняя фаза, которая характеризуется тем, что опухолевые клетки мутировали до такой степени, что не распознаются иммунной системой, в результате начинается активный рост опухоли и ее метастазирование [Garcia-Lora, 2003]. Стадии элиминации и избегания экспериментально подтверждены в ряде работ, стадия равновесия является

гипотетической, так как ее очень сложно выявить экспериментально [Dunn et al., 2004].

Представленные современные данные литературы о взаимоотношениях опухолевых и иммунных клеток не только раскрывают и углубляют теоретические представления об особенностях роста, развития и прогрессирования опухолей, но уже сегодня имеют прикладное значение в морфологической диагностике, прогнозе и разработке новых подходов к лечению пациентов.

Однако, несмотря на наличие огромного клинического и экспериментального материала, остается много вопросов. Почему клетки иммунной системы не распознают измененные опухолевые клетки? Почему стадия равновесия переходит в стадию избегания, а не возвращается к стадии элиминации? Что происходит с периферическими, не инфильтрирующими опухоль, клетками иммунной системы?

Последний вопрос проанализирован в данной работе на примере периферических по отношению к опухоли клетках иммунной системы -нейтрофилах.

1.2. Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоцити (нейтрофилы)

1.2.1. Общая характеристика

Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты составляют 55-60% всех лейкоцитов крови человека, содержание которых в периферической крови человека составляет примерно 4150 клеток/мл. Они представляют гетерогенную популяцию клеток.

Характерным признаком нейтрофилов является сегментированное ядро и наличие нейтральных гранул в цитоплазме [Roitt et al., 2001]. Большинство раздражителей и воздействий на организм вызывают изменения их количества в крови. Время нахождения нейтрофилов в кровеносном русле составляет в среднем 6 - 8 ч, так как они быстро мигрируют в ткани. Зрелые нейтрофилы не делятся и гибнут в течение суток.

Нейтрофил реализует свою функциональную активность посредством нижеописанных способностей. Изменение формы является следствием активации двигательного аппарата. Как показано с помощью сканирующего электронного микроскопа, нейтрофилы, стимулированные хемоаттрактантами, быстро формируют длинные тонкие цитоплазматические ламеллы, которые, по-видимому, важны для прикрепления и миграции [Pember et al., 1983]. Адгезией называется способность клеток прикрепляться и задерживаться на определенных субстратах. Нейтрофилы кровяного русла прикрепляются к эндотелию сосудов и далее мигрируют из кровяного русла в очаг воспаления. При стимуляции адгезивные свойства нейтрофилов резко усиливаются. Хемотаксические пептиды индуцируют транслокацию интегрина CD11/CD18 нейтрофилов из внутриклеточного пула на поверхность плазматической мембраны, что способствует их адгезии на клетки эндотелия [Harvath, Leonard, 1982]. Хемотаксические агенты активируют секреторную дегрануляцию, т.е. высвобождение протеолитических ферментов и других белков из гранул и меньших запасающих органелл [Маянский, Маянский, 1989]. Нейтрофилы имеют азурофильные и специфицеские гранулы. В азурофильных гранулах содержатся кислые гидролазы (|3-глюкоронидаза, катепсины), нейтральные протеазы (эластаза, катепсины, лизоцим, миелопероксидаза). В специфических гранулах содержатся коллагеназа, лактоферрин, лизоцим, связывающий витамин В12 белок. Гранулы третьего типа, называемые С-частицы, содержат кислые гидролазы, желатиназу, протеиназу-3 [Roitt et al, 2001]. Направленная миграция нейтрофилов по градиенту хемотаксических факторов называется хемотаксисом. Поглощение бактериальных или других чужеродных частиц клетками называется фагоцитозом (Рис. 2).

Рис. 2. Активация цитотоксических функций нейтрофила при фагоцитозе. Связывание опсонизированных частиц с Fc-рецепторам и инициирует образование фагосомы и активацию процессов дегрануляции и респираторного взрыва (по Quinn et al., 2006).

Фагоцитоз частицы или микроорганизма начинается с взаимодействия опсонинов, покрывающих частицу, с соответствующими рецепторами клетки. Нейтрофилы имеют специфические Fc-рецепторы для различных субклассов иммуноглобулинов: IgG [Masuda et al., 1989], IgA [Mazengera, Kerr, 1990], a также рецепторы для фрагментов компонентов системы комплемента, гликопротеидов, полисахаридов [Brown et al., 1999] и неспецифические рецепторы для чужеродных веществ [Quinn et al., 2006]. В норме нейтрофилы находятся в покое, а при стимуляции проявляют цитотоксическую активность, которая опосредована протеолитическими ферментами гранул и активными формами кислорода (АФК). АФК продуцируются в респираторном взрыве, инициируемом активацией NADPH оксидазы [Babior et al., 2002; Segal, 2005], который сопровождается усилением потребления молекулярного кислорода и

повышенной утилизацией глюкозы [Ado, 1933]. Респираторный взрыв находится под строгим контролем клеточных сигнальных систем, потому что избыточная продукция АФК является повреждающим фактором для клеток организма-хозяина. Экспериментально доказано, что нейтрофилы способны участвовать в процессе антигенной презентации [Di Carlo et al., 2001]. Различные про-воспалительные цитокины, такие как ИЛ-1, ИЛ-6, ФНО-а, ИНФ-у, продуцируемые в очаге воспаления, активируют нейтрофилы и замедляют процесс вхождения клетки в апоптоз. В результате этого, продолжительность их жизни увеличивается, и они успевают мигрировать в лимфатические узлы, где представляют антигены фагоцитированных микроорганизмов подобно макрофагам и дендритным клеткам [Ishikawa and Miyazaki, 2005].

При острых инфекционных заболеваниях число нейтрофилов быстро нарастает. Они обеспечивают энергетические потребности путем гликолиза и поэтому могут существовать даже в тканях, бедных кислородом: воспаленных, отечных и со слабым кровоснабжениям тканях. Гной состоит главным образом из нейтрофилов и их остатков. Лизосомальные ферменты, высвобождающиеся при распаде нейтрофилов, вызывают размягчение окружающих тканей, т.е. формирование гнойного очага. Нейтрофилы - самые важные функциональные элементы неспецифического звена иммунитета. Они обеспечивают первую линию защиты против вторгшейся инфекции и являются мощнымиэффекторами воспаления. Нейтрофилы продуцируют растворимые хемотаксические факторы, которые привлекают как клетки врожденного иммунитета, так и адаптивного. Продуцируя цитокины, они модулируют баланс между гуморальными и клеточно-опосредованными иммунными реакциями через активацию ТЫ или Th2 клеточного ответа. Таким образом, их функционирование обеспечивает взаимодействие врожденного и адаптивного иммунитета [Di Carlo et al., 2001]. Нехватка нейтрофилов приводит к хроническим инфекциям.

Таким образом, данные последних лет развенчивают мнение о том, что нейтрофилы являются предельно дифференцированными клетками, о функциях которых все известно. Вероятно, что эти «хорошо изученные клетки», как считалось ранее, таят еще много сюрпризов для исследователей.

1.2.2. Мембранные рецепторы нейтрофилов

Функции нейтрофилов регулируются агентами разной природы через мембранные рецепторы. Многообразие типов рецепторов на мембране составляет основу функциональной пластичности нейтрофилов [Thelen et al., 1993; Downey etal., 1995].

Специфические рецепторы на мембране идентифицированы для С5а, СЗЬ и СЗЫ фрагментов комплемента, формилированных пептидов, липидного хемоаттрактанта лейкотриена В4 [Snyderman, Goetzl, 1981]. Адгезию нейтрофилов к эндотелию сосудов обеспечивают рецепторы адгезии -интегрины и селектины. Взаимодействие интегринов с адгезивными белками, содержащими специфическую аминокислотную последовательность Arg - Gly - Asp (RGP - последовательность), влияет на адгезивные свойства клеток, и участвует в активации нейтрофилов. RGP последовательность угнетает респираторный взрыв нейтрофилов, вызванный формилированным пептидом и, возможно, защищает их от спонтанной активации в кровяном русле.

Потенцирующие и ингибирующие взаимодействия компонентов сигнальных систем разных рецепторов усиливают или ослабляют способность клеток генерировать АФК [Hallett and Lloyds, 1997; Babior,1999; Seely et al., 2003]. Обращает на себя внимание то, что в регуляции нейтрофилов существуют иерархические отношения на уровне сигналов [Катанаев, 2001; Witko-Sarsat et al., 2000], рецепторов [Downey et al., 1995], внутриклеточных сигнальных путей [Zhao et al., 2003] и функциональных ответов [Van Eedan et al., 1999; Zhao et al., 2003]. Ярким примером строгой упорядоченности регуляции в нейтрофилах является подавление активации NADPH оксидазы адгезией через опосредованный интегрином сигнальный путь [Zhao et al, 2003].

Нейтрофилы, включаясь в реакцию тревоги с помощью хемотаксических молекул, мигрируют и накапливаются в очаге воспаления. Они интегрируют множество сигналов по мере продвижения по тканям и, как правило, ответ является суммой векторов [Zhao et al., 2003]. Хемоаттрактанты, производимые конечной мишенью, доминируют над агонистами, производимыми самой клеткой, т.е. формилированные пептиды и фрагменты комплемента являются более сильными аттрактантами, чем лейкотриен В4, ИЛ-8, фактор активации тромбоцитов.

