Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Эритропоэтическая функция организма и стресс: экологические аспекты 11
1.1. Кроветворение и стресс 11
1.2. Организм и гипоксия 22
1.3. Микроэлементы и физиология. Роль кобальта 30
1.3.1. Особенности химии кобальта и его соединений 30
1.3.2. Биологическая функция кобальта 31
1.3.3. Кобальт и эритроидное кроветворение 34
1.3.4. Кобальт и гипоксия
Глава 2. Материалы и методы 39
2.1. Оценка показателей кроветворения 39
2.2. Измерение потребления кислорода 40
2.3. Исследование токсического действия хлорида кобальта 42
2.4. Управляемая перфузия изолированного кроветворного органа 43
2.5. Исследование на культурах клеток 45
2.6. Исследование возможного механизма 46 чувствительности клеток к избытку кобальта
Глава 3. Реакция организма млекопитающих на введение хлорида кобальта (результаты исследования) 47
3.1. Эритроидное кроветворение у крыс в первые 6 часов после воздействия хлорида кобальта 48
3.2. Кроветворение у мышей в первые три часа после введения хлорида кобальта 53
3.3. Изменение потребления кислорода у крыс в ответ на введение хлорида кобальта 56
3.4. Токсическое влияние хлорида кобальта на организм в эксперименте на мышах 58
3.5. Управляемая перфузия изолированного костного мозга собаки 63
3.6. Влияние хлорида кобальта на пролиферативную активность клеток в культуре 66
3.7. Исследование внутриклеточных механизмов реакции организма на избыточное введение кобальта ab initio методом квантовой химии 73
Глава 4. Обсуждение результатов 77
Выводы 94
Список литературы 95
- Организм и гипоксия
- Микроэлементы и физиология. Роль кобальта
- Измерение потребления кислорода
- Кроветворение у мышей в первые три часа после введения хлорида кобальта
Организм и гипоксия
Ключевым стимулирующим эритроидное кроветворение воздействием является гипоксия, т.е. недостаточная по тем или иным причинам доступность кислорода для метаболизма клеток организма.
Адекватная доставка кислорода клеткам очень важна для всех аэробных организмов по двум причинам: потому что он служит терминальным акцептором электронов при окислительном фосфорилировании и потому что в ряде ферментативных процессов молекулярный кислород выступает в роли субстрата. Механизмы чувствительности клеток к недостатку кислорода исследуются достаточно давно, поиски «кислородного сенсора» ведутся достаточно интенсивно. И только в последние несколько лет усилиями нескольких исследовательских групп были выяснены, с одной стороны, тонкие и сложные, а с другой - универсальные молекулярные и клеточные механизмы реакции клеток в организме на нехватку кислорода и определены кандидаты на роль «сенсора».
Первоначально исследовались механизмы влияния гипоксии на продукцию эритропоэтина, специфического фактора роста эритроидных клеток. Хорошо известно, что основными органами, продуцирующими в организме взрослого млекопитающего этот фактор, являются печень и почка. Удобной моделью для исследования закономерностей индукции гипоксией экспрессии гена эритропоэтина in vitro оказались культуры клеток гепатобластомы человека НерЗВ и HepG2 [57]. Результаты исследований на этих линиях клеток позволили выдвинуть гипотезу т.н. «гемопротеинового сенсора кислорода» [58, 59]. Согласно представлениям авторов гипотезы, роль кислородного сенсора в клетках (в данном случае клетках гепатобластомы) играет молекула гемопро-теина, конформация которой зависит от напряжения кислорода в среде, в которой находятся эритропоэтин-продуцирующие клетки. Если напряжение кислорода низко, гемопротеин переходит в дезокси-конформацию и тем самым запускает цепь молекулярных событий, в конце концов приводящих к экспрессии гена эритропоэтина. В условиях достаточно высокого напряжения кислорода молекула гемопротеина находится в неактивной окси-конформации и на стимулирует продукцию эритропоэтина. Существенным оказалось то, что хлорид кобальта, известный стимулятор эритропоэза вообще и продукции эритропоэтина в частности (а также, хотя и в меньшей степени, хлористые соли других переходных металлов, никеля и марганца) в рамках этой гипотезы действует через сходные механизмы: атом кобальта вытесняет атом железа из гема сенсорной молекулы и занимает его место, что приводит к «запиранию» гемопротеина в активной дезокси-конформации и экспрессии гена эритропоэтина, как и в условиях низкого напряжения кислорода в тканях. В пользу существования гем-содержащего сенсора свидетельствуют также данные по индукции гена эритропоэтина хелатирующим железо соединением десферриок-самином [60 - 62]. Недавно такая возможность была теоретически подтверждена ab initio исследованием, которое показало, что пространственной кон-формации дезоксиформы (FeP+H20) гема гемоглобина может соответствовать оксиформа (СоР+Ог) кобальтогема [63] (подробно в главе 3). Гем-содержащий белок - не единственный кандидат на роль «сенсора кислорода». Другие возможности будут рассмотрены далее.
