Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Микроспектральные исследования БАС: Современное состояние проблемы 9
1.1. Методы исследования БАС на основе микроскопии и флуоресценции 10
1.2. Микроспектрофлуориметры 14
1.3. Развитие метода МСФ и его применения 19
1.3.1. Исследования ксенобиотиков в живых клетках с помощью МСФ 19
1.3.1.1. МСФ-исследования полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) 21
1.3.1.2. МСФ в исследованиях лекарств против псориаза 24
1.3.1.3. МСФ в исследованиях противоопухолевых соединений 24
1.3.2. МСФ в измерениях внутриклеточных концентраций свободных ионов 30 кальция и магния
1.3.3. Метод МСФ в исследованиях ФС 34
1.3.4. Анализ методом МСФ собственной флуоресценции клеток 36
1.3.5. Некоторые другие исследования с применением метода МСФ 40 Глава И. Приборное обеспечение и разработка метода КОМИРСИ 45 II. 1. Приборное обеспечение для конфокальной сканирующей микроспектроскопии 45 II. 1.1. Конфокальный сканирующий микроспектрометр фирмы Dilor 45 П. 1.1.1. Спектрометр 46 И. 1.1.2. Микроскоп 48 II. 1.1.3. Входная конфокальная камера и принцип линейного сканирования 49 И. 1.1.4. Программное обеспечение 52
1.1.2. Разработка лабораторной экспериментальной установки для конфокальной сканирующей микроспектроскопии
II.2. Разработка метода КОМИРСИ 65
Н.2.1. Идентификация и изучение молекулярных взаимодействий БАС в живых 67
клетках методом КОМИРСИ
П.2.2. Проблема собственной клеточной флуоресценции и ее решение методом 73
КОМИРСИ
II.2.3. Измерение концентрации БАС и их комплексов в живых клетках методом 77
КОМИРСИ
П.2.4. Применение метода КОМИРСИ для выявления органоидов, в которых 87
происходит преимущественное накопление исследуемых БАС
II.2.5. Исследования распределения БАС в срезах тканей методом КОМИРСИ 95
П.2.6. Преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БАС 101
Глава III. Материалы и методики 102
II 1.1. Реактивы 102
Ш.2. Исследование молекулярных взаимодействий БАС в растворах 104
Ш.З. Измерение генерации активных форм кислорода 106
Ш.4. Оценка фотостабилыюсти ЦИХЛ и ЦИБХЛ 107
111.5. Эксперименты на культуре клеток 108
111.6. Методики, применявшиеся при изучении внутриклеточной локализации БАС 109 Ш.7. Методики исследования цитотоксического воздействия БАС 112
III.8. Приготовление криостатных срезов тканей 115
Ш.9. Приборное и программное обеспечение экспериментов 116
Глава IV. Исследования БАС с применением метода КОМИРСИ 117
IV. 1. Исследования митоксантрона 118
IV. 1.1. Исследование молекулярных взаимодействий МИТО в растворах 118
IV. 1.2. Анализ внутриклеточных спектров МИТО 122
IV. 1.3. Количественный анализ МИТО и его комплексов в клетках К562 125
IV. 1.4. Особенности внутриклеточного накопления и распределения МИТО на разных стадиях клеточного цикла
IV. 1.5. Особенности накопления и распределения МИТО в клетках K562R с 136
множественной лекарственной устойчивостью
IV.2. Исследование сульфированного фталоцианина в живых клетках и срезах тканей
IV.2.1. Молекулярные свойства сульфированного фталоцианина 141
IV.2.2. Накопление и распределение H2PCS2.4 в живых раковых клетках, как основа его фотодинамической активности 144
IV.2.3. Распределение H2PCS2.4 в опухолевых тканях 146
IV.2.3.1. Гистологический анализ особенностей роста опухолей 146
IV.2.3.2. Распределение H2PCS2.4 в срезах тканей 149
IV.3. Сравнительное исследование свойств ФС хлоринового ряда 155
IV.3.1. Исследования З-дезвинил-3-формилхлорина рб 157
IV.3.1.1. Молекулярные свойства ФХрб 158
IV.3.1.2. Исследования ФХрб в живых клетках 160
IV.3.2. Циклоимидные производные хлорина рб (ЦИХЛ) 165
IV.3.2.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИХЛ 165
IV.3.2.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИХЛ в растворах 169
IV.3.2.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИХЛ 174
IV.3.2.4. Особенности внутриклеточных спектров флуоресценции ЦИХЛ 182
IV.3.2.5. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИХЛ 186
IV.3.2.6. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИХЛ 188
IV.3.2.7. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИХЛ
IV.3.2.8. Механизмы ЦИХЛ-опосредованной фотоиндуцированной гибели клеток 196
IV.3.2.9. Распределение ЦИХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р388 199
IV.3.2.10. ФДТ с использованием соединений 1 и 5 203
IV.3.2.11. Сравнительный анализ данных метода КОМИРСИ о распределении ЦИХЛ в тканях и результатов ФДТ
IV.4. Исследование свойств фотосенсибилизаторов на основе циклоимидных производных бактериохлорина
IV.4.1. Растворимость, спектры поглощения и флуоресценции ЦИБХЛ 209
IV.4.2. Исследование молекулярных взаимодействий ЦИБХЛ в растворах 211
IV.4.3. Исследование внутриклеточного распределения и локализации ЦИБХЛ 214
IV.4.4. Особенности клеточного накопления и выведения ЦИБХЛ 219
IV.4.5. Исследование механизмов клеточного транспорта ЦИБХЛ 222
IV.4.6. Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИБХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИБХЛ
IV.4.7. Влияние ЦИБХЛ-опосредованного фотодинамического воздействия на состояние митохондрий, лизосом и липидного транспорта
IV.4.8. Распределение ЦИБХЛ в тканях мышей с перевивной опухолью Р388 228
Заключение 231
Выводы 236
Благодарности 237
Список использованных сокращений
- Исследования ксенобиотиков в живых клетках с помощью МСФ
- Оценка фотостабилыюсти ЦИХЛ и ЦИБХЛ
- Накопление и распределение H2PCS2.4 в живых раковых клетках, как основа его фотодинамической активности
- Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИХЛ
Введение к работе
Оптическая микроскопия уже более 300 лет является исследовательским инструментом, который все более разнообразно и широко используется в биологии, биофизике и медицине.