Л'-формил-Мет-Лей-Фен (ФМЛФ), продукт деградации бактериальных белков, является одним из наиболее сильных хемоаттрактантов, активирует многие функции нейтрофилов [Катанаев, 2001; Hallett and Lloyds, 1997]. Семейство рецепторов ФМЛФ человека (семейство FPR) включает три типа рецепторов: 1) FPR_HUMAN - рецептор ФМЛФ с высоким сродством ( лежит в пико- или наномолярной области концентраций); 2) FPRL1_HUMAN -и 3) FML2_HUMAN два рецептора с низким сродством к формилированным пептидам [Murphy et al., 1993; Cui et al., 2002]. Семейство рецепторов ФМЛФ мыши представлено рецепторами FPR1 (высокоаффинный) и FPR2 (низкоаффинный) [Hartt et al., 1999; Cui et al., 2002]. Считается, что сигнальные системы обоих рецепторов включают Gj-белок и систему вторичных посредников фосфатидилинозит/кальций []. По имеющимся данным в нейтрофилах человека высоко- и низкоаффинные рецепторы ФМЛФ используют разные сигнальные компоненты при фосфорилировании /-пластина [Paclet et al., 2004]. В нейтрофилах мыши оценена роль рецепторов с разным сродством в продукции супероксида [Lavigne et al., 2002], проведенный авторами фармакологический анализ показал сходство сигнальных событий в FPR^+/+ и FPR'^A нейтрофилах. Сравнительные данные по взаимодействию сигнальных путей высоко- и низкоаффинных рецепторов с сигнальными путями других рецепторов отсутствуют. Остается неизученным вопрос, изменяется ли представительство рецепторов ФМЛФ с разным сродством и

42 сигнализация при активации функций нейтрофилов при заболеваниях, включая онкологические.

1.2.3.1. NADPH оксидаза

NADPH оксидаза - многокомпонентный ферментный комплекс (Рис. 3). В ее состав входят два интегральных мембранных белка, р22^р'"" и gp9\^phox,четыре цитозольных белка - р40^р/!, р47^{р ох} , р67^/" и гуанин-нуклеотид-связывающий белок Rac2 [El-Benna et al., 2005; Groemping, Rittinger, 2005; Wilkinson, Landreth, 2006].

Неактивная форма Активная форма

20,

Рис. 3. Сборка и активация комплекса NADPH оксидазы (по Wilkinson, Landreth, 2006). Стимуляция нейтрофила вызывает переход Rac в активную форму и фосфорилирование цитозольных компонентов p47^ph<,x and p67^piw*. Эти субъединицы транслоцируются к мембране и связываются с р22^р1ю* и gp91^phox , что инициирует продукцию АФК.

Субъединицы р22^ргм и gp91^/'^ох образуют гетеродимерный флавопротеин, известный как цитохром Ь$$$, который локализован в мембранах секреторных везикул и специфических гранул. Субъединица gp91^pAo1 является гликозилированной р-субъединицей цитохрома b_55S, р22^рАю: - а-субъединицей. Стабильность каждой субъединицы флавоцитохрома Ь₃5в зависит от гетеродимерной формации таким образом, что мутации как gp91^pho\ так и p22^phox приводят к отсутствию обоих субъединиц на клеточной поверхности.

Цитохром fe₅₅₈ содержит одну молекулу флавина и два гема, которые образуют электронно-транспортную цепь NADPH оксидазы. Экспериментально показано, что цитохром Ь₅₅$ способен генерировать 0~₂ в отсутствии других компонентов NADPH оксидазы [Nisimoto et al., 1999; Groemping, Rittinger, 2005].

Белок gp91^phox рассматривают как члена семейства NOX белков, которые экспрессируются в нефагоцитирующих клетках, и имеют множество функций, не относящихся к антимикробной активности [Lambeth et al., 2000].

Цитозольный компонент p47^phox состоит из 390 аминокислот. Он содержит два SH3 мотива, один обогащенный пролином регион и один РХ домен (плекстрин-гомологичный домен). РХ домен специфически взаимодействует с фосфоинозитидами, в частности с фосфатидилинозит-3,4-дифосфатом, что важно для удержания p47^pte в примембранной области [Groemping, Rittinger, 2005]. SH3 мотивы и обогащенный пролином домен также участвуют во взаимодействии с цитохромом Ь₅58 и p67^phox. Во время активации NADPH оксидазы p47^phox связывается с цитохромом Ь₅₅%, обеспечивая транслокацию цитозольного комплекса _V4(f^h0x - p47^pte - p67^phox из цитозоля к мембране. Этот процесс не происходит без множественного фосфорилирования тр47^рИох [Е1-Benna et al., 2005; Groemping, Rittinger, 2005; Wilkinson, Landreth, 2006]. Показано, что р47^р/,м является наиболее фосфорилированной субъединицей NADPH оксидазы, имеющей 11 сайтов фосфорилирования [Groemping, Rittinger, 2005]. Известно, что p47^phox является субстратом ПКС, MAPKs, РКА, р21-активируемой киназы, ФИ-З-К для фосфорилирования in vitro [El Benna et al., 1994; Wilkinson, Landreth, 2006]. Какой из этих ферментов фосфорилирует in vivo и по какому сайту, остается неизвестным. Подобно p47^phox, p22^phox и p67^phox также фосфорилируются при активации клетки, хотя функциональная значимость фосфорилирования не известна.

Субъединица p67^phox состоит из 526 аминокислот, содержит два SH3 домена, один пролин-обогащенный домен и домен, связывающий NADPH. Белок p67^phox тесно взаимодействует с цитоскелетом и фосфорилируется во время стимуляции нейтрофила, но в меньшей степени, чем p47^phox. Эта

субъединица взаимодействует с Rac2 и с цитохромом Ь₅58 и регулирует каталитическую активность NADPH оксидазы через последовательность, называемую «активный домен» [El-Benna et al., 2005]. «Активный домен» (200-210 аминокислот) необходим для активации переноса электрона через флавоцитохром b₅₅8 [Nisimoto et al., 1999].

Субъединица p40^phox состоит из 339 аминокислот, содержит один SH3 домен и один РХ домен. Белок слабо фосфорилируется при активации клетки и не является необходимым для сборки NADPH оксидазы. Функциональная роль белка p40^phox до конца не определена, в экспериментах in vitro было показано как и его стимулирующее, так и ингибирующее действие на NADPH оксидазу [Wientjes, 1995; El-Benna et al., 2005]. РХ домен специфично связывается с фосфатидилинозит-3-фосфатом, который накапливается в фагосомальных мембранах, что способствует удержанию NADPH оксидазного комплекса в мембране [Groemping, Rittinger, 2005].

В сборке фермента участвуют два малых ГТФ-связывающих белка: Rac2, локализованный в покоящейся клетке в цитоплазме в виде димерного комплекса с Rho-GDI, и RaplA, локализованный в мембранах, из которых он может быть очищен вместе с цитохромом [Werner, 2004; Wilkinson, Landreth, 2006]. Обмен Rac-GDP на Rac-GTP является необходимым событием для инициации сборки и активации оксидазы [Babior et al., 2002; Werner, 2004; Wilkinson, Landreth, 2006]. Rac участвует в переносе электрона, и независимо от p67^phox регулирует перенос от NADPH к FAD [Diebold et al., 2001]. При высоких концентрациях р67^{р ох}и Rac в бесклеточных системах для восстановления высокой активности NADPH оксидазы не требуется р47^{р ох} [Freeman et al., 1996].

NADPH оксидаза активируется как посредством рецептор-зависимого механизма, так и рецептор-независимого. Активация NADPH оксидазы требует фосфорилирование белков и транслокацияи цитозольных компонентов к плазматической мембране [Vignasis, 2002; Takeya, Sumimoto, 2003; El-Benna et al., 2005]. Считается, что при активации клетки различными стимулами

цитозольный компонент р47^{р ох} множественно фосфорилируется и инициируется миграция цитозольного комплекса к мембране, где он связывается с цитохромом 6₅58, собираясь в активную оксидазу. р47^/'^/ю* с помощью SH3 домена связывается с обогащенным пролином доменом p22^phox и с фосфоинозитидами мембраны посредством РХ домена. Кооперативность этих взаимодействий, оба из которых обязательны, ведет к активации NADPH оксидазы [Bokoch, Diebold, 2002; Werner, 2004]. Во время активации, Rac2 связывает ГТФ, при участии фактора обмена гуанин-нуклеотида (guanine-nucleotide exchange factors - GEF) и мигрирует к мембране, где связывается с _p67Phox [_Takeyaj Sumimoto, 2003; Werner, 2004; Wilkinson, Landreth, 2006]. В покоящихся клетках Rac2 связан с GDI, ингибитором диссоциации Rac2 - ГДФ. При связывании Rac2 с ГТФ происходит диссоциация комплекса Rac2 - GDI. В это же время, цитохромом Ь₅58 ^и RaplA появляются на поверхности клетки, высвобождаясь из мембран секреторных везикул и позже из мембран специфических гранул. При сборке NADPH оксидазы происходит ее активация, что опосредует генерацию АФК.

Отсутствие компонентов NADPH оксидазы приводит к дефициту продукции АФК при хроническом грануломатозе (chronic granulomatous disease - CGD) [Nunoi et al., 1988; Heyworth et al., 2003; El-Benna et al., 2005]. У больных с такими генетическими нарушениями наблюдается повышенная восприимчивость к различным бактериальным и грибковым инфекциям. NADPH оксидаза представляет собой комплекс белковых молекул со сложной регуляцией активности, которая была исследована преимущественно на модельных системах. Фосфорилирование цитоплазматических и мембранных компонентов NADPH оксидазы инициирует ее сборку, активацию и продукцию АФК [Zhang et al., 1998; Vignasis, 2002; Takeya, Sumimoto, 2003; El-Benna et al., 2005].

1.2.3.2. Активация NADPH оксидазы, сигнализация

Хемотаксический пептид ФМЛФ активирует респираторный взрыв, связываясь со специфическим рецептором, принадлежащим к семейству

серпентиновых рецепторов [Thelen et al., 1993; Paclet et al., 2004]. Показано, что в трансдукции сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу участвуют гетеротримерный Gj-белок, малые ГТФазы, ПКС, каскад МАРК, ФИ-З-К [Hallett, Lloyds, 1997; Kyriakis, Avrach, 2001; Paclet et al., 2004].

Известно, что при развитии респираторного взрыва нейтрофилов передача сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу идет по фосфоинозитидному пути с участием фосфолипазы С (ФЛС), инозитол-1,4,5-трисфосфата (ФИз), Са²⁺ и ПКС [Yamamori et al, 2004; Frey et al., 2006; Kilpatrick et al., 2006].