После того, как сигнал о понижении концентрации кислорода в окружающей клетки среде принят, в клетке начинается цепь событий, ключевым из которых является связывание так называемого индуцируемого гипоксией фактора 1 (Hypoxia-inducible Factor 1, HIF-1) с z/иодействующим чувствительным к гипоксии элементом (Hypoxia-response element, HRE), являющимся частью энхансера гена эритропоэтина [64 - 69]. HIF-1 принадлежит к семейству транскрипционных факторов BHLH ( basic-helix-loop-helix) и состоит из двух субъединиц HIF-lct и HIF-lp [60, 70]. К настоящему времени установлено, что з различных клетках HIF-1 вызывает экспрессию различных белков, т. е. адаптация клеток и организма в целом к гипоксии осуществляется универсальным путем - через активацию белков HIF, являющихся транскрипционными факторами для генов, кодирующих белки, стимулирующие не только продукцию новых эритроцитов (например, эритропоэтин), но и ангиогенез, т. е. образование новых кровеносных сосудов, а также гликолиз как способ получения энергии при недостатке или отсутствии кислорода [62,71 - 75]. В частности, показано, что посредством HIF-1 при гипоксии стимулируется экспрессия генов ряда ферментов гликолиза [76 - 79], регуляторов ангиогенеза и тонуса сосудов [80- 82], трансферрина и его рецептора [83 — 85], белка, связывающегося с инсулиноподобным фактором роста [86] и некоторыми другими.
Подсчитано, что около 5% генома человека находится под контролем HIF-1 и что, кроме генов, контролирующих гликолиз и ангиогенез, мишенями HIF-1 являются также гены, регулирующие клеточный рост, деление, выживание и подвижность клеток [75].
Микроэлементы и физиология. Роль кобальта
Кобальт является типичным d-элементом, т.е. одним из так называемых главных переходных элементов, атомы которых характеризуются внутренней застройкой d-подоболочек. Так как s-орбиталь внешней электронной оболочки в соответствии с правилами заполнения уже имеет 2 электрона, каждый «новый» электрон, добавляемый в электронную оболочку очередного d-элемента, попадает не на внешнюю оболочку, а на предшествующую ей внутреннюю подоболочку. Химические свойства таких элементов обусловлены участием в реакциях электронов обеих оболочек. Электронная конфигурация кобальта с л ry fL S Ґ Т атомным номером 27 такова: Is 2s 2р 3s Зр 3d 4s . В соединениях кобальт проявляет две степени окисления: +2 (в большинстве простых соединений) и +3 (в основном, в комплексах). Характерными химическими свойствами d-элементов и их соединений являются: образование соединений внедрения, переменные состояния окисления, парамагнетизм, способность к образованию комплексных ионов, образование окрашенных соединений, каталитичекая активность. Важнейшими из свойств переходных элементов, обусловливающи-хми их уникальные биологические возможности, являются способность к ком-плексообразованию и способность к участию в окислительно-восстановительных реакциях. Атомный радиус кобальта 0.125 нм, радиус иона Со2+ - 0.82 А. Эти величины близки к соответствующим для таких металлов, как железо (0.124 нм и 0.83 А, соответственно), цинк (0.133 нм и 0.82 А, соответственно), немного меньше, чем для кальция (0.197 нм и 0.99 А, соответственно). Помимо собственных биологических эффектов, которые и представляют собой предмет исследования в данной работе, кобальт способен, в силу сходства с упомянутыми металлами, биологическую роль которых трудно переоценить, имитировать или модифицировать их действие [109-112].
