Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Структура, свойства и применение индоцианина зеленого 12
1.1. Цианиновые красители 12
1.2. Индоцианин зеленый 20
1.3. Закономерности агрегации и дезагрегации индоцианина зеленого 23
1.4. Применение индоцианина зеленого в медицине 30
Глава 2. Взаимодействие молекул органического красителя индоцианина зеленого с различными типами растворителей 42
2.1 Методика проведения эксперимента и полученные результаты 43
2.2. Анализ полученных результатов 47
2.2.1. Влияние состава растворителя и концентрации красителя 48
2.2.2. Влияние полярности растворителя 51
2.2.3. Связь положения полос поглощения с показателем преломления растворителя 59
2.2.4. Сдвиги полос электронных спектров согласно теории межмолекулярных взаимодействий 64
2.3. Влияние присутствия соли на поведение водных растворов индоцианина зеленого 69
Глава 3. Взаимодействие индоцианина зеленого с биологическими объектами и макромолекулами 77
3.1. Исследования in vivo и in vitro взаимодействия красителя индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека 78
3.2. Взаимодействие индоцианина зеленого с веществом волос человека и шерсти домашних животных 86
3.3. Спектральные исследования взаимодействия органического красителя индоцианина зеленого и меланина 92
3.4. Взаимодействие индоцианина зеленого с биообъектами на примере плазмы крови человека 105
Глава 4. Исследование процессов переноса красителя в биологический объект 118
4.1. Трансдермальные терапевтические системы 119
4.1.1. Модели ТТС 122
4.2. Применение хроматографических методов в исследовании спектральных характеристик взаимодействия индоцианина зеленого с биологическими образцами 124
4.2.1. Физико-химические основы тонкослойной хроматографии 124
4.3. Экспериментальное определение степени диффузии индоцианина зеленого методом хроматографии 134
Литература 146
- Закономерности агрегации и дезагрегации индоцианина зеленого
- Влияние состава растворителя и концентрации красителя
- Взаимодействие индоцианина зеленого с веществом волос человека и шерсти домашних животных
- Применение хроматографических методов в исследовании спектральных характеристик взаимодействия индоцианина зеленого с биологическими образцами
Введение к работе
Актуальность темы диссертационной работы
В качестве одного из типов оптических индикаторов при диагностике заболеваний в медицинской практике широкое применение нашли органические красители. Одним из таких красителей является индоцианин зеленый (indocyanine green, ICG). ICG, применяемый в фотодинамической терапии [1- ,4, 5], в настоящее время активно используется в самых различных областях медицины: онкологии [6], диагностике [7], хирургии [8, 9], офтальмологии [10, 11, 12]; а так же при определении объема крови [13], исследовании функции печени [14, 15], ангиографии [16, 17, 18, 19] флуоресцентных исследованиях ферментов и протеинов [20, 21] косметологии и др.
Биофизические исследования повсеместно используются при изучении механизмов возникновения болезней человека, разработке новых лекарственных средств, методов лечения и диагностики, а также при создании современной медицинской техники.
Изучение физико-химической основы биологических явлений, протекающих на молекулярном уровне, стало возможным благодаря успехам физики и физической химии в конце 19 - начале 20 в. По мере совершенствования методов физико-химических исследований возможности биофизики значительно расширялись. Интенсивному развитию науки способствовало появление новых физических методов - рентгеноструктурного анализа, радиоспектроскопии, спектрофотометрии и спектрофлуориметрии, электрометрии, оптических измерений, методов, основанных на ядерном магнитном резонансе (ЯМР) и др., а также компьютерной техники. Изучение явления ЯМР и распространения ультразвуковых волн в тканях с применением компьютерной техники привело к созданию новых, перспективных методов диагностики - ЯМР и ультразвуковой томографии. Разрабатываются методы автоматической расшифровки ЭКГ, изучения магнитных полей человека, современные методы лабораторной диагностики, основанные на измерении люминесценции, хемилюминесценции, светорассеяния. Создаются новые аппараты для физиотерапии и диагностики
заболеваний, основанные на действии колебаний сверхвысокой частоты в различных диапазонах частот, УФ-излучения в сочетании с хемотерапией; лазерного излучения с различными длинами волн и др.