Ключевым процессом при активации NADPH оксидазы является множественное фосфорилирование p47^phox субъединицы, что приводит к снятию автофосфорилирования, транслокации к мембране и инициации сборки ферментного комплекса. Исследование активации NADPH оксидазы в бесклеточной системе показало, что наиболее значимо фосфорилирование p47^phox по остаткам 303, 304, 328 серина, что снимает автоингибирование [Groemping, Rittinger, 2005]. Показано, что в процесс фосфорилирования p47^phox субъединицы вовлекаются несколько протеинкиназ, ПКС играет доминирующую роль в этом процессе. Быстрое фосфорилирование p47^phox наблюдалось при инкубации цитозоля нейтрофилов с очищенной ПКС, что дало возможность предположить роль этой киназы в активации NADPH оксидазы в интактных клетках [Dang et al., 2003].

Кроме фосфорилирования компонентов NADPH оксидазы, направленного на усиление активности фермента, было обнаружено фосфорилирование, которое приводило к угнетению активности оксидазы. Фосфорилирование p47^phox на фоне каликулина А, блокатора фосфатаз 1 и 2, происходило в сайте, отличном от сайта ПКС, и подавляло активацию NADPH оксидазы.

ПКС открыта Я. Нишизукой в 1977 году, является одним из важнейших элементов клеточной системы передачи сигналов, экспрессируется практически во всех клетках млекопитающих (за искл. эритроцитов). ПКС осуществляет фосфорилирование по остаткам серина и треонина, причем для активации фермента необходимы кальций и фосфолипиды. Ее субстратами в различных

клетках служат ядерные белки, белки цитоскелета, ферменты - спектр очень широк. Полипептидная цепь - 670-690 аминокислот, мол. масса 77кДа. Состоит из двух функционально различных доменов. В нормальных условиях находится в цитозоле в неактивной форме. Выявлено 13 изоформ данного фермента, из которых наиболее распространены - а, -(31, -011. Изоформы РКС отличаются по своим биохимическим характеристикам, тканеспецифической экспрессии и внутриклеточной локализации. Семейство изотипов ПКСклассифицируется на три группы: 1) классические- кПКС-а, -|3I, -J3II, -у, активируются ДАТ, кальцием, фосфатидилсерином (ФС), ненасыщенными жирными кислотами; 2) новые - нПКс-8, -є, -г), -0, активируются ДАГ и ФС; 3) атипичные - аПКС-^, -А,, -і, -ц, активируются ФС и ненасыщенными жирными кислотами [Xu et al., 2004; Tosl et al., 2005]. ПКС присутсвует в нейтрофилах в виде пяти изоформ - a, pi, pil, б, .С,. ПКС активируется с рецептора ФМЛФ через фосфолипазу Cpi-3 [Takeya, Sumimoto, 2003; El-Benna et al., 2005; Kilpatrick et al., 2006].

Фосфорилирование по тирозиновым остаткам компонентов сигнальных путей от рецептора ФМЛФ к NADPH оксидазе представляет один из механизмов регуляции активности NADPH оксидазы [Wakimoto et al., 2003].

Также сформировалось представление об участии каскада МАРКиназ в активации NADPH оксидазы [Forsberg et al., 2001; Kyriakis, Avrich, 2001; Yamamori et al., 2002; Kilpatrick et al., 2006]. В последние годы идет интенсивное изучение механизма активации каскада МАРК [Tosi et al., 2005; Hui et al., 2007]. MAPKs относятся к классу протеинкиназ, обладающих способностью фосфорилировать как по тирозиновым, так и по сериновым и треониновым остаткам [Dewas et al., 2000]. MAPKs контролируют клеточные ответы, рост, апоптоз и реагируют на стресс. MAPKs делят на три субсемейства: 1) р44 МАРК и р42 МАРК, известные также как ERK1 и ERK2 (extracellular signal-regulated kinases); 2) стресс-активируемые протеинкиназы -JNKs или SAPKs (c-Jun N-terminal kinases, stress-activated protein kinases), 3) p38 МАРК. Каждая МАРК имеет специфические субстраты и функции и играет критическую роль в клеточной прполиферации, дифференцировке и гибели

[Tosi et al., 2005; Hui et al., 2007]. Четыре различные изоформы p38 МАРК (а, (З, у, 5) были идентифицированы у млекопитающих. р38 выделена исследователями, как основной модулятор воспалительных ответов [Hui et al., 2007]. Для активации MAPKs необходимо фосфорилирование по тирозину или серин/треонину и участие малых G-белков, относящихся к семейству Ras. Ras белки имеют двойственную роль в окислительно-восстановительной сигнализации: участвуют в регуляции продукции АФК и могут быть активированы АФК in vivo и in vitro. Ras принимает участие в активации c-raf. ERK, JNK и р38 МАРК активируются через независимые, часто перекрещивающиеся, сигнальные каскады, включающие киназу МАРК (МАРКК), которая ответственна за фосфорилирование МАРК, и киназы киназ МАРК (МАРККК), которые фосфорилируют и активируют МАРКК. MAPKs ответственны за фосфорилирование широкого спектра эффекторных белков, в особенности транскрипционных факторов. Сигнальный каскад, активирующий ERK, регулирует клеточную пролиферацию, а сигнальные каскады, активирующие JNK и р38 - реакцию клетки на стресс [Chang et al, 2004]. При активации рецептора ФМЛФ возможна активация MAPKs Ras/Raf зависимым путем, а также через ПКС. Было показано, что при стимуляции нейтрофилов ФМЛФ в активации MAPKs могут принимать участие Src-киназы [Mocsai et al., 2000]. Большую роль приписывают MAPKs в регуляции цитоскелета нейтрофилов, процессов экзоцитоза и эндоцитоза, респираторного взрыва, дегрануляции, экспрессии генов цитокинов и апоптоза [Nick et al., 2000; Alvarado-Kristensson et al., 2002; Yamamori et al., 2002].

В нейтрофилах обнаружены изоформы (3, у и 6 фосфолипазы С (ФЛС). ФЛСу активируется рецепторами-тирозиновыми киназами и/или связыванием с рецепторами факторов роста через SH2 домен. Но ФЛС, зависимая от рецептора эпидермального фактора роста, частично регулируется и G-белком, чувствительным к коклюшному токсину. ФЛС{32 активируется G-белками, сопряженными с серпентиновыми рецепторами [Rhee, 1999]. Именно эта изоформа требуется для продукции АФК в нейтрофилах [Kim, Dinauer, 2006].

ФЛС катализирует гидролиз фосфоинозитидов с образованием вторичных посредников фосфатидилинозит-3-фосфата (ФИ₃) и диацилглицерола (ДАТ). ДАГ остается связанным с мембраной и активирует ПКС. В свою очередь ФИ₃ стимулирует выброс Са²⁺ из эндоплазматического ретикулума, что приводит к активации ПКС [Kim, Dinauer, 2006]. Кроме того, ДАТ и Са²⁺ синергически усиливают перемещение ПКС к мембране [Thelen et al., 1993; Motta et al., 2003]. Другим важным компонентом трансдукции сигнала от рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу является ФИЗК, которая катализирует фосфорилирование инозитольного кольца фосфатидилинозит-4-фосфата и фосфатидилинозит-4,5-дифосфата по положению D-Ъ с образованием фосфатидилинозит-фосфатов в качестве вторичных посредников. ФИ-З-К является гетеродимерным ферментом, состоящим из регуляторной и каталитической субъединиц [Wymann, Marone, 2005; Hawkins et al., 2006; Rommel et al, 2007]. Известно несколько классов данного фермента, которые выделяют на основе структуры, регуляции и специфичности субстрата. Класс I включает класс IA (ФИ-З-К-а, -р, -5 изоформы) и класс ЇВ (ФИ-З-К-у), обладает двойной специфичностью, фосфорилирует как липиды, так и белки, которые контролируют многие клеточные процессы такие как рост и пролиферацию, выживание и апоптоз, адгезию и миграцию. Этот класс ферментов катализирует фосфорилирование фосфатидилинозит-4,5-бисфосфата с образованием фосфатидилинозит-3,4,5-трисфосфата, который играет роль вторичного мессенджера. Все четыре изоформы ФИ-З-К класса I - гетеродимеры, состоящие из каталитической субъединицы рНО, плотно ассоциированной с регуляторной субъединицей (р85, р50 или р55), которая регулирует активацию и локализацию фермента. Классы II и III остаются менее изученными [Frey et al., 2006; Rommel et al., 2007]. Наиболее исследована структура и функция a (pi 10/р85), р (pi 10/р85) и у (р 120/р 101) изоформ ФИ-З-К. Субъединица р85 содержит два SH2 домена и один SH3 домен. Кроме того, р85 содержит участки гомологии для киназы BCR (breakpoint cluster region) и для p21^ras-GAP. В нейтрофилах ФИ-З-К представлена классом IB: ФИ-З-К-у и -5. ФИ-З-К-у активирует ПКС-^, что

является критическим событием при активации NADPH оксидазы и генерации АФК. Считается, что изоформа ФИ-З-К-5 участвует преимущественно в процессах миграции и адгезии нейтрофилов [Rommel et al, 2007]. Так же продукт этой киназы, фосфатидилинозит-3,4,5-трисфосфат, участвует в привлечении и активации различных регуляторных белков через взаимодействие с их РХ доменами [Frey et al., 2006]. При активации NADPH оксидазы фосфатидилинозит-3,4,5-трисфосфат фиксирует Rac2, что необходимо для генерации АФК [Rommel et al, 2007]. В литературе нет четкого разделения механизмов активации различных изоформ ФИ-З-К в нейтрофилах. Существует предположение о том, что активация (3 и у изоформ ФИ-З-К происходит благодаря ру-субъединицам G-белка, а а - изоформа фермента активируется в результате тирозинового фосфорилирования [Hannigan et al., 2002]. Блокада данного фермента с помощью вортманнина приводит к подавлению вызванного ФМЛФ респираторного взрыва и, кроме того, ингибированию миграции нейтрофилов, активации секреторной дегрануляции и высвобождению фактора активации тромбоцитов [Yamamori et al., 2004].