Анализ окрашенных срезов тканей и клеток в проходящем белом свете - наиболее простое на сегодняшний день, но весьма информативное применение оптической микроскопии - в современном виде сформировалось десятки лет назад и остается неотъемлемой частью клинических и медико-лабораторных исследований. Данный подход основан на использовании различий в интенсивности и цвете естественной или искусственной окраски определенных веществ в клетках и тканях, в комбинации с анализом морфологических признаков для выяснения присутствия, локализации, а во многих случаях и оценки количественных характеристик этих веществ, клеточных и тканевых структур, типирования клеток и микроорганизмов.
Разработка оптических систем для реализации методов дифференциального интерференционного контраста и фазового контраста открыла исследователям возможность уверенного наблюдения и исследования микроструктур в составе неокрашенных и слабоконтрастных биологических объектов, таких как живые клетки.
Создание микроскопов, позволяющих наблюдать флуоресценцию молекул в клетках и тканях, привело к развитию многообразия методов и подходов к изучению структуры и функции клеток, клеточных структур, биологических клеточных процессов, а также эндогенных и экзогенных (синтетических и природных) молекул и ионов металлов в клетках и срезах тканей.
До 60-х годов 20 века оптическая микроскопия являлась методом, который обеспечивал субмикронное разрешение только в фокальной плоскости объектива. Изобретение конфокальной системы фильтрации сигнала дало возможность измерения флуоресцентных сигналов с трехмерным субмикронным разрешением. Совпавший по времени прогресс в разработке лазерных систем и персональных компьютеров стимулировал наблюдаемое сейчас бурное развитие новых методов флуоресцентной микроскопии. Среди новых и развивающихся методов отметим лазерную сканирующую конфокальную микроскопию (ЛСКМ), двух- и мульти- фотонную микроскопию, микроскопию на основе измерения времени жизни флуоресценции, конфокальную микроспектроскопию, микроскопию с применением эффекта полного внутреннего отражения, а также методические подходы на основе анализа восстановления флуоресценции после фотообесцвечивания и флуоресцентного переноса энергии. Помимо флуоресцентной в настоящее время идет активное развитие микроскопии ближнего поля и методов оптической микроскопии на основе колебательной спектроскопии, таких как инфракрасная микроскопия и микроскопия комбинационного рассеяния (КР).
Развитие новых методов оптической микроскопии полностью востребовано в современной клеточной биологии и биофизике. Достигнутый к настоящему времени уровень понимания взаимодействия и функционирования биологических молекул и их комплексов в бесклеточной среде, глубокое проникновение в основы процессов жизнедеятельности клетки, с одной стороны, и возрастающая потребность в более информативных методах исследования, с другой стороны, создают основу для быстрого внедрения новых методов оптической микроскопии в исследовательский процесс. Развитие генной инженерии, протеомики и биотехнологии ставит на повестку дня вопрос об углубленном изучении процессов синтеза, транспорта и взаимодействий биологических молекул в живой клетке, а также о практическом использовании этих знаний. Для решения этих задач также необходимо скорейшее совершенствование экспериментальных подходов на основе оптической микроскопии.
Одной из возможностей значительного увеличения информативности оптической микроскопии является применение в микроскопии спектрального анализа. В данной диссертации представлены результаты разработки метода конфокальной микроскопии и реконструкции спектральных изображений (КОМИРСИ), а также результаты применения этого метода в исследованиях биологически активных соединений (БАС).
Метод КОМИРСИ базируется на измерении с субмикронным пространственным разрешением и анализе в каждой точке сканируемого объекта (живой клетки или среза ткани) полных спектров флуоресценции или КР исследуемого БАС. Это позволяет не только установить пространственное распределение БАС в сканируемом объекте, но и изучить по спектрам микроокружение и молекулярные взаимодействия БАС, имеющие непосредственное отношение к его функциональной активности, измерить концентрацию БАС и его молекулярных комплексов.