Внедрение органического красителя индоцианина зеленого в медицинскую практику обусловлено близостью его спектральных положений максимума полосы поглощения и изобестической точки для поглощения гемоглобина и оксигемоглобина в районе 800 нм, что позволяет использовать его для оценки объема крови [22]. Важным является также предполагаемая низкая токсичность и быстрое выведение красителя из организма (ICG выводится из плазмы почти исключительно паренхиматозными клетками печени и выделяется полностью в желчь) [5].
ICG может вступать во взаимодействие с компонентами биологических тканей и крови. Одним из проявлений такого взаимодействия является смещение положения максимума полосы поглощения красителя. Например, при связывании с альбумином крови происходит смещение в длинноволновую область до 805 нм [23, 24]. Однако изменения спектров поглощения ICG, вызванные его взаимодействием с биологическими тканями при их окрашивании, в настоящее время исследованы недостаточно.
В спектрах поглощения ICG наблюдаются две полосы поглощения, при этом длинноволновая полоса соответствует поглощению мономера, коротковолновая -димера красителя. В водных растворах красителя димеризация наблюдается уже при концентрациях 1><10~7 моль/см3 [5, 25]. При высоких концентрациях зависимость эффективности поглощения света красителем от его концентрации нелинейная, т.к. при больших концентрациях в воде краситель имеет тенденцию к агрегации в крупные частицы как в водных растворах [26], так и в плазме человека [27]. Более того, интенсивность и положение полос поглощения ICG зависят от используемых растворителей.
При использовании ICG часто применяются растворы сложного состава: не просто раствор ICG, например, в воде, а с добавлением различных веществ. Например, при использовании в лазерной хирургии с целью увеличения поглощения лазерного излучения, а также вязкости, в раствор могут добавляться:
альбумин, желатин, гиалуроновая кислота [28]. При использовании в косметологии использовался специальный лосьон, в состав которого входят вода, ICG, спирт, глицерин и DMSO [29]. В данном случае добавки вводились с целью увеличения глубины прокрашиваемого слоя кожи. Используемые растворы имеют спектральные характеристики, отличные от характеристик чистых растворов ICG. В то же время исследования эффективности воздействия светового (лазерного) излучения на объект чаще всего проводятся одновременно с оценкой интенсивности и положения полос поглощения ICG как в растворе, так и в исследуемом объекте. Такие оценки обуславливают необходимость изучения поведения спектров растворов ICG при смене растворителя или же изменении концентрации красителя с последующим исследованием взаимодействия применяемого раствора с биологическим объектом. Таким образом, возникает необходимость исследования зависимости спектральных характеристик красителя от его окружения.
Цель работы
Основной целью настоящей диссертационной работы являются in vivo и in vitro исследования процессов взаимодействия органического красителя индоцианина зеленого с биологическими объектами и составляющими их молекулами методами спектрофотометрии и хроматографии.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд промежуточных задач:
- исследовать закономерности изменения спектров поглощения растворов
индоцианина зеленого в зависимости от метода приготовления раствора:
используемого растворителя или смеси растворителей, а также концентрации
красителя и метода окрашивания;
исследовать поведение красителя в физиологическом растворе и водно-солевых растворах с разными концентрациями;
выявить причины изменения спектров поглощения ICG при его взаимодействии с молекулярными компонентами волос или эпидермиса кожи человека при их окрашивании in vivo или in vitro;
- определить основной механизм, обусловливающий окрашивание поверхностных
слоев эпидермиса человека органическим красителем индоцианином зеленым;
- исследовать эффективность окрашивания волос человека раствором
индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного цвета,
продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов;
установить влияние взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови человека на процесс ее кристаллизации;
решить вопрос о безопасности растворов индоцианина зеленого для живых организмов;
экспериментально определить эффективность диффузии красителя в различных материалах хроматографическими методами.