1.3. Двойственная природа активных форм кислорода (АФК)

1.3.1. Характеристика АФК

Активные формы кислорода - группа свободнорадикальных молекул, являющихся частично восстановленными производными кислорода (0₂) и обладающих очень мощной окислительной способностью. К ним относятся: супероксидный анион-радикал (0₂'), перекись водорода (Н₂0₂), гидроксильные радикалы (*ОН, Н0₂*), синглетный кислород (*0₂), ионы Н0₂- и другие. Они, как правило, являются своего рода побочными продуктами работы дыхательной цепи - группы митохондриальных белков, утилизирующих кислород и непрерывно поставляющих клетке энергию в форме АТФ. Исходным радикалом для образования АФК является супероксидный анион-радикал (0₂-~). Сам по себе он не опасен, но легко превращается в перекись водорода (Н₂0₂), а перекись, в свою очередь - в гидроксил-радикал (ОН-). В

ходе реакций с участием кислорода образуется пергидроксид-радикал (НОО), а также пероксид- и алкоксид-радикалы [Кулинский, 1999; Rhee, 1999]. 1.3.2. Системы генерации и инактивации активных форм кислорода АФК возникают во всех отделах клетки спонтанно или ферментативно в специфических реакциях. Наибольший вклад вносит дыхательная цепь митохондрий, особенно при низкой концентрации АДФ. Важна роль системы цитохрома Р-450, локализованной в эндоплазматическом ретикулуме [Sapone et. al., 2003]. Также АФК продуцируются специфическими ферментами, такими как NADPH оксидаза в плазматической мембране фагоцитов и ксантиноксидаза в гиалоплазме.

Защита клеток от действия АФК в организме осуществляется двумя принципиально различными механизмами: 1) снижением концентрации супероксида путем уменьшения уровня Ог в клетке; 2) функционированием антиоксидантной системы. Среди механизмов антиоксидантной защиты есть как ферментативные (специальные белки-ферменты катализируют превращение активных форм кислорода), так и неферментные. Существует целый ряд соединений-антиоксидантов (например витамин Е) способных непосредственно реагировать со свободными радикалами, нейтрализуя их. Супероксиддисмутаза (СОД) является важнейшим элементом антиоксидантной защиты организма. Это фермент, состоящий из двух субъединиц с общей молекулярной массой 32 кДа, имеющий по одному атому меди и цинка. Существует также марганец-содержащая СОД, обнаруженная в печени крысы и человека. В бактериальных клетках обнаружена железосодержащая СОД. Фермент ускоряет скорость распада 0₂" на 4 порядка. Вторым эшелоном защиты организма от АФК являются пероксидаза и каталаза. Каталаза расщепляет перекись водорода до воды и молекулярного кислорода. В клетках каталаза в основном сосредоточена в пероксисомах, в которых содержатся и ферменты, продуцирующие перекись водорода, необходимую в ходе ряда процессов жизнедеятельности организма, в частности, в процессах неспецифической иммунной защиты. Наименьшая активность каталазы наблюдается в легких, мышцах и тканях глаза.

Пероксидаза, в особенности глутатион-пероксидаза, широко распространена в клетках животных и растений. Глутатион-пероксидаза состоит из 4 субъединиц, в каждой из которых содержится по молекуле селена. В клетках этот фермент располагается в цитозоле и матриксе митохондрий. Активность глутатион-пероксидазы зависит от содержания глутатиона в клетке, что, в свою очередь, определяется активностью глутатионредуктазы и концентрацией NADPH, который образуется в пентозофосфатном метаболическом цикле. Неферментные жирорастворимые антиоксиданты - витамин Е, витамин А и каротиноиды - активны в отношении всех АФК, но их вклад в общую антиоксидантную емкость не слишком велик. Из других агентов антиоксидантными свойствами обладают стероидные гормоны, билирубин; из водорастворимых - церрулоплазмин, трансферрин, альбумин. Аскорбиновая кислота инактивирует свободные радикалы, образуя неактивный радикал семидегидроаскорбат. Глутатион присутствует в клетках в высоких концентрациях, он является акцептором гидроксильного иона и синглетного кислорода, кроме того, он же является кофактором глутатион-пероксидазы и глутатион-редуктазы. Мочевая кислота присутствует в крови в достаточных количествах, которая эффективно акцептирует синглетный кислород и гидроксильный радикал. Аналогичной способностью обладают этанол, маннит, глюкоза и некоторые другие органические молекулы [Кулинский, 1999].

1.3.3. АФК-польза или вред?

Надо отметить излишнюю полярность такой, излюбленной многими авторами, постановки вопроса. Влияние зависит от состояния организма, концентрации и локализации АФК. На протяжении длительного времени в биологической и особенно медицинской литературе основной акцент делали на вредных эффектах АФК.

АФК образуются во всех клетках и во всех их отделах. Это минорные, но обязательные биологические процессы, выполняющие очень важные функции. Одна из них - синтез эйкозаноидов (локальных гормонов), простаноидов и лейкотриенов, а также участие в синтезе йодтиронинов. АФК необходимы для

иммунной защиты, так как усиливают синтез цитокинов и иммунных рецепторов, способствуют выходу лейкоцитов в ткани, лизируют фагоцитированные бактерии, ликвидируют старые и поврежденные клетки, способствуют повреждению и удалению несовместимых, а также злокачественных и пораженных вирусами клеток. Многие виды АФК выполняют очень важные физиологические функции. Так, гидроксил-радикал необходим для синтеза ряда биологических регуляторов (например, простагландинов), радикалы оксида азота (N0) участвуют в регуляции сокращения стенок кровеносных сосудов, а пероксинитрит стимулирует запрограммированную клеточную гибель (апоптоз) [Кулинский, 1999].

При избыточном уровне АФК повреждают клетки и способствуют развитию многих болезней: атеросклероза, инфаркта и инсульта, тяжелых воспалительных заболеваний, СПИДа, злокачественных процессов. Считается, что они вовлечены в процесс старения. При определенных заболеваниях количество АФК может возрастать или понижаться, что является следствием нарушения контроля их продукции [Abelson, Stossel, 1978; Slund et al., 1999; Sun et al., 2002].

Высвобождение АФК в ходе "дыхательного взрыва" происходит в фагосомы и в окружающую среду, что инактивирует бактериальные клетки, но может повреждать сами фагоциты и здоровые нормальные ткани. Активация нейтрофилов сопровождает любые явления некроза ткани, в том числе при микроинфарктах. Подтверждено участие гидроксильных радикалов в патогенезе ревматоидного артрита, при этом фагоциты активируются иммунными комплексами в синовиальной жидкости, и введение СОД в полость сустава оказывает терапевтический эффект [Коган, 1999]. В ходе приступа бронхиальной астмы также увеличивается генерация АФК, причем тяжесть астматических приступов коррелирует с усилением генерации АФК нейтрофилами и повышением их уровня в крови. В патогенезе воспалительных и констриктивных легочных заболеваний принимают участие АФК. При чрезмерном накоплении АФК, пероксидов и окисленных продуктов возникает

состояние, называемое обычно окислительным стрессом. Окислительный стресс приводит к повреждению наиболее важных биологических молекул -нуклеиновых кислот, белков, липидов. Многие заболевания, такие как эмфизема, атеросклероз, сахарный диабет, нейродегенеративный синдром, ревматоидный артрит, сопровождаются окислительным стрессом. Возможно, ОС является одним из главных факторов старения [по Finkel, 2000]. Окислительный стресс при гестозе, тяжелом осложнений беременности, может быть связан с активацией нейтрофилов и задержкой апоптоза нейтрофилов [von Dadelszen et. al., 1999].

1.3.4. Участие А ФК в процессах канцерогенеза

Вопрос об участии АФК в процессах возникновения опухолей постоянно привлекает внимание исследователей, однако, до настоящего времени он фактически однозначно не решен. Конкретный механизм индукции опухолей свободными радикалами мало понятен. Предполагают, что АФК повреждают хроматин, ДНК, мембраны, изменяют регуляцию концентрации внутриклеточного кальция. Из АФК только ОН вызывает повреждения ДНК (окисление оснований, их модификации, разрывы цепей, повреждения хромосом). Считают, что АФК вызывают больше мутаций, чем алкилирующие вещества - другой класс мутагенов. Мутации могут приводить к повреждению и гибели клеток или их злокачественному перерождению. Мутации, инициируемые АФК в ДНК половых клеток, приводят к наследуемым заболеваниям. Но в тоже время АФК в высоких концентрациях ингибируют синтез ДНК и деление клеток и могут активировать апоптоз, что полезно для организма, так как ценой гибели части клеток предупреждается прогрессирование злокачественных процессов и гибель всего организма. Молекула супероксида, время полужизни которой в клетке составляет около 10" ⁷ с, опасна не только тем, что за это сверхкороткое время сама может повреждать ДНК, но и тем, что инициирует цепные реакции образования других свободных радикалов. Интересно отметить, что многие потенциальные химические канцерогены, например, бензапирен, сами по себе не могут

вступать в реакцию с ДНК, но приобретают эту способность после активации АФК, превращаясь в клетке в истинные канцерогены [Кулинский, 1999].

Метаболизм АФК и его особенности в опухолевых клетках активно изучаются. В ядерной мембране опухолевых клеток обнаружена необычная ферментативная система, образующая 0{. Эта система отличается по своим свойствам от аналогичной системы в мембранах нормальных клеток тем, что она высокочувствительна к цианиду и использует в качестве субстрата не только NADPH, но и NADH. На митохондриях опухолевых клеток показано, что хотя удельная скорость генерации (V в них выше, но механизм генерации в основном такой же, как и в нормальных клетках [Fernandez, Suchard, 1998; Geijsenetal., 1999].

Для нормального функционирования организма важно поддержание оптимального уровня генерации АФК, что обеспечивается балансом активностей антиоксидантнои и прооксидантнои систем и координированным взаимодействием компонентов внутриклеточных сигнальных систем.