К разработке метода КОМИРСИ меня подтолкнуло участие в создании прибора для конфокальной сканирующей микроспектроскопии КР и флуоресценции, проводившемся фирмой "Dilor" (Лиль, Франция) в сотрудничестве с лабораторией спектроскопии биомолекул Реймского университета (Реймс, Франция) в 1993-1994 гг. В процессе оптимизации конструкции прототипа прибора и тестировании программного обеспечения мной был выполнен ряд измерений и исследований разнообразных образцов, выявивший большой потенциал нового спектрального микроскопа в различных областях науки, включая минералогию, материаловедение, физику твердого тела, биофизику и клеточную биологию. В процессе исследований противоопухолевого препарата митоксантрона, проведенных мной в сотрудничестве с лабораторией спектроскопии биомолекул Реймского университета на приборной базе фирмы "Dilor" оформились первые две задачи настоящей работы:
Разработать основы метода КОМИРСИ для идентификации и изучения молекулярных взаимодействий БАС в живых клетках с трехмерным субмикронным пространственным разрешением; с использованием метода КОМИРСИ разработать методики измерения концентрации БАС и их комплексов в живых клетках, методики оценки средних концентраций БАС в органеллах, клеточных доменах, в среднем по клетке, а также методики проведения статистически достоверного анализа клеточных концентраций БАС на ограниченной выборке клеток.
Решение этих задач было продолжено в исследованиях новых отечественных фотосенсибилизаторов (ФС) для фотодинамической терапии рака. ФС для исследований были предоставлены профессором Е. А. Лукьянец (НИОПИК) и профессором А. Ф. Мироновым (МГАТХТ им. М. В. Ломоносова). Исследования ФС на раковых клетках и в срезах тканей животных и пациентов проводились в тесном сотрудничестве со специалистами лаборатории модификаторов и протекторов МНИОИ им. П. А. Герцена (зав. лаборатории профессор Р.И. Якубовская). Проблема отсутствия необходимой приборной базы в России на первом этапе была решена благодаря установлению долгосрочного научного сотрудничества с Центром молекулярной биофизики Национального центра научных исследований Франции (г. Орлеан, Франция), который предоставил возможность использования в исследованиях прибора для конфокальной сканирующей микроспектроскопии фирмы "Dilor". Для того, чтобы обеспечит возможность выполнения исследований методом КОМИРСИ в России, встала задача создать лабораторную установку для конфокальной сканирующей микроспектроскопии.
Необходимость выяснения точной внутриклеточной локализации изучаемых ФС, а также понимание важности расширенного исследования с выполнением анализа на срезах тканей привели к появлению еще двух задач: (3) На основе метода КОМИРСИ разработать методики выявления органоидов, в которых происходит преимущественное накопление исследуемых БАС; (4) с использованием метода КОМИРСИ разработать методики исследования распределения БАС в срезах тканей и оценки относительной концентрации БАС в различных структурах тканей.
Во многих исследовательских задачах метод КОМИРСИ может служить альтернативой методам ЛСКМ и проточной цитометрии. Чтобы эффективно развивать и адекватно использовать метод КОМИРСИ, было необходимо выявить преимущества и ограничения метода КОМИРСИ в исследованиях БАС.
Одной из ключевых задач, которая решалась на протяжении всей работы, было: (5) применить разработанный метод КОМИРСИ и методики, созданные на его основе, в исследованиях БАС, для получения новой информации о механизмах функциональной активности изучаемых БАС, о взаимосвязях между структурой и активностью БАС, о мишенях действия БАС в клетках и тканях.
Основными объектами исследований служили противоопухолевый препарат митоксантрон, ФС на основе сульфированных производных фталоцианина, октакарбоксифталоцианин кобальта, З-девинил-3-формил хлорин рб, циклоимидные производные хлорина рб и бактериохлорина с различными заместителями введенными в пиррольные циклы A, D и в имидный цикл Е, флуоресцентно-меченные пробы лектинов, кардиотоксины из яда кобр Naja haja, Naja oxiana, Naja kaouthia, цитохром с и его генно-инженерные мутантные формы.
Предметом детальных исследований были: применимость метода КОМИРСИ в исследовании различных БАС и новые возможности связанные с использованием этого метода; внутриклеточное распределение и молекулярные взаимодействия митоксантрона в клетках эритролейкоза человека К562, и их изменения (особенности) на разных стадиях клеточного цикла и в клетках с множественной лекарственной устойчивостью (МЛУ); особенности накопления и распределения безметального сульфированного фталоцианина в различных раковых клетках в культуре и в опухолях на срезах тканей мышей; молекулярные и клеточные механизмы действия ФС; влияние структуры циклоимидных производных хлорина рб и бактериохлорина на ключевые характеристики, определяющие фотодинамический эффект ФС в раковых клетках.
Помимо метода КОМИРСИ и методик на его основе в данной работе широко применяли флуоресцентную микроскопию, а также методы спектрофотометрии, флуоресцентной и КР- спектроскопии молекул в растворах.
В Главе I данной работы рассмотрено современное состояние проблемы применения спектрального анализа в микроскопии для изучения БАС в клетках, а в Главах II-IV изложены полученные мной и под моим руководством результаты, которые сгруппированы следующим образом. В Главе II описано приборное обеспечение метода КОМИРСИ, включая конфокальный сканирующий микроспектрометр фирмы «Dilor» и созданную мной лабораторную экспериментальную установку для конфокальной сканирующей микроспектроскопии, а также представлены результаты разработки метода КОМИРСИ. В Главе III описаны реактивы и экспериментальные методики, применявшихся в исследованиях, представленных в диссертации. В Главе IV изложены результаты исследований БАС с применением метода КОМИРСИ, включая исследования митоксантрона и отечественных ФС. В Заключении обобщены итоги разработки метода КОМИРСИ и исследований с применением этого метода и представлены выводы диссертационной работы. Используемые в работе сокращения и аббревиатуры приведены в виде отдельного списка в конце диссертации.