Научная новизна
Научная новизна определяется комплексом впервые выполненных исследований и полученных результатов, которые сводятся к следующему:
с целью выяснения механизмов взаимодействия молекул органического красителя индоцианина зеленого с различными типами растворителей были получены новые экспериментальные данные о зависимости смещения максимума полосы поглощения от состава растворителя, концентрации красителя, полярности раствора; наличия или отсутствия зависимости положения полос поглощения и показателя преломления растворителя; влияние присутствия соли на поведение водных растворов индоцианина зеленого;
с целью уточнения процессов взаимодействия индоцианина зеленого с биологическими объектами и макромолекулами проведены исследования и получены результаты взаимодействия молекул красителя со следующими биообъектами: поверхностными слоями эпидермиса, волосами, плазмой и сывороткой крови человека; и их макромолекулами - кератином кожи и волос, меланином, альбумином;
получены данные об эффективности проникновения молекул красителя индоцианина зеленого внутрь ткани биообъекта в зависимости от природы
биообъекта, состояния взаимодействующей поверхности, применяемого растворителя.
Практическая значимость результатов
Полученные результаты могут найти применение при разработке методов диагностики и лечения заболеваний человека как при использовании индоцианина зеленого, так и, имея в виду полученные закономерности, других красителей. Кроме того, материалы работы могут быть использованы в учебном процессе.
Достоверность результатов
Достоверность результатов представленных в данной работе экспериментов подтверждается их воспроизводимостью, сопоставлением с экспериментальными и теоретическими данными, опубликованными другими исследователями, использованием стандартных методик регистрации спектральных характеристик исследуемых образцов, а также учетом систематических и случайных погрешностей.
Основные положения и результаты, выносимые на защиту
Растворимость индоцианина зеленого в физиологическом растворе резко снижается по сравнению с растворимостью в воде, что приводит к агрегации красителя и выпадению осадка при концентрациях от 0.01 до 1 мг/мл.
Спектральные характеристики окрашенной ткани зависят от взаимодействия красителя с данной тканью и не зависят от используемого растворителя. Выбор растворителя влияет только на глубину окрашивания.
Впервые получены спектры поглощения волос человека, окрашенных растворами индоцианина зеленого. При взаимодействии индоцианина зеленого с веществом волос полосы поглощения красителя смещаются в длинноволновую
область спектра на 23±5 нм для мономеров и 33±1 нм для димеров красителя по сравнению с положениями полос поглощения в водных растворах. 4) Смещение полос поглощения индоцианина зеленого в область больших длин волн при его взаимодействии с меланином составляет 42±5 нм для мономеров и 32±1 нм для димеров красителя по сравнению с положениями полос поглощения в водных растворах.
Апробация работы
Результаты диссертационной работы докладывались на российских и международных научных конференциях:
5-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (2-5 октября 2001)
7-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (7-Ю октября 2003)
8-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (21-24 сентября 2004)
Третий международный оптический конгресс «Оптика - XXI век» конференция «Фундаментальные проблемы оптики - 2004», Санкт - Петербург, Россия, (18-21 октября 2004 г)
II Евразийский конгресс по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика-2005», Москва, Россия (21-24 июня 2005)
9-ая Международная молодежная научная школа по оптике, лазерной физике и биофизике, Саратов, Россия (27-30 сентября 2005).
Список опубликованных работ по теме диссертации
По теме диссертации опубликовано 11 работ, в том числе 2 статьи в журналах, рекомендуемых ВАК.
Kulyabina T.V., Drajevsky R.A., Kochubey V.I., Zimnyakov D.A. Coherent optical analysis of crystal-like patterns by human plasma desiccation II Proc. SPIE. 2001. Vol.4242, P.282-285 \
Кулябина T.B., Кочубей В.И. In vivo исследования растворов индоцианина зеленого с поверхностными слоями эпидермиса человека // Проблемы оптической физики, 2004, книга 1, стр. 68-73.
Kulyabina T.V., Kochubey V.I. In vivo investigation of interaction of indocyanine green solutions with human epidermis II Proc. SPIE. 2004, Vol.5474, P.339-343
Кулябина T.B. Агрегация индоцианина зеленого в водных растворах // Труды третьей международной конференции «Фундаментальные проблемы оптики»,
2004, стр.47-49.
Кочубей В.И., Кулябина Т.В., Тучин В.В., Альтшулер Г.Б. Спектральные характеристики индоцианина зеленого при его взаимодействии с биологическими тканями // Оптика и спектроскопия, 2005, том 99, № 4, С. 582-588
Кулябина Т.В., Кочубей В.И., Прохорова Е.Н. Спектральные исследования взаимодействия индоцианина зеленого с меланином // Труды II Евразийского конгресса по медицинской физике и инженерии «Медицинская физика- 2005»,
2005, С. 281-282.