7.3.5. Влияние активных форм кислорода на сигнальные системы

АФК могут модифицировать ответ клеток на раздражители и активировать специфические сигнальные каскады [Griendling et al., 2000; Hiroyuki et al., 2003]. Окислительно-восстановительная регуляция происходит на различных уровнях трансдукции сигнала от рецептора к ядру [Nathan, 2003; Werner, 2004]. Являясь высокореактивными по своей природе, АФК могут непосредственно или опосредованно через различные сигнальные каскады изменять функции многих ферментов и транскрипционных факторов. В конечном итоге, активация сигнальных каскадов приводит к изменению в экспрессии генов, которая влияет на способность клеток к выживанию или приводит к гибели [Martindale, Holbrook, 2002].

АФК могут участвовать в передаче сигнала через клеточную мембрану, как вторичные мессенджеры. В качестве вторичных посредников выступают 0{, Н₂02, ОН' и гидроперекиси липидов, которые осуществляют регуляцию пролиферации, апоптоза, клеточной адгезии, свертывания крови и других [Вгаг

et al., 1999; Brown et al., 1999; Gamaley, Klyubin, 1999; Лю, 2001; Sorescu et al., 2001; Nathan, 2003].

Имеются экспериментальные подтверждения участия АФК в передаче сигнала, связанного с действием первичных мессенджеров. Первичные мессенджеры осуществляют регуляцию уровня АФК в клетке за счёт активации процессов их генерации или за счет снижения активности отдельных звеньев антиоксидазной системы. В процессе активное участие принимают цитокины. Они стимулируют выброс АФК из многих типов клеток, включая фибробласты человека, эпителиальные и эндотелиальные клетки [Kim et al., 2001]. С АФК связана передача сигнала, вызванного фактором роста тромбоцитов [Sunderson et al., 1995], эпидермальным фактором роста [Вас et al., 1997], трансформирующим фактором роста а-1 [Thannical, Fanburg, 1995; Lo, Cruz, 1995], фактором некроза опухолей (ФНО-а) [Lo, Cruz, 1995].

Другим важным звеном участия АФК в процессе сигнальной трансдукции является фосфорилирование белков [Kim et al., 2001]. Протеинкиназы и протеинфосфатазы могут быть мишенями при окислительном стрессе. Основными компонентами сигнальных каскадов, чувствительных к АФК, являются тирозиновые протеинкиназы, активность которых увеличивается при окислении, тирозиновые протеинфосфатазы, активность которых снижается при увеличении концентрации АФК. Показано, что экзогенная перекись водорода (обычно в миллимолярных концентрациях) вызывает тирозиновое фосфорилирование [Golgkorn et al., 1998]. Предполагают, что этот механизм может быть связан с зависимым от АФК ингибированием дефосфорилирования рецепторов тирозиновых протеинкиназ, через инактивацию связанной с мембраной тирозиновой протеинфосфатазы. Генерация АФК приводит к активации протеинтирозинкиназы и ПКС, что сопровождается стимуляцией, в частности, МАРК [Gopalakrishna, Jaken, 2000]. MAPKs (c-Jun-N-терминальная киназа и р38) связаны с состоянием ОС и процессом апоптоза. Через первичные мессенджеры (ФНО-а, ИЛ-6 и -2) при участии АФК происходит активация MAPKs за счет фосфорилирования. Активированные MAPKs перемещаются к

ядру, где они фосфорилируют белки-мишени, регулирующие факторы транскрипции [Rincon et al, 2000]. Таким образом, АФК, увеличивая активность различных протеинкиназ, участвуют в регуляции многочисленных клеточных процессов, таких как адгезия, пролиферация, сигнальная трансдукция, апоптоз [Carmody, Cotter, 2001]. Известно, что пероксинитрит (ONOCT) окисляет NH- и SH-группы аминокислот, что приводит, в частности, к инактивации а-ингибитора протеиназ, тканевого ингибитора металлопротеиназы-1, Мп²⁺- и Fe²⁺- СОД.

Потенциально важной мишенью для окислительно-восстановительной сигнализации является метаболизм фосфоинозитидов. Известно, что окисленные формы диацилглицерола являются более эффективными для активации ПКС, чем неокисленные.

При изучении гладкомышечных клеток обнаружили, что сигнализация, активированная АФК, изменяет концентрацию внутриклеточного Са [Suzuki et al., 1997]. Подобный эффект может быть важным при активации иммуннокомпетентных клеток [Maki et al., 1992]. В литературе активно обсуждается возможная физиологическая роль АФК в регуляции Са -сигнала и фосфорилирования белков [Carmody, Cotter, 2001; Suzuki et al., 1997]. Показано, что H₂0₂ влияет на транспорт Са через плазматическую мембрану [Roven et al., 1992]. Роль внеклеточного Са²⁺ в стимулированной АФК трансдукции изучена на примере индукции экспрессии протоонкогенов за счёт 0\~ в проксимальных тубулярных эпителиальных клетках почек [Maki et al., 1992]. Экспрессию гена c-fos, стимулированную 0₂~, который генерировала система ксантин/ксантиноксидаза, блокирует СОД, а не каталаза. Предполагается, что этот процесс связан с состоянием тиоловых структур мембран, соотношением их окисленных и восстановленных форм [Reeves et al., 1986]. Молекулярному кислороду и АФК придают важное значение в процессах эволюции и видообразования, у целого ряда клеток АФК вызывают ускорение клеточного деления [Lee et al., 1998], причем показано, что это регуляторный эффект, реализуемый через специфические белки (NF-kB, c-Jun, р21, c-fos).

Сигнальные пути, включающие JNK, р38 МАРКиназу, являются более устойчивыми к окислительно-восстановительной регуляции и влияют на выживание. ERK и JNK разнонаправленно влияют на выживание клеток во время стресса [Kolch, 2000]. По литературным данным, можно говорить о том, что ФИ-3-K/Akt является одним из главных окислительно-восстановительных сигнальных путей, который защищает клетку от окислительного стресса и способствует выживанию [Songyang et al., 1997; Kauffmann-Zeh et al., 1997].

1.4. Неоднозначность роли нейтрофилов в генезе опухоли

1.4.1. Антиопухолевая активность

Полиморфноядерные нейтрофильные гранулоциты (нейтрофилы) вовлечены в развитие противоопухолевого иммунного ответа [Di Carlo et al., 2001; Adam et al., 2003; Jablonska et al., 2005], в том числе, при долговременном опухолевом росте [Chasseing et al., 1993], и считаются важными при определенных видах противоопухолевой терапии [Ueta et al., 1994]. Экспериментально подтверждено селективное цитостатическое и цитотоксическое действие нейтрофилов на опухолевые клетки in vitro [Miyake et al., 1988; Wang et al., 1989; Di Carlo et al., 2001] и их способность ингибировать рост экспериментальных опухолей in vivo [Dvorak et al., 1978;. Fujii et al., 1988; Katano, Tosiru 1982; Lichtenstein et al., 1989]. Нейтрофилы первыми мигрируют к опухоли на ранних стадиях ее формирования [Stoppacciaro et al., 1993; Nakao et al., 2005] и являются активными компонентами стромы [Mueller, Fusenig, 2004]. Они скапливаются в зонах наиболее интенсивного роста опухоли и препятствуют распространению опухолевых клеток [Bru et al., 2004]. Продуцируемые нейтрофилами АФК, непосредственно осуществляющие киллинг опухолевых клеток, могут также активировать ингибиторы протеинкиназ, что, как и действие протеаз гранул нейтрофилов, приводит к экстраклеточным литическим повреждениям клеток опухоли. Кроме АФК нейтрофилы разрушают трансформированные и опухолевые клетки с помощью дефенсинов и протеолитических ферментов

[Lichtenstein, Kahle, 1985; Ottonelo et al., 1999; Di Carlo et al., 2001; Zivkovic et

al., 2005].

Продуцируемые нейтрофилами цитокины и хемокины привлекают и активируют макрофаги, NK, дендритные клетки, Т- и В- лимфоциты, которые обеспечивают антителозависимую цитотоксичность, а цитокины и хемокины к тому же ингибируют ангиогенез, вследствие чего наблюдается ишемия и некроз опухоли [McCourt et al., 1999].

1.4.2. Проопухолевая активность

Роль нейтрофилов, как и других клеток врожденного иммунитета, в возникновении и развитии опухолей не однозначна (Рис. 4) [De Visser et al., 2006].

Роль нейтрофилов в развитии опухоли

TGF|t Модификация состояния

GW1-CSF кейтрофила

IFNa і

^^uZ^?Jlfelll%^"?l^ * Про-олухоленая активность

По Di Carlo Е.. 2001; Mueller М.. 2004; Jablonska ., 2005

Рис. 4. Роль нейтрофила в развитии опухоли. Составлено по Di Carlo, 2001; Mueller, 2004; Jablonska, 2005.

Считается, что хроническое воспаление увеличивает вероятность возникновения онкологического заболевания. Нейтрофилы являются основными эффекторными клетками при воспалении. В очаге воспаления они активно продуцируют АФК, которые, как описывалось выше (параграф 1.3.4), имеют огромный канцерогенный потенциал, реализация которого приводит к

увеличению количества мутаций в клетках, тем самым вносит вклад в мультистадийный процесс канцерогенеза [Ohsima et al, 2003].

Важное значение хронического воспаления в патогенезе рака, демонстрируют экспериментальные работы на животных: употребление нестероидных противовоспалительных агентов приводило к значимому снижению вероятности развития рака кишечника, желудка и пищевода [Baron, Sandler, 2000; Garcia-Rodriguez, Huerta-Alvarez, 2001].

Как было показано на крысах с аденокарциномой, увеличение уровня циркулирующих в крови нейтрофилов коррелирует с усилением метастатического потенциала опухоли, так как в этом случае их большее количество инфильтрирует опухоль [Welch et al., 1989].

При гистологическом исследовании опухоли выявлено, что преобладающей популяцией инфильтрирующих опухоль клеток были нейтрофилы [Sandhu et al., 2000]. Нейтрофилы, инфильтрирующие опухоль, называют опухоль-ассоциированными. Как показано в последние годы, они способствуют прогрессии опухоли посредством различных механизмов и стимулируют ангиогенез, инвазию, метастазирование [Queen et al., 2005]. Такими механизмами являются секреция хемокинов, цитокинов, факторов роста, протеаз [Nielsen et al., 1996; Wu et al., 2001; Coussens, Werb, 2001; Nakao et al., 2005], продукция АФК [De Larco et al., 2004]; повышенная экспрессия L-и Р-селектинов [Borsig et al., 2002].