Существуют определенные диапазоны концентраций, в которых микроэлементы, в том числе металлы и, в частности, кобальт, необходимы живым организмам [108, 113]. Избыток или недостаток этих элементов для организма вреден (рис. 7, цит. по [113]).
Серьезный интерес к биохимии кобальта возник около 1934 г. в связи с тяжелыми заболеваниями крупного рогатого скота и овец в самых разных уголках мира (Россия, Шотландия, Австралия, Новая Зеландия, Канада). Животные теряли массу, аппетит, становились вялыми, анемичными и в конце концов погибали. Наличие анемии наводило на мысль о причастности к этому дефицита железа. Но оказалось, что дело не в самом железе, а в присутствии в соединениях железа очень малых количеств кобальта. Добавление к корму кобальта полностью снимало все токсические симптомы [113, 114].
Кобальт как микроэлемент необходим всем живым организмам. Существует много работ, касающихся роли кобальта в физиологии растений: растения накапливают кобальт (главным образом в корнях), его содержание повышается в период роста и снижается во время цветения. Небольшие добавки кобальта приводят к значительному повышению урожая и улучшению его качества (злаки, картофель, бобовые). К пищевым продуктам с высоким содержанием кобальта относятся: свекла (особенно ботва), хлеб, гречиха, капуста, инжир, зеленый лук, грибы, груши, редис, помидоры. Кобальта в них содержится около 0.2 мг/кг. Яблоки, абрикосы, бананы, морковь, вишня, кофе, ку-хуруза, баклажаны, овес, перец, картофель, рис, злаки («0.05 мг/кг) [114].
Измерение потребления кислорода
Определение удельной объемной скорости потребления кислорода у крыс Wistar in vivo проводили с использованием специального метаболи-метра, основанного на принципе известного аппарата Шатерникова. Установка включала в себя абсорбенты СОг и обезвоживатель; кислород, потребленный животными, замещался из присоединенного кислородного резервуара. Изменения температуры в камере с животными контролировались. Схема установки представлена на рис. 8.
Предварительно, в течение двух - трех недель, крыс ежедневно помещали на 40 - 60 мин в камеру аппарата для привыкания и затем определения исходных показателей. Для того, чтобы исключить реакцию организма на стресс, вызванный самой инъекцией, животным контрольной группы вводили подкожно физиологический раствор. Скорость потребления кислорода определяли непосредственно перед инъекцией физиологического раствора, содержащего или (в контроле) не содержащего хлорид кобальта, и после инъекции (начиная через пять минут), рассчитывали ее по времени потребления 500 мл кислорода по формуле:
Для исследования токсического действия вводимой соли кобальта мышам вводили хлорид кобальта в дозе 5 мкмоль на мышь (что соответствует « 250 мкмоль/кг), после чего определяли длительность плавания животных на поверхности резервуара площадью 0.5 м при температуре 20 С (характеристика общего состояния животных) и длительность удержания на вращающемся валу (характеристика нейродефицита, [156]). Скорость вращения вала составляла 5 об/мин. Вал был разделен на камеры картонными перегородками и установлен над клетками, в которые животные попадали при падении. Нейродефицит характеризуется неспособностью животных оставаться на вращающемся валу более 1 мин [156]. После нагрузки плаванием животных помещали в коробку с ватой для согревания и приведения в нормальное состояние.
Для перфузионных экспериментов использовали 11 беспородных собак в возрасте 2 - 3 г. массой 12 - 15 кг, у которых под общим наркозом выделяли и подключали к установке для искусственного жизнеобеспечения изолированного органа «Гомеостат 2» грудную кость, содержащую красный костный мозг. Подготовка животного к эксперименту, уникальная перфузионная установка «Гомеостат» и техника операции и перфузии разработаны в Международном научном центре исследований экстремальных состояний организма при Президиуме КНЦ СО РАН (ранее Лаборатории управления биосинтезом животных тканей Института биофизики СО РАН) под руководством профессора В.П. Нефедова и подробно описаны в работе [157].