7. Kulyabina T.V., Kochubey V.I. Efficiency of staining hair with indocyanine green II
РГОС. SPIE. 2005, Vol. 5771, P. 372-376
Кулябина T.B., Кочубей В.И. Эффективность окрашивания волос человека растворами индоцианина зеленого // Проблемы оптической физики, 2005, книга 1, стр. 68-73.
Kulyabina T.V., Kochubey V.I. The interaction of indocyanine green with blood plasma and features of crystallization in Saratov Fall Meeting 5005: Optical Technologies in Biophysics and Medicine VII, edited by Valery V. Tuchin, Proceedings of SPIE Vol. 6163 (SPIE, Bellingham, WA, 2006) 6163 IK
Ю.Кулябина Т.В., Кочубей В.И. Влияние взаимодействия индоцианина зеленого с плазмой крови на процесс ее кристаллизации // Проблемы оптической физики, Материалы 9-ой Международной молодежной научной школы по оптике, лазерной физике и биофизике, 2006, С. 43-48.
11. Кочубей В.И., Кулябина Т.В., Тучин В.В., Альтшулер Г.А. Исследования индоцианина зеленого в растворах с перспективой создания стандартного образца // Законодательная и прикладная метрология, 2006, № 5, С. 43^7.
Личный вклад соискателя
Личный вклад соискателя представляет собой участие в постановке исследовательских задач, подготовку и проведение экспериментальных работ, обработку и участие в обсуждении и интерпретации полученных результатов.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, четырех глав и библиографического списка, состоящего из 128 наименований. Общий объем текста составляет 156 страниц текста, включающего 9 таблиц и 67 рисунков.
Закономерности агрегации и дезагрегации индоцианина зеленого
Образование J-агрегатов и J-дезагрегатов отслеживается с помощью измерений оптической плотности растворов. Максимум поглощения мономера ICG-Nal в воде находится при 780 нм, димера - при 700 нм, [42, 39] J-агрегаты имеют широкую полосу поглощения с максимумом при 890 нм. Измерен также квантовый выход флуоресценции индоцианина зеленого, равный 0.0003 в воде и 0.11 в ДМСО [39]. Для водного раствора соли индоцианина, ICG-Nal в концентрации 10"7 М и 2x10 5 при концентрации 10"2М, наблюдался квантовый выход флуоресценции, равный 0.02 [43]. Ленхард и Хейн (Lenhard и Неіп) в своей работе [44] измеряли окислительно-восстановительный потенциал J-агрегатов катионных полиметиновых красителей в галоидах серебра посредством использования окислительно-восстановительного буфера и нашли, что возбужденное состояние J-агрегата было на 0,3V ниже, чем мономера. Из исследований поглощения J-агрегатов ICG-Nal найдено, что число молекул формирующих агрегат хромофора, оказывается равным 16±8, излучательное время жизни Trad=5.5±0.5 нс/псЬг=340±100пс. Следует отметить, что димеризация красителя наблюдается уже при концентрациях l.lxlO"10 моль/см3. г В результате термической обработки иодида натрия индоцианина зеленого образуются J-агрегаты. Ротермунд (Rotermund) и коллеги [39] наблюдали образование J-агрегатов индоцианина зеленого при концентрации красителя 1,5 10"3 моль/дм3 в водной среде. С помощью анализа температурной зависимости скорости роста концентрации агрегатных состояний (начиная от димеров до J-агрегатов) индоцианина в растворе, определена энергия активации объединения молекул (Eatt=0,41 эВ). При этом концентрация определялась по величине оптической плотности раствора на заданной длине волны. Энергия активации отделения молекул (Edet=0,41 эВ) от J-агрегатов выводится из степени температурной зависимости уменьшения поглощения J-агрегатов в результате сильного разбавления. В данных экспериментах концентрация красителя в приготовленном растворе составляла 1,5х10"3 моль/дм3, т.е. приблизительно в 10 раз меньше предела растворимости ICG-Nal в воде (предел растворимости 2x10 моль/дм ). При меньшей концентрации красителя скорость образования J-агрегатов становится меньше и стабильность ICG-Nal в воде снижается, особенно при повышенных температурах. Изменение с течением времени спектральной зависимости сечения поглощения ICG с концентрацией 1,5x10 М представлено на рис. 1.7.
