Содержание к диссертации
Введение
1 Изоэлектрическое фокусирование 8
1.1 Растворы электролитов и движение частиц в них 8
1.1.1 Электролиты 8
1.1.2 Неравновесные процессы и массоперснос в растворах электролитов 15
1.1.3 Электрофорез 20
1.2 Принципы метода изоэлектрического фокусирования . 24
1.2.1 Изоперихорическое фокусирование 24
1.2.2 Изоэлектрическое фокусирование 28
1.2.3 Уравнение изоэлектрического фокусирования . 31
1.3 Способы создания градиентов рН 34
1.3.1 Амфолиты-носители 34
1.3.2 Термальные градиенты рН 39
1.3.3 Борат-полиольные градиенты рН 40
1.3.4 Градиент рН, индуцированный градиентом диэлектрической проницаемости 45
1.3.5 Иммобилизованные градиенты рН 46
1.3.6 Градиенты рН, образующиеся за счёт диффузии неамфотерных буферных растворов 47
2 Электродиффузионные градиенты концентраций ионов в неподвижной среде 50
2.1 Формальное теоретическое описание 50
2.2 Упрощение системы уравнений Нернста-Планка и Пуассона 57
2.3 Точное электронейтральное решение 61
2.4 Приближённо-электронейтральное решение 64
2.5 Решение электродиффузионных уравнений по методу асимптотических разложений 69
3 Электродиффузионные градиенты концентраций ионов в движущейся среде 78
3.1 Формальное теоретическое описание 78
3.2 Приближённое решение уравнений электродиффузии для движущейся среды 82
4 Электрофокусирование слабых электролитов в движу щейся среде 88
4.1 Принцип неизоэлектрического фокусирования 88
4.2 Распределение сконцентрированных частиц 93
4.3 Условия фокусирования 95
Выводы 100
Литература 103
- Неравновесные процессы и массоперснос в растворах электролитов
- Градиент рН, индуцированный градиентом диэлектрической проницаемости
- Решение электродиффузионных уравнений по методу асимптотических разложений
- Приближённое решение уравнений электродиффузии для движущейся среды
Введение к работе
Актуальность работы
В биофизике, молекулярной биологии и биохимии большое значение имеют методы фракционирования, концентрирования и идентификации веществ биологического происхождения. Многие из этих веществ являются слабыми электролитами, благодаря чему широкое распространение получили электрофоретические методы их разделения и очистки.
Для веществ цвиттер-ионной природы, прежде всего белков, особенно эффективен метод изоэлектрического фокусирования, позволяющий с высокой точностью разделять вещества на основе различия их изоэлек-трических точек (которые для белковых молекул являются практически индивидуальной характеристикой каждого вида белков). Основной трудностью этого метода является создание градиента рН, в котором проводится электрофорез разделяемых молекул.
Существует ряд методов создания градиентов рН для изоэлектрического фокусирования, но все они обладают теми или иными недостатками и ограничениями. Поэтому актуальна задача разработки новых методов создания градиентов рН для изоэлектрического фокусирования.
Для слабых электролитов не цвиттер-ионной природы также актуальна задача разработки методов их разделения, подобных изоэлектри-ческому фокусированию, то есть позволяющих фокусировать вещества в узкие, не уширяющиеся в процессе фракционирования зоны, разделяя вещества на основе их индивидуальных характеристик (таких, например, как константа диссоциации).
Цель работы
Теоретическое исследование электродиффузионных (формирующихся за счёт электромиграции и диффузии ионов электролита) градиентов концентраций ионов, в частности, градиентов рН, в неподвижной и движущейся среде. Теоретическое исследование пригодности таких градиентов в качестве градиентов рН для изоэлектричсского фокусирования и возможных модификаций этого метода. Теоретическое исследование возможности электрофокусирования нсамфотерных слабых электролитов.