Операции проводились под общим внутривенным тиопентал-натриевым наркозом (« 10 мг/кг) с применением миорелаксантов (листенон) и управляемого интубационного эндотрахеального дыхания. Сначала производили кожный продольный разрез по серединной линии грудной клетки от яремной вырезки до мечевидного отростка грудины и отсепарировали кожные лоскуты. Затем производили поперечный разрез между нижней частью грудной клетки и верхней частью живота. После гемостаза производили два продольных разреза через реберную часть грудной клетки (в местах перехода хрящевой и костной части ребер). Приподняв грудину, лигировали внутренние грудные артерии, после чего производили полную экстирпацию грудины из организма. Затем артерии канюлировали, промывали холодным изотоническим раствором, помещали в пластиковый контейнер и подключали к искусственному кровообращению установки.
Состав перфузионной среды (на 1 л): 550 мл аутокрови, 100 мл среды 199, 350 мл полиглюкина, смесь стабилизировали гепарином (10 ед. на 1 мл). Объем заполнения смесью системы искусственного кровообращения 1 л. Перфузию проводили в условиях нормотермии (37 С) и нормоксии. Артериальное давление поддерживалось на уровне 100 - 120 мм рт.ст. Частота пульсации 60 ударов/мин, объемная скорость кровотока - 120 мл/мин. Длительность перфузии составила 6 ч. СоСЬ в концентрации 1 мкмоль/мл (при этом основывались на данных авторов работы [138]) вводили в перфузионную среду после начала перфузии. Состояние эритроидного кроветворения оценивали в исходных препаратах костного мозга животных-доноров грудины и в образцах, взятых после окончания перфузии. Для контроля проводили в тех же условиях 6-часовую перфузию грудины смесью, не содержащей кобальт.
Кроветворение у мышей в первые три часа после введения хлорида кобальта
В эксперимент отбирали здоровых мышей ICR, показатели периферической крови которых представлены в табл. 5.
В первой серии экспериментов оценивали динамику показателей периферической крови, содержание в ней ретикулоцитов, а также митотическую активность эритроидных клеток костного мозга (рис. 11, 12). Особых изменений в картине периферической крови не наблюдалось, за исключением лейкопении, максимально выраженной через 1.5 ч после воздействия. Содержание гемоглобина через 2 и 3 ч (рис. 11) было увеличено, что согласуется данными рис. 12, свидетельствующими об усилении эритроидного кроветворения. Содержание ретикулоцитов в крови и пролиферирующих клеток в костном мозге повышено уже через 0.5 ч после инъекции хлорида кобальта, в следующие сроки наблюдения содержание ретикулоцитов немного повысилось к 1 ч после введения и далее заметных изменений не претерпевало, митотическая же активность эритроидных клеток в костном мозге росла неуклонно и к трем часам после воздействия составляла почти 900 % от контроля.
Во второй серии экспериментов акцент был сделан на сравнение влияния кобальта на пролиферацию клеток белого и красного ростков. Данные представлены на рис.13. Как можно видеть из рисунка, пролиферация предшественников белых клеток несколько подавляется, в то время как митотиче-ская активность клеток красного ряда растет. В этой серии митотическая активность эритроидных клеток увеличилась к трем часам после воздействия в 6 раз (« 600 % от контроля).
Таким образом, представленные данные могут свидетельствовать о том, что при поступлении в организм животного хлорида кобальта в дозе, многократно превышающей физиологически необходимую, ответная реакция непосредственно со стороны кроветворения разворачивается уже в первые три часа после воздействия.
Одним из предположений об изменениях, вызываемых хлоридом кобальта на уровне целого организма, является то, что его введение в избыточных количествах приводит к так называемой гистотоксической гипоксии, т.е. к снижению потребления кислорода тканями организма при нормальной его доставке к ним.