Представленное сечение поглощения нормируется на общую плотность молекул красителя в растворе, т.е. a=a/N0=-ln(T)/(No/), где a - коэффициент поглощения, No - полная плотность ICG-Nal, Т - пропускание, /-длина образца. Точечная кривая 1 - сечение поглощения ICG-Nal, растворенного в воде при комнатной температуре. Главным образом здесь присутствуют димеры и сечение поглощения определяется поглощением димеров. Сплошные кривые 2-6 показывают сечения поглощения после различных периодов термической обработки при 65С. Хорошо просматривается уменьшение пика поглощения димеров при 690 нм. Существует изобестическая точка около 770 нм, в которой сечения спектра поглощения димеров и сечения поглощения J-агрегатов одинаковы. Пунктирная кривая 7 отражает сечение поглощения после 32 часов нагревания при температуре 65 С и двухнедельного хранения. После такой обработки практически не происходит никаких изменений при хранении образцов в течение нескольких месяцев. На рис. 1.8.а показаны зависимости сечения поглощения аР (ХР=890нм) J-агрегата от времени температурной обработки образца). Рост поглощения J-агрегатов сильно зависит от температуры. При 90С за четырехчасовой период времени оказывается связанными с J-агрегатом такое же количество молекул, какое связывается при 20С за 330 часов. При температурах выше 70С J-агрегаты становятся менее термически стабильными и разрушаются. При низких температурах время образования J-агрегатов становится очень большим и во время этого периода молекулы красителя также разрушаются. Оптимальные условия образования J-агрегатов существуют при температуре более 65С, где скорость образования все еще высокая и термическая стабильность также все еще высока. При такой температуре наблюдается самый высокий максимум сечения спектра поглощения ар.
Влияние состава растворителя и концентрации красителя
Из полученных спектров поглощения растворов индоцианина зеленого следует, что положение, полуширина и соотношение максимумов интенсивностей двух полос поглощения растворов различаются в зависимости от типа растворителя. В наших экспериментах концентрация красителя в растворах менялась от 0.01 до 1 мг/мл, что составляет от 1.29x10" до 1.29x10 моль/см соответственно.
При концентрации ICG 1 мг/мл максимум поглощения водного раствора расположен при длине волны 696 нм. Интенсивность полосы поглощения в длинноволновой области при 778 нм значительно меньше интенсивности коротковолновой полосы. При изменении концентрации раствора смещение положений максимумов поглощения не наблюдается, однако соотношение между амплитудами полос меняется до концентрации 0.01 мг/мл, но данное смещение может быть обусловлено погрешностью при разложении сложного спектра на гауссовы полосы, возникающей из-за очень малой величины сигнала. Десятикратное уменьшение концентрации ICG в водном растворе приводит к уменьшению соотношения амплитуд примерно в 1.5 раза (рис. 2.1). При последующем уменьшении концентрации (в 100 раз и более) соотношение амплитуд еще уменьшается. Таким образом, при используемых в медицине концентрациях красителя в водных растворах имеет место сильная димеризация индоцианина зеленого. Например, в работе [66] в вену вводился водный раствор ICG концентрацией 5мг/мл с последующим введением 10 мл физиологического раствора. Лишь при концентрации 0.01 мг/мл начинает преобладать полоса поглощения мономера.
В случае использования других растворителей в спектрах растворов с аналогичными концентрациями ICG наблюдается общее смещение полос поглощения в длинноволновую область. При этом соотношение амплитуд полос также меняется на противоположное: поглощение мономера красителя преобладает. При изменении концентрации красителя в спиртовых или глицериновых растворах без добавления воды положение полос и соотношение их амплитуд остается неизменным. Разбавление использованных в эксперименте растворителей водой в соотношении 1:1, как правило, снижает коэффициент поглощения этого раствора и смещает максимумы поглощения в коротковолновую область. Амплитуды полос поглощения выравниваются. Исключением является этанол: при разбавлении его водой в соотношении 1:1 соотношение между амплитудами двух полос поглощения больше, чем для раствора этанола с той же концентрацией красителя (см. рис. 2.4, 2.5). При дальнейшем разбавлении исходных растворов водой (с уменьшением концентрации ICG в растворах до 0.1 мг/мл) форма спектров этих растворов становится похожа на форму спектров водного раствора ICG при аналогичной концентрации красителя.