Цитокинами, способствующими ангиогенезу и развитию опухоли, являются ФНО-а, VEGF, ИЛ-1 и -6. ФНО-а выделяют, как ключевой цитокин, продуцируемый во время воспаления, который инициирует развитие опухоли [Jakobisiak, 2003; de Visser et al., 2006]. Цитокины привлекают другие воспалительные клетки, которые тоже способствуют ангиогенезу и онкогенезу [de Visser et al., 2006].

Перекись водорода, продуцируемая нейтрофилами, подавляет реакции адаптивного иммунитета, супрессируя Т-клетки, что показано при исследовании метастазирующих аденокарцином [Schmielau, Finn, 2001].

61 Инфильтрирующие опухоль нейтрофилы секретируют деградирующие матрикс ферменты, такие как коллагеназа 4 типа, гепараназа, ММР-9, -13, катепсины, плазминоген и урокиназа. Особое значение имеют ММР-9 и ММР-13, которые активно реконструируют экстраклеточный матрикс [Mueller, Fusenig, 2004; Nozawa et al., 2006]. Это подтверждает, что нейтрофилы могут помогать опухолевым клеткам во время миграции при метастазировании [Welch et al., 1989; Ruegg, 2006]. В экспериментах in vitro было показано, что нейтрофилы помогают опухолевым клеткам преодолевать эндотелиальный барьер. Нейтрофилы усиливали прикрепление опухолевых клеток к эндотелиальному монослою, тем самым усиливая их метастатический потенциал и инвазивность [Wu et al., 2001]. Показано, что нейтрофилы способствуют миграции опухолевых клеток через внеклеточный матрикс, помогают им проходить через стенки сосудов и мигрировать в новый места [De Larco et al., 2004]. Возможно, эти процессы обеспечиваются L- и Р-селектинами [Borsig et al., 2002].

Клинические и экспериментальные данные показывают, что клетки иммунной системы, как это ни парадоксально, способствуют онкогенезу. Важнейшей задачей современных исследователей в области онкологии является поиск новой стратегии лечения онкологических заболеваний, которая будет основана в значительной степени на иммунотерапии, приводящей к усилению противоопухолевого иммунитета и нейтрализации процессов стимулирующих развитие опухоли.

Изложенные данные демонстрируют, что роль нейтрофилов в генезе опухоли неоднозначна: их активность приводит к деструкции опухолевых клеток, и наоборот, способствует прогрессии опухоли и метастазированию. Интригующий вопрос: «Почему же так происходит, что нейтрофилы не продолжают борьбу против рака, а переходят на сторону опухоли?», все еще остается без ответа. Возможно, что сама опухоль трансформирует его функционирование. Этот вопрос рассматривается в диссертационной работе.

Для нормального функционирования организма важно поддержание оптимального уровня генерации АФК нейтрофилами. Это обеспечивается

координированным взаимодействием компонентов внутриклеточных сигнальных систем. Исследования внутриклеточной сигнализации широко проводятся на линиях трансформированных клеток [Gu et al., 2003; . Droge, 2001] и непосредственно на самих опухолевых клетках [Alessi et ah, 1995]. Изменения внутриклеточной сигнализации в клетках - участниках врожденного иммунитета, в том числе в нейтрофилах, при росте опухоли в организме остаются неисследованными. Возможно, что именно на уровне передачи сигнала происходят такие изменения, которые модифицируют функциональное поведение нейтрофила таким образом, что он меняет направление своей активности и начинает помогать опухоли.

В целом влияние нейтрофилов на процессы канцерогенеза остается на сегодняшний день малоизученной темой. Результаты исследований функций нейтрофилов при развитии опухоли являются противоречивыми. Полученные в ходе данного исследования результаты, возможно, помогут понять механизмы модификации клеток и найти новые терапевтические подходы к лечению онкологических заболеваний.

Цель данной работы состояла в выявлении особенностей в генерации активных форм кислорода, ее регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo.

Компетентность иммунной системы в отношении опухолей

В зависимости от преобладания в структуре опухоли стромы (соединительной ткани) или паренхимы (раковых клеток) различают: простой рак, в котором строма и паренхима развиты в одинаковой степени; медуллярный рак, в структуре которого преобладает паренхима; фиброзный рак (скирр), в котором преобладает строма. Многие раковые клетки (особенно с высоким уровнем дифференцировки) сохраняют за собой функцию исходной ткани. Так, клетки аденокарциномы (рак железистой ткани) могут продуцировать слизь [Налескина, 2003].

Наиболее употребляемая классификация опухолей основана на типе ткани, из клеток которой развилась опухоль. Злокачественные опухоли, развившиеся из эпителиальной ткани, носят общее название «рак», или «карцинома». Строение карциномы в значительной степени зависит от структурно-функциональных особенностей клеток органов, из которых она развилась. Так, из клеток, контактирующих с внешней средой (эпителий кожи, слизистой оболочки рта, пищевода, гортани, прямой кишки), развивается опухоль, состоящая из многослойного плоского эпителия (ороговевающего и неороговевающего), которая носит название плоскоклеточной карциномы (плоскоклеточный рак). Из эпителия железистых тканей (железы бронхов, молочная железа, простата) развивается опухоль железистой структуры (железистый рак) - аденокарцинома. Саркомы — злокачественные опухоли из клеток соединительной ткани и других тканей мезенхимального происхождения, таких как мышечная, костная или сосудистая. Тератомами называют многокомпонентные опухоли из незрелых тканевых закладок. Эти опухоли встречаются в яичках, яичниках и средостении [Налескина, 2003].

Для обозначения выраженности дифференцировки опухоли используют четырехстепенную оценку злокачественности. Вид клеток, их ядер и числа фигур митозов являются характеристиками, определяющими степень злокачественности опухоли. Наименьшая степень злокачественности — 1, наивысшая — 4. I стадия - опухоль размером до 2 см без поражения регионарных лимфоузлов. Эта стадия соответствует раннему раку для опухолей внутренних органов. II стадия - небольшая опухоль диаметром от 2 до 5 см без метастазов в регионарных лимфоузлах (стадия II А) или с метастазами в единичных подвижных регионарных лимфатических узлах (стадия II Б). III стадия - опухоль размером более 5 см, прорастающая в окружающие ткани, с ограниченной подвижностью или меньших размеров с метастазами в регионарных лимфоузлах в виде конгломерата. IV стадия - опухоль любого размера с отдаленными метастазами или с глубоким прорастанием в соседние органы и ткани.

Применяется также единая международная классификация с использованием трех букв Т, N, М, определяющих размер опухоли (Т - tumor), состояние регионарных лимфатических узлов (N - nodulus) и отдаленное метастазирование (М - metastasis). Четыре стадии опухоли обозначают: Ть Тг, Т3, Т4. Состояние регионарных лимфатических узлов: N0 - не увеличены, Ni -имеется единичный метастатический узел, N2 имеется группа увеличенных лимфатических узлов, спаянных между собой, смещаемых по отношению к окружающим тканям. Метастазирование обозначается: М0 - метастазы не обнаружены, М] - имеются отдаленные метастазы. Например: стадия TjNoMo соответствует I стадии классификации; стадия T2NiMo - II стадии; T3N2M0 - III стадии; T4N2M0 или TJNOMJ - IV стадии заболевания [Налескина, 2003]. 1.1.3. Компетентность иммунной системы в отношении опухолей Между возникновением опухолевой трансформации и развитием клинических проявлений злокачественной опухоли проходит довольно длительный период, во время которого иммунная система противодействует трансформированным клеткам [Zhong et al., 2003]. Концепция иммунологического надзора активно развивается в последние годы. Она основана на гипотезе о спонтанных мутациях. Смысл иммунного надзора состоит в распознавании чужеродных антигенов опухолевой клетки и в формировании иммунного ответа, направленного на уничтожение этой клетки [Rosen et al., 2000; Adam et al., 2003; Wu, 2001]. Иммуносупрессия, вызванная у лабораторных животных ионизирующим облучением, удалением вилочковой железы у новорожденных или стероидной терапией, усиливает частоту возникновения и скорость роста опухолей. Показано, что у людей по мере старения частота появления злокачественных опухолей увеличивается, тогда как иммунитет снижается. У лиц с врожденным иммунным дефицитом частота возникновения рака в 10 000 раз выше, чем у лиц того же возраста в целом в популяции. Имеются клинические наблюдения, свидетельствующие об активном противодействии развитию злокачественной опухоли со стороны иммунной системы: спонтанная регрессия уже развившихся опухолей — это редкий, но документально фиксированный феномен. Чаще всего он отмечался при нейробластоме, злокачественной меланоме и аденокарциноме почки [Лакота и др., 2003].

Противоопухолевый иммунитет представляет собой систему, которая включает в себя две линии защиты с характерными функциями и свойствами: 1) природный (естественный, неспецифический) иммунитет реагирует на присутствие в организме чужеродного начала, в том числе измененных (мутировавших) клеток, которые являются потенциальными очагами развития опухоли; 2) адаптивный (специфический) иммунитет служит для реализации иммунного ответа путем формирования популяции (клона) лимфоидных клеток, направленных на борьбу с развивающейся опухолью [de Visser et al., 2006]. Характерными свойствами адаптивного иммунитета является наличие иммунологической памяти к конкретному опухолевому фактору (антигену) и способность распознавать этот фактор (т. е. специфичность), в результате чего формируется и поддерживается иммунный ответ, в конечном счете приводящий к разрушению нетипичных для организма клеток [Roitt et al., 2001].

Изоляция перитонеалъных нейтрофилов мыши

Уровень продукции активных форм кислорода (АФК) клетками оценивали методом хемилюминесцентного анализа с использованием люминола. Измерения проводили на хемилюминометре ХЕМИЛЮМ-12, который разработан в ИБК РАН ведущим инженером Б.Ф. Санталовым. Регистрация и обработка данных производилась при помощи пакета программ, написанных А.А. Гриневичем, н. сотр. ИБК РАН. Сигнал регистрировали последовательно от 12 ячеек с интервалом 2,5 с при 37С.