Задачи исследования
Решение уравнений, описывающих электродиффузионные распределения концентраций ионов в неподвижной и в движущейся среде. Анализ полученных решений в аспекте пригодности этих распределений концентраций ионов в качестве градиентов рН для изоэлектричсского фокусирования и его возможного аналога для неамфотерных слабых электролитов. Решение уравнений, описывающих распределение концентрации слабого электролита в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов. Теоретическое описание электрофокусирования слабых электролитов в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов. Определение необходимых и достаточных условий фокусирования.
Положения, выносимые на защиту:
1. На основе уравнений электродиффузии получены формулы, позволяющие рассчитывать форму самоформирующихся стационарных электродиффузионных градиентов концентраций ионов в неподвижной и в движущейся среде.
Теоретически показано, что электродиффузионные градиенты рН могут использоваться для изоэлектрического фокусирования белков и других амфотерных цвиттер-ионов.
Теоретически показана возможность электрофокусирования слабых электролитов в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов.
Научная новизна
Проведено исследование решений электродиффузионных уравнений, описывающих распределение концентраций ионов электролита в элек-трофоретической камере. Определены необходимые и достаточные условия, при которых эти уравнения имеют точное электронейтральное решение. Получено приближённое решение для случаев несоблюдения строгой электронейтральности.
Предложен способ электрофокусирования слабых электролитов в среде, движущейся относительно градиента концентрации рабочих ионов. Определены необходимые и достаточные условия фокусирования. Проведено теоретическое исследование электродиффузионных градиентов концентраций ионов, которые могут быть предложены для использования в этом методе.
Практическая значимость работы
Проведённое исследование электродиффузионных распределений концентраций ионов свидетельствует о применимости их в качестве градиентов рН для изоэлектрического фокусирования, что является вкладом в доведение до практического использования электродиффузионного метода создания градиента рН для изоэлектрического фокусирования.
Предложенный способ электрофокусирования слабых электролитов может быть эффективен для разделения неамфотерных слабых электролитов биологического происхождения.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 11 статей и тезисов докладов.
Апробация работы. Основные положения диссертации были представлены на III, IV и VI Всероссийских семинарах «Моделрование неравновесных систем» (Красноярск, 2000, 2001, 2003 гг.).
Объём и структура диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, выводов и списка литературы. Материал диссертации изложен на 109 страницах машинописного текста, включая 13 рисунков и список литературы из 52 наименований.
Неравновесные процессы и массоперснос в растворах электролитов
Частицы раствора, ионы и молекулы растворителя находятся в постоянном движении, совершая хаотические перескоки с одного места на другое. В условиях равновесия все перемещения частиц оказываются, в среднем, скомпенсированными, и макроскопического движения вещества не происходит. Соблюдение ионных равновесий в растворах также означает, что скорости прямой и обратной реакций одинаковы, реакции компенсируют друг друга, и концентрации ионов и недиссоциированных молекул в растворе остаётся постоянной. Неравномерное распределение концентраций частиц в растворах, наложение электрического поля на раствор электролита, а также изменение состава раствора по отношению к равновесной концентрации — эти факторы, по отдельности или все вместе, могут вызывать неравновесные явления в растворах электролитов. При этом в растворе будет происходить макроскопическое движение вещества, изменение концентраций частиц раствора в пространстве или с течением времени [14]. Движущей силой массопереноса частиц в растворах электролитов является градиент электрохимического потенциала. Его составляющие — градиент химического потенциала, обусловливающий диффузию частиц, и величина, пропорциональная градиенту электрического потенциала, вызывающему миграцию ионов. Для г -того вида частиц электрохимический потенциал Д,- выражается формулой: Здесь щ — химический потенциал частиц г-того вида, F — постоянная Фарадея, Zi — зарядовое число ионов г-того вида, (р — электрический потенциал.