Из полученных данных следует, что при использовании чистых растворителей зависимость положения спектральных полос от концентрации красителя очень слабая. Степень димеризации красителя в водных растворах увеличивается с ростом его концентрации, в спиртовых растворах такая зависимость отсутствует. Полученные закономерности согласуются с литературными данными: в то время как в водных растворах ICG димеризацию наблюдали при концентрациях красителя свыше 1 х 10"4моль/дм3 (0.075 мг/мл) [25], в спиртовых растворах вплоть до концентраций 2x10 моль/дм (1.55 мг/мл) в спектрах преобладает полоса поглощения мономеров [25]. При увеличении концентрации ICG в спиртовых растворах образуются близко расположенные, пары красителя [43]: молекулы спирта препятствуют созданию димеров.
Исходя из наших данных, в водно-спиртовых растворах, в зависимости от соотношения концентраций растворителей и ICG, положение полос изменяется сложным образом. Из полученных спектров для смесей растворителей следует, что, если соотношение воды и этанола (или глицерина) не ниже 1/1, определяющим фактором является влияние спиртов. При повышении концентрации воды в смеси происходит смещение полос поглощения в коротковолновую область и резкое увеличение степени агрегации молекул [63].
Следует учитывать, что по существующим данным [67] на молекулярном уровне спирт и вода не смешиваются полностью вне зависимости от того, как долго производится смешивание. При смешивании спирта и воды энтропия полученной конечной системы ниже, чем в идеальном растворе.
На микроскопическом уровне полное смешивание спирта и воды могло бы привести к появлению образований по две молекулы, появляющихся вместе случайно, формируя жидкую фазу без взаимодействия молекул компонент раствора между собой. Энтропия, подразумеваемая для водно-спиртового раствора, должна значительно превышать энтропию чистого спирта. В представленных в данной работе экспериментах в качестве одного из растворителей был использован этанол, а в приводимых литературных данных описывается также применение метанола. Но так как физические и химические свойства этих спиртов близки, то мы считаем возможным использовать данные, полученные для метанола, в качестве теоретических основ диссертационной работы.
Структура жидкого метанола при комнатной температуре представляет собой комбинацию колец и цепочек, состоящих из 6 или 8 молекул метанола [67]. При добавлении воды цепочки метанола взаимодействуют с молекулярными кластерами воды различных размеров. Они связывают цепочки метанола в стабильные открытые кольцевые структуры. Формирование новых организованных структур из молекул воды и метанола означает, что обе жидкости смешиваются на микроскопическом уровне очень слабо. Это происходит потому, что молекулы воды формируют кластерную структуру с водородными связями в качестве «клея», который держит кластеры вместе. Водородные связи быстро рвутся и деформируются, так что в каждый момент времени существуют «свободно плавающие» молекулы воды. Так как эти водород-связанные кластеры взаимодействуют с цепочками метанола в водно-спиртовых растворах, то существуют и не свободно плавающие (упорядоченные) молекулы воды. Знание этих фактов помогает объяснить уменьшение энтропии для таких растворов [67].
При смешивании спирта и воды образуются стабильные структуры (формируются кольца) так как водородные связи являются насыщенными [67]. Данный факт, а также сродство молекул этанола и индоцианина зеленого, может приводить к тому, что, даже при малой концентрации этанола в растворе, его влияние на спектр поглощения больше, чем влияние воды.