Измерение хемилюминесценции цельной крови

Подготовка опсонизированного зимозана: собирали плазму крови от 10 мышей, взвешивали необходимое количество зимозана для приготовления суспензии с концентрацией 5 мг/мл. Смешивали суспензию зимозана и плазму в пропорции 1:1 по объему и инкубировали при перемешивании в течение 30 мин при 37С. Осаждали, отмывали, тщательно ресуспендировали. Разливали по эппендорфам в исходной концентрации. Хранили опсонизированный зимозан (03) при -20С. 20 цл разведенной крови добавляли в измерительную ячейку с рабочим объемом 200 цл. Среда для измерений содержала полную среду Хенкса с добавлением люминола 0,35 мМ. Готовили 3 пробы крови каждого животного. В одной из них регистрировали уровень спонтанной хемилюминесценции, в двух других - уровень хемилюминесценции, активированной опсонизированным зимозаном (0,25 мг/мл).

Измерение хемилюминесценции изолированных клеток

Суспензию клеток распределяли по измерительным ячейкам с общим рабочим объемом 200 мкл, плотность клеток ячейке составляла 10 клеток/мл. Регистрацию хемилюминесценции проводили в среде следующего состава (мМ): NaCl - 138, КС1 - 6, MgS04 - 1, СаС12 - 1, Na2HP04 - 1, NaHC03 - 5, D-глюкоза - 5,5, HEPES - 10, люминол - 0,35, пероксидаза хрена 3 ед/мл, азид натрия 0,1 мМ, рН 7,4. Интактные клетки и клетки, обработанные одним из ингибиторов, инкубировали в течение 20 мин при 37С. Использовали: 5 мкМ терт-бутоксикарбонил-Мет-Лей-Фен (t-boc-MLF) - антагонист рецепторов ФМЛФ с высоким сродством; 1 мкМ GF109203X, специфический ингибитор ПКС; 5 мкМ тирфостин 51, ингибитор тирозиновых протеинкиназ; 1 мкМ SB 203580, специфический ингибитор митоген-активируемой протеинкиназы с молекулярной массой 38 кДа (р38 МАРК); 50 мкМ LY 294002 и 0,1 мкМ вортманнин, ингибиторы фосфатидилинозит 3-киназы (ФИ-З-К), 1 мкМ ортованадат натрия, ингибитор тирозиновых протеинфосфатаз; 1 ед/мл каталазу; 0,5 ед/мл супероксиддисмутазу (СОД); 1 мкМ дифенилиод, ингибитор NADPH оксидазы; 1 мкМ ротенон, ингибитор дыхательной цепи митохондрий; 1 мкМ гистидин и 0.45 % этиловый спирт, перехватчики синглетного кислорода и радикала гидроксила, соответственно. Записывали базовый уровень хемилюминесценции в течение 2 мин, затем клетки активировали 0,1-50 мкМ ФМЛФ и продолжали запись в течение 5 мин. Параллельно регистрировали хемилюминесценцию от проб с интактными и обработанными ингибитором клетками.

Для идентификации и анализа морфологии нейтрофилов использовали флуоресцентную и конфокальную микроскопию.

Препараты клеток окрашивали витальным красителем - акридиновым оранжевым (АО) и анализировали с помощью флуоресцентного микроскопа «Люма И-3» («ЛОМО», Ленинград, СССР; окулярх 15, объектив х40.

Для анализа клеток методом конфокальной микроскопии (лазерный сканирующий микроскоп LSM-510 на базе микроскопа Axioplan 2, масляно-иммерсионный объектив Plan-Apochromat-63 х/1.4 Oil, Zeiss) использовали флуорохром акридиновый оранжевый (концентрация - ЗхЮ"5 г/мл). Препараты фиксировали по методу Карнуа, окрашивали АО в течение 10 мин. Флуоресценцию возбуждали на длине волны 488 нм при помощи аргонового лазера. Эмиссионное излучение регистрировали с помощью фильтра 500-550 нм. Анализ изображений проводили с помощью программного обеспечения LSM 5 Image Browser.

Гистологический анализ срезов задней конечности и легких в динамике роста опухоли был проведен совместно с Амелиной С.Е., научным сотрудником лаборатории механизмов клеточной рецепции ИБК РАН. Для гистологических исследований препараты лап животных и легкие помещали в фиксирующий раствор содержащий 4 % параформальдегид и 0,25% глутаральдегид, и выдерживали более 6 часов. Декальцинацию проводили с использованием раствора 5-10% ЭДТА (рН 6,5-7,5) в течение четырнадцати дней с ежедневной сменой раствора. Для получения парафиновых срезов выделенные препараты ткани обезвоживали в спиртах возрастающей концентрации: 40%, 60% и 70% по 1 часу; 80%, 96%, 100% (2 раза) по 1 ч в термостате при 37С; затем в смеси спирт: ксилол (1:1) в течение 1 ч при 37С; в ксилоле - 12 ч при комнатной температуре; после чего образцы заливали в парафин. Блоки резали на микротоме, толщина срезов 5-10 мкм. Образцы монтировали на стекла с адгезивным покрытием и высушивали. Депарафинирование производили путем последовательной проводки препарата через ксилол (100%) и этиловый спирт (100%, 80%, 70%, 50%, 40%). Окрашивали срезы гематоксилином и эозином. После окрашивания и просветления в ксилоле срезы заключали в монтирующую среду Histofluid. Исследования проводили на световом микроскопе OLYMPUS СХ41, срезы фотографировали с помощью цифрового фотоаппарата OLIMPUS SP-500 UZ и затем изображения обрабатывали на компьютере в программе Photoshop.

Популяционный состав клеток крови

Спонтанный уровень продукции АФК клетками цельной крови увеличивался в период до 19-х суток, после 23-х суток наблюдалась тенденция к снижению (Таблица 2). Таблица 2. Изменение уровня спонтанной и активированной 0,25 мг/мл опсонизированным зимозаном (03) продукции АФК клетками нефракционированной крови. Параметр Время, сутки 7 12 19 23

Спонтанный уровень продукции АФК (усл. ед.) 0.12±0.04 0.20±0.04 0.25±0.06 0.43±0.14 0.30±0.07 Максимальная амплитуда ответа на 03 0,35±0,06 2,35±0,40 5,70±0,70 8,63±1,50 8,80±1,69 (усл. ед.) Поимечание: - D 0.0I I -D 0.0 0/.п=1О В группе животных, которым инъецировали физиологический раствор, не наблюдалось достоверного повышения продукции АФК клетками цельной крови: увеличение от 0,12 ± 0,03 до 0,13 ± 0,07 на 12-е сутки после инъекции и понижение до 0,08 ± 0,05 после 23-х суток (Рис. 9 Б).

Уровень активированной 0,25 мг/мл опсонизированным зимозаном продукции АФК клетками крови мышей с опухолью значительно возрастал на седьмые сутки и далее увеличивался (Таблица 2, Рис. 9 А, Б). и о

Изменение продукции АФК клетками периферической крови. А -продукция АФК в цельной крови контрольных животных (1), животных на 7-й (2), 12-й (3) and 19-е (4) сутки после инъекции клеток LLC. Показаны уровень спонтанной продукции АФК и активированной 0,25 мг/мл 03, оцененные по люминол-зависимой хемилюминесценции. Стрелка указывает момент добавления 0,25 мг/мл ОЗ. Б - изменение продукция АФК в ответ на опсонизированный зимозан в зависимости от времени после инъекции физиологического раствора (1) или клеток LLC (2). -р 0,001; п=20.

Так как основной вклад в продукцию АФК клетками крови вносят нейтрофилы, далее мы исследовали изменение функциональной активности нейтрофилов по мере роста опухоли в организме.

Анализклеток, изолированных из очага острого воспаления Свою функциональную активность нейтрофилы наиболее ярко проявляют при протекании воспалительной реакции, они являются ее главными участниками. У мышей с опухолью острая воспалительная реакция имела некоторые особенности: в брюшную полость поступало значительно большее количество вызванных нейтрофилов, которое градуально возрастало и достоверно отличалось от контроля на 12-й, 19-й и 23-й день после инъекции клеток LLC (Рис. 10).

Количество нейтрофилов, выделенных из очага острого воспаления, контрольных животных и животных с солидной опухолью. -р 0,001 ;п=20. Время, сутки

В суспензии изолированных перитонеальных клеток контрольных мышей кроме гранулоцитов присутствовали большие зернистые лимфоциты (около 3,6%), тучные клетки (1,4%) и небольшое количество дендритных клеток (0,2%), тогда как в случае мышей с опухолью обнаруживались большие зернистые лимфоциты (около 0,7%), тучные клетки (0,75%) и дендритные клетки (примерно 3%). 3.4. Морфологические изменения нейтрофилов

Морфология нейтрофилов у животных с опухолью была изменена: они имели больший размер, увеличенное ядро с повышенной сегментацией и более выраженную зернистость цитоплазмы (Рис. И). Диаметр клеток возрастал от 7,4±0,6 мкм (контрольные животные) до 13,1±0,9 мкм на 23 сутки после инъекции опухолевых клеток (р 0,001; п=30). На рис. 11 представлены фотографии нейтрофилов изолированные из перитонеальной полости животных с растущей опухолью.