Исследования ксенобиотиков в живых клетках с помощью МСФ
Возможности применения МСФ к исследованию ксенобиотиков и результаты, полученные в исследованиях живых клеток до 1987 г. детально проанализированы и систематизированы в обзоре [33]. Ксенобиотики, такие как химические мутагены, химические канцерогены и лекарства участвуют в специфических взаимодействиях с макромолекулами в клетках. В ряде случаев ксенобиотики способны вступать в химические реакции с молекулами-мишенями. Так некоторые канцерогены (например, нитрозамиды) являются агентами прямого действия. Они сами по себе достаточно реакционно-способны, чтобы взаимодействовать с компонентами клетки. Другая группа канцерогенов (например, ароматические амины и ароматические полициклические углеводороды) - это соединения непрямого действия. Для них характерно протекание внутриклеточной химической модификации (метаболитической активации), переводящей молекулу в более реакционно-способную форму, которая затем участвует в реакциях с макромолекулами. Ряд ксенобиотиков-лекарств способны к нековалентным взаимодействиям с макромолекулами клетки, в результате которых они реализуют свой лекарственный эффект.
Многие ксенобиотики и/или продукты их клеточного метаболизма флуоресцируют. Химическая модификация структуры, образование ковалентных и нековалентных комплексов приводит к характеристичным изменениям в спектрах флуоресценции ксенобиотиков, что делает их привлекательными объектами для исследования методами МСФ. Возможность измерения с высокой чувствительностью спектральных характеристик флуорофоров в живых клетках, как было показано, создает уникальную основу для анализа накопления ксенобиотиков, идентификации продуктов метаболизма и молекулярных комплексов наряду с выявлением внутриклеточной локализации исходных молекул, их метаболитов и комплексов. В ряде случаев эти исследования были успешно дополнены анализом внутриклеточного транспорта, протекания реакций и изменения локализации флуорофоров, как функции времени.
Естественно, что до 90-х годов из-за слабой автоматизации эксперимента, эти исследования были ограничены измерением спектров в нескольких точках или зонах (например, цитоплазма-ядро) клетки в зависимости от пространственного разрешения микроспектрофлуориметра. Кинетические измерения выполнялись путем повторного измерения спектров в тех же точках (зонах) через заданные промежутки времени. Статистическая достоверность исследований достигалась проведением измерений на ограниченной выборке клеток. Флуоресцентные изображения распределения ксенобиотиков в клетках регистрировали на основе интегрального сигнала, спектральный анализ из-за технических ограничений того времени для измерения изображений не использовался.
Справедливости ради, надо отметить, что еще на начальном этапе развития флуоресцентной микроскопии (40-е годы прошлого столетия) предпринимались успешные попытки использовать спектральный анализ в сочетании с микроскопией для изучения тканевого распределения некоторых канцерогенов. Так Меллорс и Глинка использовали метод МСФ для обнаружения канцерогенного Р-нафтиламина в клетках слизистой мочевого пузыря и даже характеризовали профиль распределения 0-нафтиламина в ткани, показав с привлечением спектрального анализа, что характеристичная флуоресценция этого соединения простирается от наружного до внутреннего или базального слоя слизистой [34]. Спектры и профили их распределения они регистрировали фотографическим методом. Одно направление фотопластины использовали для развертки спектров, а вдоль другого - проецировали спектры от разных областей исследуемого объекта (Рис. 1.6). МСФ-исследовтшя полициклических ароматических углеводородов (ПАУ) С помощью МСФ было показано, что бензо[а]пирен (ВаРуг) накапливается в цитоплазме клеток L и BRL, а при длительных временах инкубации его флуоресценция наблюдается и в ядре [35]. ВаРуг способен в процессе метаболизма образовывать более 40 различных производных. Анализ спектров флуоресценции ВаРуг в живых клетках первоначально привел исследователей к выводу, что форма и максимумы внутриклеточного спектра больше соответствуют 3-гидрокси-бензо[а]пирену, чем ВаРуг [36-38]. Это было воспринято, как успешная демонстрация возможности исследования метаболизма ПАУ в живых клетках. Позднее выяснилось, что после поправки на приборные искажения и вклад спектра собственной клеточной флуоресценции внутриклеточные спектры напоминают спектр ВаРуг в растворе, хотя и с некоторыми отличиями [35].
Наличие сигнала продуктов метаболизма удалось обнаружить в общем спектре живых фибробластов RTG2, проинкубированных с ВаРуг. Спектры этих клеток являлись суперпозицией сигналов собственной клеточной флуоресценции, ВаРуг и двух метаболитов: 3-гидрокси- бензо[а]пирена и 9-гидрокси- бензо[а]пирена [39]. В отличие от фибробластов RTG2, спектр фибробластов ЗТЗ был простой суперпозицией сигналов собственной клеточной флуоресценции и ВаРуг [39], что указывает на вариабельность интенсивности метаболизма ВаРуг в разных клетках.