Взаимодействие индоцианина зеленого с веществом волос человека и шерсти домашних животных
В текущем разделе главы описывается проведение исследований эффективности окрашивания волос человека раствором органического красителя индоцианина зеленого в зависимости от типа волос, их естественного цвета, продолжительности окрашивания и предварительной обработки образцов. Из полученных спектров следует, что ICG преимущественно связывается с материалом волос в приповерхностной области. Внедрение красителя внутрь волоса затруднено по причине того, что верхние чешуйки волоса являются плотным защитным слоем. Растворы красителя не вступают практически в реакцию с материалом его клеток, и не могут проникнуть глубже. Только при разрушении этого защитного поверхностного слоя чешуек волоса возможна дальнейшая его окраска. Исследуемым материалом на данном этапе служили пряди натуральных светлых и темных волос человека, а также овечья шерсть. Часть образцов предварительно обрабатывалась в 250 мл раствора перекиси водорода для обесцвечивания (разрушения меланина, содержащегося в ткани волос) или слабого раствора щелочи для нарушения целостности верхнего защитного слоя чешуек волоса вследствие разрушения кератина. Для этого прядь волос помещалась в слабый щелочной раствор для разрушения кератина на 30 минут, затем еще на 30 минут для окрашивания в спиртовой раствор индоцианина зеленого. Затем пряди промывались дистиллированной водой для удаления несвязанного с волосами красителя и с помощью спектрофотометра CARY-2415 регистрировались спектры отражения и/или пропускания в диапазоне длин волн 400-900 нм. Всего было пять образцов - три темных и два светлых. Также были изучены спектры пропускания образцов волос, отличающихся длительностью выдержки в красителе. Три пряди волос были помещены в спиртовой раствор индоцианина зеленого на 30, 45 и 60 минут соответственно. Затем были зарегистрированы последовательно три спектра пропускания этих образцов. Образцы окрашивались в спиртовом растворе индоцианина зеленого (концентрация красителя 1мг/мл).
Полученные экспериментально результаты представлены в виде графиков на рисунках 3.7.- 3.11. Получение точного значения положения максимума поглощения в измеряемых спектрах затруднено тем, что в этой же области поглощает меланин волос, что приводит к смещению положения максимума. Для устранения этого эффекта экспериментально полученные графики подвергались математической обработке, устраняющей поглощение меланина. А именно - на основе экспериментальных данных, по коротковолновой части спектра, в которой поглощение индоцианина отсутствует, методом регрессии строилась аппроксимирующая кривая. Таким образом, получался спектр пропускания или отражения меланина волос во всей измеряемой области спектра. Эта операция дает достоверный результат, т.к. спектральная зависимость пропускания или отражения меланина имеет монотонный характер в области 400-900 нм, и аппроксимирование данной зависимости кривой пятого порядка дает хорошее совпадение с данной зависимостью. Второй этап - в режиме оптической плотности вычитание спектра меланина волос из экспериментально полученного спектра и последующий перевод полученной зависимости обратно в спектр отражения или пропускания. Из сравнения спектров окрашенных волос со спектром окрашенной шерсти, имеющей более рыхлую структуру поверхности, видно, что шерсть -; прокрашивается лучше. Малая эффективность окрашивания необработанных / волос происходит из-за наличия в них плотного поверхностного слоя, состоящего ; из кератинизированных чешуек, препятствующих проникновению красителя \) внутрь волос и связыванию его с протеином цитоплазмы кератиноцитов. Волосы, Ц обесцвеченные с помощью перекиси водорода или обработанные щелочным Ц раствором, что сопровождается частичным разрушением защитного у поверхностного слоя, окрашиваются интенсивнее, чем не обесцвеченные или :". необработанные.
Применение хроматографических методов в исследовании спектральных характеристик взаимодействия индоцианина зеленого с биологическими образцами
Основой тонкослойной хроматографии является адсорбционный метод, хотя v J также встречается метод распределительной хроматографии. Адсорбционный метод основан на различии степени сорбции-десорбции разделяемых компонентов на неподвижной фазе. Адсорбция осуществляется за ; счет ван-дер-вальсовских сил, являющихся основой физической адсорбции, полимолекулярной (образование нескольких слоев адсорбата на поверхности адсорбента) и хемосорбцией (химического взаимодействия адсорбента и .: адсорбата). Для эффективных процессов сорбции-десорбции необходима большая площадь, что предъявляет определенные требования к адсорбенту. При большой : ! поверхности разделения фаз происходит быстрое установление равновесия между [ [ фазами компонентов смеси и эффективное разделение. УР Выражение для адсорбции-десорбции в упрощенном виде принимает вид: \А где Г - количественная характеристика адсорбции, представляющая собой избыток адсорбата, приходящийся на единицу площади поверхностного слоя, по сравнению с количеством адсорбата в единицу объема фазы адсорбента, Г -предельно возможная величина адсорбции для данной системы, К - константа равновесия системы (константа равновесия"постоянная, зависящая для каждой - \ обратимой реакции от внешних условий - это отношение констант скоростей ; протекания прямой и обратной реакций при заданных внешних условиях при f; химическом равновесии. Равновесие химическое - состояние системы, в которой г: обратимо протекает одна или несколько реакций химических, причём для каждой из них скорости прямой и обратной реакций равны, вследствие чего состав / системы остаётся постоянным, пока сохраняются условия её существования); с -концентрация адсорбата [127]. Отсюда следует, что адсорбция является линейной функцией концентрации. В более строгих подходах необходимо учитывать взаимодействие между ,-: адсорбированными частицами, неоднородность поверхности, давление, температуру и т.д. I:) Одной из разновидностей метода тонкослойной хроматографии является Щ распределительная жидкостная хроматография. В ней обе фазы - подвижная и r;. j V .. } неподвижная - жидкости, не смешивающиеся друг с другом. Разделение веществ . основано на различии в их коэффициентах распределения между этими фазами. і.; Впервые метод тонкослойной хроматографии заявил о себе как «Бумажная тонкослойная хроматография», которая основывалась на распределительном методе разделения компонентов [128].