Перитонеальные вызванные нейтрофилы мышей. А - нейтрофилы контрольных мышей (1) и мышей с солидной опухолью на 12-й день после трансплантации клеток LLC (2). Показаны ядра клеток (зеленый цвет) и зернистость цитоплазмы вокруг ядра (красный цвет). Краситель - акридиновый оранжевый, прижизненная окраска. Масштаб - 2,2 мкм. Б - конфокальная микроскопия нейтрофилов контрольных мышей (1) и мышей с солидной опухолью на 3-й (2), 9-е (3), 15-е (4), 23-и (5) и 26-е (6) сутки после трансплантации клеток LLC. диаметра перитонеальных вызванных нейтрофилов у животных по мере роста

Таким образом, количество привлеченных в перитонеальную полость нейтрофилов и их размер изменялись при росте опухоли. Мы предположили, что функциональная активность нейтрофилов при этом также будет изменяться. 3.5. Функциональные изменения нейтрофилов

Нсйтрофилы реализуют свою функциональную активность, мигрируя в очаг воспаления по градиенту хемотаксических факторов. 3.5.1. Оценка адгезивных свойств

Экспрессия адгезивных белков (селектинов, интегринов) на поверхности нейтрофила обеспечивает его взаимодействие с окружающими клетками (клетками эндотелия сосудов, клетками межклеточного матрикса) и определяет способность к миграции в очаг воспаления, где нейтрофилы реализуют свой цитотоксический потенциал, включая генерацию АФК.

Мы оценили адгезивные свойства нейтрофилов по их способности прилипать к пластику. Получено, что на ранних этапах роста опухоли (3-9 сутки) наблюдалось угнетение, затем постепенное усиление адгезивных свойств (Рис. 13).

Изменение адгезивных свойств перитонеальных нейтрофилов мышей при росте опухоли. Рассчитано количество клеток, прилипших к пластику, полученных от животных с опухолью, по отношению к таковому контрольных животных, принятому за 100%.

Время, сутки 3.5.2. Продукция АФК периферическими нейтрафилами мыши Как правило, способность клеток генерировать АФК оценивается по уровню продукции АФК покоящимися (спонтанный уровень) и активированными клетками.

Спонтанная продукция АФК Уровень спонтанной продукции АФК был существенно повышен в нейтрофилах животных с опухолью, в то время как, в нейтрофилах животных с инъекцией физиологического раствора или инактивированных митомицином С клеток LLC он практически не изменялся. Можно видеть, что этот параметр возрастал по мере развития опухоли до 19-го дня и достоверно отличался от контрольного уровня уже на седьмые сутки после трансплантации опухолевых клеток, а на 23-и сутки наблюдалось понижение (Рис. 14).

Оценка вклада рецепторов ФМЛФ с разным сродством в инициацию респираторного взрыва

В случае АКЭ, ингибиторы киназ, участвующих в передаче сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу, подавляли базовый уровень продукции АФК, причем эффекты всех ингибиторов, кроме SB 203580, были слабее в нейтрофилах животных-опухоленосителей. Ингибирующий эффект вортманнина и SB 203580 на респираторный взрыв нейтрофилов животных с АКЭ изменялся на противоположный [Мальцева и др., 2006].

Таким образом, характер изменений уровня спонтанной и активированной 03 продукции АФК клетками крови, параметров воспалительной реакции (количество нейтрофилов, размер) имеет общие закономерности при развитии исследуемых опухолей. В то время как, динамика изменения продукции АФК изолированными нейтрофилами имеет характерные особенности в разных типах опухолей. По мере роста опухоли происходит изменение воспалительной реакции, параметров продукции АФК и действия ингибиторов киназ в зависимости от продолжительности роста опухоли. Наиболее чувствительными к растущей в организме животного опухоли являются р38 МАРК и ФИ-З-К, роль которых в регуляции оксидазной активности нейтрофилов меняется в зависимости от продолжительности роста опухоли.

Наблюдение свойств периферических нейтрофилов в динамике при росте опухоли в организме показало изменение их функциональной активности. Основными закономерностями, мы считаем: 1) при развитии солидной опухоли происходят значительные изменения параметров воспалительной реакции, выражающиеся в изменении количества нейтрофилов, привлекаемых в очаг воспаления (Рис. 10), изменении морфологии периферических по отношению к опухоли клеток (Рис. 11, 12); 2) рост опухоли сопровождается изменением адгезивных свойств нейтрофилов (Рис. 13); 3) наблюдается повышение интенсивности генерации АФК нейтрофилами в отсутствии активации (Рис. 14); 4) происходят изменения активированного ФМЛФ респираторного взрыва: на ранних сроках опухоли наблюдается тенденция к снижению, затем интенсивность усиливается, на поздних сроках снижается (Рис. 15, 16); 5) изменяется вклад отдельных активных форм кислорода в спонтанную и активированную ФМЛФ продукцию АФК (Рис. 17, табл. 3); 6) наблюдается зависимое от фазы роста опухоли изменение соотношения высоко- и низкоаффинных рецепторов ФМЛФ в активации респираторного взрыва (Рис. 18); 7) действия ингибиторов протеинкиназ, тирозиновых протеинфосфатаз и ФИ-З-К, участвующих в проведении сигнала с рецептора ФМЛФ на NADPH оксидазу, изменены в нейтрофилах животных с опухолью (Рис. 19-23); 8) изменяется количество (Рис. 25) и спектр цитоплазматических и ядерных белков (Рис. 26); 9) в определенной степени выявленные закономерности относятся к росту солидных опухолей из клеток LLC, АКЭ, WEHI 164, NSO, J 774 (Рис. 27-29, табл. 4). Мы не наблюдали описываемых нами изменений при введении животным физиологического раствора или апоптических клеток опухоли после предварительной инкубации с митомицином С (Рис. 16).

Увеличение количества мигрировавших в перитонеальную полость нейтрофилов может быть вызвано несколькими причинами: возрастанием общего числа нейтрофилов в крови [Asian et al., 1998]; усилением способности клеток к адгезии и миграции [Chuluyan et al., 2000]; увеличением продолжительности их жизни [Ishikawa, Miyazaki, 2005]. Нейтрофилез при опухолях считается следствием увеличения количества клеток-предшественников гранулоцит-макрофагального ряда в костном мозге [Watari et al., 2000]. В последнее время активно обсуждается концепция, согласно которой развитию опухоли способствует хроническое воспаление, сопровождающееся увеличением уровня провоспалительных и регуляторных цитокинов (ФНО-а, ИНФ-у, ИЛ-1, -2, -4) [Di Carlo et al., 2001; de Visser et al., 2006; Shankar, 2006]. Последствия повышенного уровня и постоянного воздействия цитокинов на нейтрофилы разнообразны. Так, подавляется вхождение нейтрофилов в апоптоз, что удлиняет время их жизни [Wislez et al., 2001; Ishikawa, Miyazaki, 2005]. Праймирование цитокинами приводит к усиленной экспрессии на цитоплазматической мембране адгезивных молекул, участвующих во взаимодействии с эндотелием сосудов и межтканевым матриксом, что повышает способность нейтрофилов к миграции в очаг воспаления [Chuluyan et al., 2000]. У больных с хронической лейкемией показано увеличение экспрессии L-селектина на нейтрофилах, что может быть следствием высокого уровня ФНО-а в сыворотке крови [Kiersnowska-Rogowska et al., 2006]. Наблюдаемое нами усиление адгезивных свойств нейтрофилов при развитии опухоли (Рис. 13) согласуется с упомянутыми литературными данными. Активация миграции опухолевых клеток происходит с участием тех же интегринов, что нейтрофилов [Chuluyan et al., 2000]. Клетки опухоли выделяют хемокин СХС, который стимулирует экспрессию интегрина Pi, активирует миграцию нейтрофилов и самих клеток опухоли [Reiland et al., 1999; Adam et al., 2003].

Остается не вполне ясным, за счет чего увеличивается размер клеток (Рис. 11, 12). Возможно, в клетках активируются процессы экспрессии генов и синтез белка. С использованием циклогексимида, ингибитора синтеза цитоплазматических белков на 80 S рибосомах [Досон, 1991], мы обнаружили его динамическое изменение эффекта на продукцию АФК (Рис. 24), что подтверждает наше предположение. Следовательно, в клетках животных с опухолью изменяется синтез белков, что может сказываться на их функциональной активности, в том числе регуляции респираторного взрыва. Оценка количества цитоплазматических и ядерных белков показала его увеличение по мере роста опухоли (Рис. 25). Кроме того, изменился спектр ядерных и цитоплазматических белков (Рис. 26), многие из которых не присутствуют у контрольных животных. В настоящее время мы затрудняемся указать, экспрессия каких генов привела к усиленному синтезу белков, индивидуальный тип которых также предстоит определить. В литературе нет исследований такого рода на периферических иммунных клетках. Нами была найдена лишь одна работа, в которой показано, что в нейтрофилах пациентов с хроническим воспалением (Behcet s болезнь) была обнаружена фракция белков с молекулярной массой 40 кДа, которая отсутствовала у здоровых добровольцев. Анализ N-терминальной последовательности показал, что данный белок - это фрагмент актина [Yamashita et al., 2000]. Идентификация генов и белков представляется перспективной для дальнейших исследований трансформации иммунных реакций при развитии опухоли.

Похожие диссертации на Респираторный взрыв и особенности его регуляции в периферических нейтрофилах при росте опухоли in vivo

Исследование особенностей элементарного механохимического процесса и его регуляции в мышце Сонькин Борис Яковлевич

Особенности функционирования физико-химической системы регуляции перекисного окисления липидов в биологических объектах разной степени сложности в норме и при действии повреждающих факторов Шишкина Людмила Николаевна

Сезонные особенности ритмоинотропных отношений сердца зимнеспящих и роль инсулина в их регуляции Чумаева Надежда Анатольевна

Моделирование роста и прогрессии опухоли с учетом ее пролиферативной и пространственной гетерогенностиКолобов Андрей Владимирович

Характеристика новых линий репортерных мышей для изучения экспрессии фактора некроза опухолей in vivo и in vitroКучмий, Анна Александровна

Особенности регуляции сердечного ритма в постреперфузионном периодеБугрова Марина Леонидовна

Особенности регуляции экспрессии оперона микроцина C51 в клетках Escherichia COLI Веселовский Александр Михайлович

Изучение особенностей регуляции активности генов и контроля времени их репликации в домене альфа-глобиновых генов курКлочков Денис Борисович

Особенности регуляции звеньев респираторно-гемодинамической системы у детей младшего школьного возрастаКузнецова Ольга Валерьевна

Особенности регуляции цитокининами экспрессии генов первичного ответа Ракова Наталья Юрьевна