Методом МСФ были исследованы отличия в скорости де-токсификации фибробластов ЗТЗ, обработанных ВаРуг и дибензо[с, п]акридином [40]. Измерялась кинетика убывания внутриклеточной флуоресценции изучаемых ПАУ, которую приписывали действию системы клеточных многофункциональных оксидаз (mixed-function oxidases), даже не обсуждая возможного вклада процессов выведения ПАУ из клеток без их химической модификации. Измерения, проведенные в отдельных клетках, анализировались по выборке из нескольких десятков клеток. Было показано, что кинетики де-токсификации сходны для ВаРуг и дибензо[с, Ь]акридина (оба соединения относятся к группе N-гетероциклических ароматических углеводородов). Так как эти два соединения, введенные в клетки совместно, вызывали взаимное конкурентное ингибирование кинетик убывания флуоресценции, сделан вывод об общей для обоих ПАУ системе де-токсификации. Присутствие в клетках 6-аминохризена, представителя ароматических аминов, блокировало де-токсификацию дибензо[с,п]акридина по принципу все-или-ничего, свидетельствуя, по мнению авторов, о независимой системе де-токсификации для 6-аминохризена, активация/функционирование которой блокирует активацию системы ферментов, участвующих в метаболизме дибензо[с, Ь]акридина.
Оценка фотостабилыюсти ЦИХЛ и ЦИБХЛ
Молекулярные взаимодействия, в которых участвует БАС, могут вызывать заметные изменения его спектров флуоресценции или КР. Если объект исследования - живая клетка, то измерение внутриклеточных спектров БАС методом МСФ открывает путь к идентификации и изучению молекулярных взаимодействий и микроокружения БАС в живых клетках. Регистрация внутриклеточных молекулярных взаимодействий БАС, относящихся к лекарственным препаратам, - это ключ к пониманию механизмов их функциональной активности. Такая уникальная возможность привлекала и продолжает привлекает многих исследователей, однако применяемые на основе МСФ методические подходы имеют ряд серьезных недостатков: (і) часто измеряют усредненные спектры от всей клетки, ядра или цитоплазматической области, что приводит к потере информации об особенностях молекулярных взаимодействий на субмикронном уровне и о пространственном распределении комплексов; (и) сходные недостатки и у подходов, основанных на измерении спектров в 5-15 произвольно выбранных точках клетки (ядра); (Ні) во многих случаях не используется конфокальная система фильтрации сигнала, что резко снижает пространственное разрешение; (iv) методики анализа изменений во внутриклеточных спектрах БАС необоснованно упрощены и практически не разработаны; (v) недавно появившиеся в составе коммерческих ЛСКМ спектральные модули измеряют спектры с шагом (спектральным разрешением) несколько нм, что во многих случаях недостаточно для анализа изменений в спектрах, вызванных молекулярными взаимодействиями БАС.
Разработанный в данной диссертационной работе, оригинальный подход к изучению внутриклеточных взаимодействий и микроокружения БАС с применением метода КОМИРСИ основан на измерении полных спектров в каждой точке живой клетки с ЗМ субмикронным разрешением. При анализе измеренного массива спектров сначала необходимо выявить отличия во внутриклеточных спектрах изучаемого БАС и по возможности определить локализацию соединения с измененными спектрами. Знание локализации или хотя бы характера распределения тех или иных измененных спектров дает подсказку, какие молекулярные взаимодействия следует моделировать в первую очередь. Например, способность БАС проникать в ядро и наличие в ядре измененных спектров подсказывает необходимость моделирования комплексообразования с ДНК.
На следующем этапе в растворах проводится детальное исследование изменений в спектрах, которые вызывают те или иные молекулярные взаимодействия БАС. Измерения спектров от растворов выполняются с помощью конфокального сканирующего микроспектрометра при той же длине волны возбуждения, что и клеточные эксперименты. Наш опыт показывает, что в растворах можно охарактеризовать способность БАС связываться с ДНК, РНК, белками и липидными структурами и установить, как сказываются на спектрах эти взаимодействия [77, 87, 88, 90-94]. Кроме того, необходимо исследовать, как изменение параметров микроокружения (гидрофобность, полярность, рН среды) отражается в спектрах БАС [87, 91, 95, 96]. В ряде случаев полезным оказывается комбинированное исследование комплексообразования и влияния параметров микроокружения (в первую очередь, рН). Молекулярные взаимодействия и влияние микроокружения могут вызывать сдвиг, изменение формы спектров, усиление или тушение интенсивности флуоресценции. Все эти спектральные изменения обязательно принимаются во внимание при анализе внутриклеточных спектров. Сдвиг и изменение формы учитываются автоматически при разложении экспериментальных спектров на базисные, а поправка на тушение/ усиление интенсивности вводится после реконструкции спектральных изображений, путем умножения шкалы интенсивности изображения на соответствующий коэффициент. В выполненных нами исследованиях [77, 78, 85-89, 91, 97] показано, что возможно распознавание комплексов с перекрывающимися спектрами, максимумы флуоресценции (положения линий КР) которых отличаются всего на 5-7 нм (5 см"1). На рисунке 2.14 приведены примеры анализа методом КОМИРСИ молекулярных взаимодействий октакарбоксифталоцианина кобальта в клетках А549 по спектрам резонансного КР.
Измеренные в растворах, спектры, соответствующие различному микроокружению и взаимодействиям БАС, вводятся в качестве спектров сравнения для идентификации внутриклеточного состояния БАС. Те модельные спектры, которые подходят для описания внутриклеточных спектров БАС, остаются в базисном наборе, а остальные модельные спектры выводятся из рассмотрения. В результате такого анализа выявляются комплексы и микроокружение БАС, реализующиеся в клетках и распознаваемые по спектрам, и определяется базисный набор спектров сравнения, наиболее точно описывающий внутриклеточные состояния и взаимодействия изучаемого соединения.