В связи с тем, что используемая в этом методе хроматографическая бумага і; (специальные сорта фильтровальной бумаги) содержат в порах воду (20-22%), в 1 качестве подвижной фазы используются органические растворители и/или вода. : . Направление потока нисходящее, восходящее или радиальное. Метод \ -, I хроматографии - как правило, элюэнтное проявление [128]. С 4 Использование хроматографии на бумаге имеет ряд существенных недостатков: зависимость процесса разделения от состава и свойств бумаги, изменение содержания воды в порах бумаги при изменении условий хранения, очень низкая скорость хроматографирования (до нескольких суток), низкая воспроизводимость результатов. Эти недостатки серьезно влияют на распространение хроматографии на бумаге как хроматографического метода. Поэтому можно считать закономерным появление хроматографии в тонком слое сорбента - тонкослойной хроматографии. Ь: Тонкослойная хроматография , В этом методе хроматографирование веществ происходит в тонком слое сорбента, нанесенного на твердую плоскую подложку. Разделение в основном / происходит на основе сорбции-десорбции. ;, Использование различных сорбентов, позволило значительно расширить и ,.:\ улучшить этот метод. На сегодняшний день в основном используются пластины заводского ".. изготовления, имеющие достаточно широкий ассортимент как по размерам и носителям, так и по подложкам. -і ;, Современная хроматографическая пластинка представляет собой основу из " стекла, алюминия или полимера (например политерефталат). В связи с тем, что ; ; стеклянная основа становится менее популярной (часто бьется, нельзя разделить ;-. : пластинку на несколько частей, не повредив слой сорбента, тяжелая по весу), ;;\j наибольшее распространение получили пластины, в качестве основ которых Ц.-, используют алюминиевую фольгу или полимеры. Для закрепления сорбента применяют гипс, крахмал, силиказоль и др., которые удерживают зерна сорбента на подложке. Толщина слоя может быть \ различна (100 и более мкм), но самый важный критерий - слой должен быть : равномерный по толщине в любом месте хроматографической пластинки. :; Целлюлоза - тонкослойные пластины с нанесенной целлюлозой очень ; эффективны для разделения сложных органических молекул. Адсорбент \ \) представляет собой в основном шарики целлюлозы диаметром до 50 мкм, Ґ !. \ : : -IV: закрепленные на носителе крахмалом. Но, как и в бумажной хроматографии, : подъем фронта растворителя происходит очень медленно. ; В тонкослойной хроматографии в качестве подвижной фазы используют либо чистые вещества (этилацетат, бензол и т.п.), либо их смеси (системы) в определенном соотношении. Подбор подвижной фазы (системы) проводится по следующим правилам: Выбирают такую систему, в которой разделяемые компоненты ., имеют небольшую растворимость (если растворимость вещества высокая, то : вещества будут перемещаться с фронтом, при низкой растворимости - оставаться на старте). При распределительной хроматографии или при использовании обращенных фаз, растворимость веществ должна быть выше в подвижной фазе, -; чем в неподвижной. Состав системы должен быть постоянным и легко воспроизводимым. :ІИ Растворитель или компоненты системы не должны быть ядовитыми или дефицитными.