При необходимости в базисный набор спектров сравнения включается также спектр(ы) собственной флуоресценции клетки. В общем случае этот спектр берется из спектрального изображения контрольных клеток, не подвергавшихся инкубации с БАС. Иногда БАС может стимулировать усиление в клетке эндогенной флуоресценции, спектр которой отличается от флуоресценции в контрольных клетках. Тогда, убедившись, что новый сигнал не имеет отношения к продуктам метаболизма БАС, соответствующий спектр берется из спектрального изображения клеток инкубированных с БАС и вводится в базисный набор спектров сравнения. Как правило, внутриклеточные спектры являются суперпозицией нескольких сигналов, так как в измеряемых микрообъемах одновременно присутствуют разные флуорофоры и их комплексы, и относительный вклад их в общий сигнал варьируется от точки к точке. Поэтому для базисного набора выбирается наиболее интенсивный спектр эндогенной флуоресценции с минимальным вкладом посторонних сигналов, причем вклад этот аккуратно вычитается.
Если в клетках наблюдаются сигналы, которые не описываются модельными спектрами исходного БАС и не относятся к эндогенной клеточной флуоресценции, встает вопрос о возможном образовании флуоресцирующих продуктов метаболизма. В ряде случаев проведение модельных исследований с использованием доступных ферментов позволяет подтвердить [87] или опровергнуть [91] гипотезу об образовании детектируемого по внутриклеточным спектрам метаболита и в случае успеха дополнить базисный набор недостающим спектром сравнения. Альтернативно, возможна экстракция из клеток всех продуктов метаболизма БАС, их хроматографическое разделение и идентификация по масс-спектрам [98]. Последующее измерение спектров флуоресценции выделенных метаболитов в растворе способно помочь идентифицировать наблюдаемые в клетках сигналы. В общем случае, это не простая задача, особенно, если подобно митоксантрону (МИТО, [98]) БАС образует более десяти различных метаболитов, и только один из них проявляется в спектральных изображениях [85, 87, 89, 97].
В конечном итоге 2М массив клеточных спектров раскладывается на линейную комбинацию базисных спектров сравнения. Интенсивность базисных спектров характеризует в каждой точке клетки состояние (микроокружение) исследуемого соединения и присутствие его различных комплексов. Реконструированные карты распределения по клетке этих состояний и комплексов описывают накопление, микроокружение и взаимодействия изучаемого соединения в различных клеточных доменах и структурах.
Накопление и распределение H2PCS2.4 в живых раковых клетках, как основа его фотодинамической активности
Гистологический анализ особенностей роста исследованных опухолей был выполнен к.б.н. Т.А. Кармаковой (МНИОИ им. П.А. Герцена). Согласно этому анализу перевитые подкожно клетки ЕС, LLC, Р388 и В16 проявляют быстрый агрессивный рост и в конечном итоге формируют плотные отчетливо прощупывающиеся узлы. Не смотря на отличия в гистогенезе (LLC и ЕС являются эпителиальными опухолями, Р388 -лимфоидный лейкоз, В16 - меланома), подкожный рост опухолей демонстрирует много общих морфологических особенностей. Стромальный компонент и капилляры в опухолевых узелках не встречаются. Основное кровоснабжение опухолевых клеток обеспечивается гиперплазийной сетью кровеносных сосудов, расположенных в псевдокапсуле, образованной соединительной тканью. Хотя некоторые сосуды были обнаружены на периферии опухолевой массы, они скорее всего относятся к существовавшим до прививки опухоли капиллярам подкожной жировой ткани, которая теперь заглублена в опухолевый узел в областях агрессивного роста злокачественных клеток. Как следствие быстрого роста и недостаточного кровоснабжения опухолевых клеток, в центральной части опухолевых узелков образуются зоны некроза. Обычно граница роста опухоли хорошо очерчена и легко распознается, однако в некоторых областях опухолевые клетки проникают в окружающие ткани. Инвазии подвергаются и кожные структуры, и мышечный слой, прилежащие с двух сторон к опухоли. Инвазия опухолевых клеток в соседние ткани наиболее выражена для Р388.
Рассматривая отдельные особенности опухолей, необходимо отметить, что упаковка клеток ЕС плотнее, чем клеток Р388 и LLC. Как результат, образование областей некроза является особенностью ЕС даже на ранних стадиях роста опухолевого узла. Опухолевые узелки В16 образованы рыхлой сетью клеток.
Соединительная ткань, окружающая опухоли, имеет довольно гетерогенную структуру. Помимо многочисленных обедненных клетками отечных областей, эта ткань характеризуется плотной волокнистой структурой с множеством пролиферирующих фибробластов. В некоторых случаях наблюдалось обильное проникновение мононуклеарных клеток, главным образом макрофагов, в периферическую зону опухолей и прилежащие к ним ткани. В тканях непосредственно соседствующих с опухолью наблюдались явные признаки реактивных изменений, вызванных ростом опухоли.
Распределение H2PCS2.4 в ЕС, LLC, Р388 и В16 показано на рисунках 4.16-4.19. В таблице 4.8 суммированы данные по относительному накоплению H2PCS2.4 в исследованных опухолях, различных тканевых структурах, прилежащих к опухолевым узелкам и в удаленных от опухоли здоровых тканях. Представленные данные свидетельствуют о предпочтительном накоплении H2PCS2.4 в злокачественных тканях (опухолевых клетках и прилежащих тканях) по сравнению со здоровыми тканями (кожа, мышцы). Исследуя здоровые ткани, наблюдали одинаково слабое окрашивание кожи, скелетных мышечных волокон и соединительной ткани, в то время как уровень накопления H2PCS2.4 в жировой ткани был в 2-3 раза выше и сравним с уровнем накопления H2PCS2.4 в жировой ткани, прилежащей к опухоли (Табл. 4.8).
Для эффективной ФДТ очень важно, что H2PCS2.4 значительно накапливается в опухоли, и это свойство сохраняется для опухолей различного происхождения (Рис. 4.16-4.19). Накопление ФС в клетках ЕС и LLC заметно выше, чем в большинстве типов тканей, окружающих опухоли, за исключением кожных структур (Табл. 4.8). В то же время окрашивание клеток Р388 и В16 исследуемым H2PCS2.4 было сравнимым с окрашиванием прилежащей соединительной ткани. Относительные средние концентрации красителя в опухолевых узелках ЕС и LLC были практически равны и превышали в 1,4 и 2 раза соответствующие концентрации в В16 и Р388. Эти отличия могут быть приписаны индивидуальной способности конкретных типов опухолевых клеток накапливать H2PCS2.4. В пользу этого свидетельствуют данные, представленные в разделе IV.2.2, о том что проникновение H2PCS2.4 в культивируемые клетки Raji, А549 и НЕр2 варьируется в 3 раза. Отметим, усиленное накопление H2PCS2.4, как правило, наблюдалось в областях некроза опухоли. Эти области часто обнаруживались в центральной части больших узлов ЕС, но мы их не включали в расчет коэффициента накопления ФС в опухоли.
На микро-уровне распределение H2PCS2.4 в опухолевой ткани было гетерогенным (Рис. 4.16-4.19), а окрашивание периферических областей опухоли - довольно однородным. Рассматривая в качестве примера LLC (Рис. 4.20), видно, что концентрация H2PCS2.4 убывает по мере удаления от кожи вглубь опухолевого узелка. В результате, накопление ФС в опухоли со стороны кожи в 2-3 раза выше, чем с другой стороны на границе с соединительной тканью и слоем мышц. Упоминавшееся выше малое количество кровеносных сосудов в самой опухоли, по-видимому, является основной причиной наблюдаемого профиля распределения. Проникновение H2PCS2.4 в опухолевый узел в этом случае определяется концентрацией ФС на границе опухоли, и эта концентрация выше в коже, чем в соединительной ткани и мышечных клетках (Табл. 4.8). Монотонный характер профиля распределения без минимума в центре большого опухолевого узла указывает на то, что к 24 ч после инъекции устанавливается равновесное распределение H2PCS2.4 в опухоли. Накопление ФС в областях проникающего роста опухоли было в 2 раза выше, чем на границе плотного опухолевого узелка и заметно зависело от близости кровеносных сосудов. Например, в случае Р388 накопление H2PCS2.4 в опухолевых клетках, окружающих сосуд было в 3 раза выше, чем в зонах опухоли удаленных от сосуда (Рис. 4.18). К моменту наблюдения сами кровеносные сосуды уже практически свободны от H2PCS2.4 (Табл. 4.8).
Как упоминалось выше, ткани, окружающие опухолевые узлы, накапливают H2PCS2.4 значительно больше, чем аналогичные здоровые ткани. Известно, что рост опухоли существенно влияет на нормальный метаболизм и структуру тканей, и это, по-видимому, является первопричиной наблюдаемого контраста.
Фотоиндуцированная цитотоксичность ЦИХЛ и ее сопоставление со свойствами ЦИХЛ
Таким образом, нами обнаружено, что, варьируя структуру заместителей, можно влиять на внутриклеточное распределение ЦИХЛ. Это обеспечивает выбор ФС с отличающимся внутриклеточным распределением, а также позволяет изучить особенности развития фотодинамического эффекта, который первоначально иницируется в функционально разных органеллах. Анализ структуры ЦИХЛ (Рис. 4.30) и их внутриклеточной локализации (Табл. 4.13) показывает, что усиление накопления ФС в аппарате Гольджи осуществимо с помощью введения полярных групп в цикл Е при сохранении отрицательного заряда в цикле D. Усиление накопления ФС в липидных каплях достигается метилированием остатка пропионовой кислоты в цикле D и введением гидрофобных заместителей в цикл Е. Обнаруженные исключения -накопление нейтрального производного 4 в аппарате Гольджи, а отрицательно заряженного 6 - в липидных каплях, показывают, что внутриклеточная сортировка ЦИХЛ очень чувствительна к структуре конкретных заместителей. В то же время локализация 6 - в липидных каплях не является доминирующей и сопровождается характерным концентрированием в аппарате Гольджи. Интересно, что замена метилкарбоксильного заместителя (соединение 6) на этилкарбоксильный (соединение
7) полностью устраняет накопление в липидных каплях. Электрон-акцепторные заместители в цикле А, такие как СНО и CH=NOH, не меняют внутриклеточную локализацию ЦИХЛ. Наличие 18-гидрокси-группы также не влияет на локализацию соединения 15 по сравнению с 1.
Специально проведенные исследования показали, что характерное внутриклеточное распределение 5, 10 и 11 с концентрированием в липидных каплях наблюдалось уже через 2 мин после начала инкубации клеток, и локализация в липидных каплях сохранялась в течение последующих 24 ч инкубации клеток, меняясь количественно в течение первых двух часов инкубации. Диффузное распределение 1-3, 7 и 9 наблюдалось уже через 15-20 мин после начала инкубации. Эксперименты, проведенные с 4, выявили, что диффузное распределение формируется уже через 5 мин после начала инкубации, то есть даже на ранних сроках не проходит через накопление в липидных каплях. Диффузное распределение с концентрированием в аппарате Гольджи сохраняется в течение последующих 23 ч инкубации клеток с ЦИХЛ-производными 1-4, 7 и 9, изменяясь только количественно в течение первых полутора часов инкубации в случае 1-3,7 и 9, а также в течение первых 4 ч инкубации в случае 4. Внутриклеточные спектры флуоресценции ЦИХЛ, накапливающихся в аппарате Гольджи и в ЭР отличались только по интенсивности, совпадая по форме и максимуму со спектрами этих же производных в эмульсии Кремофора (Рис. 4.38, 4.39, 4.41, 4.42). Отметим, что в большинстве случаев для каждого из изученных соединений в отдельности спектры эквимолярных растворов в эмульсии Кремофора, в мицеллах Тритона Х-100 и лецитиновых липосомах были очень похожи даже по интенсивности (см., например, Табл. 4.10). Следовательно, различное липидо-подобное окружение обеспечивает очень сходные спектральные характеристики ЦИХЛ, и внутриклеточные спектры ЦИХЛ-производных соответствуют мембранно-связанной форме. Это делает возможным количественный анализ внутриклеточной концентрации ЦИХЛ с применением метода КОМИРСИ на основе калибровочных зависимостей, измеренных для ЦИХЛ в эмульсии Кремофора.
Отмечу, что между собой ЦИХЛ отличались и по экстинкции, и по интенсивности флуоресценции. Для каждого из этих соединений проводилось независимое измерение калибровочных зависимостей, необходимых для расчета внутриклеточных концентраций.
Для отдельных соединений обнаружены характерные особенности внутриклеточных спектров, отличающие их от других ЦИХЛ. Так, например, внутриклеточные спектры соединения 3 лучше описывались модельными спектрами в мицеллах заряженных детергентов (Табл. 4.10). Это позволило предположить, что 3 связывается с мембранами поблизости от заряженных молекул. Соответственно, количественный анализ 3 в клетках выполняли на основе калибровочных зависимостей, измеренных для 3 в мицеллах SDS.
В липидных каплях у соединений 5, 6, 10 и 11 появляются измененные спектры флуоресценции, сдвинутые на несколько нм в голубую область по сравнению со спектрами в аппарате Гольджи и ЭР (Рис. 4.41, 4.42), в липосомах, мицеллах Тритона Х-100 и эмульсии Кремофора (Табл. 4.10). Детальные модельные эксперименты показали, что этот сдвиг спектров нельзя объяснить ни взаимодействием с белками, ни влиянием рН, ни наличием заряженных групп на поверхности мембран, ни действием эстераз на метиловый эфир в заместителях R3, ни моделированием гидрофобного окружения растворителями различной полярности.
Воспроизвести в эксперименте микроокружение 5, 6, 10 и 11, характерное для липидных капель, и подойти вплотную к объяснению причины, вызывающей голубой сдвиг спектров флуоресценции 5, 6, 10 и 11, удалось при анализе связывания ЦИХЛ с компонентами плазмы крови и эмбриональной телячьей сыворотки [93].
При связывании соединений 5, 6, 10 и 11 с липопротеинами плазмы крови или сыворотки спектр флуоресценции сдвигается на несколько нм в голубую область, по сравнению со спектром этих ЦИХЛ в эмульсии кремофора. Для большинства заряженных ЦИХЛ, исключая 6, спектры флуоресценции в эмульсии кремофора, в комплексах с липидами и липопротеинами совпадают. Таким образом, микроокружение 5, 6, 10 и 11 во внутриклеточных липидных каплях и в комплексах с липопротеинами очень похоже и довольно уникально, т.к. не поддается воспроизведению в традиционных модельных системах.
При исследовании соединений со смешанным диффузно-гранулярным распределением методом КОМИРСИ каждый внутриклеточный спектр 5, 6, 10 и 11 представляли в виде линейной комбинации двух спектров, характерных для мембранного микроокружения и микроокружения в липидных каплях. Например, для соединения 6 (Рис. 4.42) это были спектры с максимумами 716 и 711 нм, а анализ проводили для компонентов 6д (диффузно распределенный 6 в липидоподобном ОКруЖеНИИ, Xem=716 НМ) И 6 К (6 В ЛИПИДНЫХ КаПЛЯХ, Я-ст= 711 нм). Внутриклеточную концентрацию 5, 6, 10 и 11 рассчитывали на основе калибровочной зависимости, измеренной для этих соединений в 1% эмульсии Кремофора, в приближении, что эквимолярные концентрации каждого из соединений 5, 6, 10 или 11 в мембранном микроокружении и в липидных каплях имеют равную интегральную интенсивность спектра.