Для нейтральных молекул, разумеется, Д$ = /zt-. Поток частиц г-того вида J,- (определяемый, как количество вещества, проходящее за единицу времени через единичную площадь, перпендикулярную направлению движения вещества) пропорционален градиенту электрохимического потенциала, умноженному на концентрацию частиц г-того вида СІ: Коэффициент пропорциональности щ называется подвижностью. Подвижность представляет собой среднюю скорость перемещения частиц в растворе, при действии единицы силы на моль частиц данного вида, независимо от природы силы [14, 29]. Вообще говоря, поток вещества формируется не только электродиффузионным массопсрсносом, обусловленным градиентом химического потенциала. Механическое движение всей массы раствора, конвекция, также могут давать вклад в поток. Тогда поток частиц г-того компонента раствора будет описываться уравнением (здесь для удобства выражение V//t- расписано с учётом (1.10)): где v — объёмная скорость течения жидкости. Таким образом, правая часть уравнения (1.11) содержит три слагаемых, которые соответствуют трём механизмам массопереноса. Первый из них — диффузия, обусловленная градиентом химического потенциала (то есть, неравномерностью распределения вещества в растворе), описываемая членом — ЩСІ V/z,-. Другой — миграция ионов в электрическом поле (электромиграция), выраженная вторым слагаемым {—UiCiZiF V95). Ещё один возможный механизм массопереноса — течение жидкости, описываемое слагаемым c,v.
Изменение концентраций вещества в заданной точке раствора при протекании неравновесных процессов в растворе описывается уравнением материального баланса: Здесь Ri — источник (или сток) г-того вещества, обусловленный гомогенными химическими реакциями в растворе, t — время. В уравнение (1.11) и, следовательно, в (1.12) входит электрический потенциал ср, находимый из уравнения Пуассона [29, 18]. Таким образом, наиболее общее описание массопереноса и распределения частиц в растворе даётся системой уравнений: Здесь є — диэлектрическая проницаемость растворителя, SQ — электрическая постоянная. Уравнение (1.13) представляет собой (1.12), переписанное с учётом бездивергентного характера векторного поля скоростей v. А (1.14) — это уравнение Пуассона, записанное через концентрации. При отсутствии конвекции и химических реакций правую часть уравнения (1.13) можно считать состоящей только из члена V (щс{ V//t). Для низких концентраций растворённых веществ выражение с,- V//j имеет простой вид, поскольку можно пользоваться выражением для химического потенциала, полученным в приближении бесконечно разбавленных растворов. В этом приближении химический потенциал где R — универсальная газовая постоянная; Т — температура, с,- — концентрация г-того вида частиц; //? = \\т(щ — RTlnci) — стандартный ХН-сі- О мический потенциал [11]. Для умеренно разбавленных и концентрированных растворов Ci V//t- выражается более сложным образом [29]. Однако для концентраций, характерных для электрофоретических камер, в которых проводится электрофорез частиц биологического происхождения, можно считать достаточно адекватным приближение бесконечно разбавленных растворов.
Градиент рН, индуцированный градиентом диэлектрической проницаемости
Известно, что диссоциация электролита зависит от диэлектрической проницаемости среды є. Благодаря этому градиент рН в электрофоретической камере можно создать, создав в ней градиент концентрации какого-либо органического растворителя, что обеспечит градиент диэлектрической проницаемости [40, 43]. Градиент создаётся простым смешением (с помощью градиентного смесителя) буферного раствора (обычно, ацетатного буфера) с растворителем в изменяющейся концентрации. В качестве растворителя лучше всего подходит глицерин, что связано с минимальностью его влияния на структуру белков. Благодаря тому, что нейтральный растворитель неподвижен в электрическом поле, градиент остаётся стабильным в течение длительного времени (экспериментально показана стабильность градиента в течение 12 суток [40]). Данный метод создания градиентов рН проще и доступнее использования амфолитов-носителей и обладает теми преимуществами, что даёт возможность проводить изоэлектрофокусирование в среде с высокой ионной силой, фокусировать низкомолекулярные пептиды и аминокислоты, не требует длительного предварительного электрофореза. Однако интервал рН, на котором создаётся градиент подобным методом, довольно узок — около единицы рН, или менее. П. Ригетти предложил метод создания иммобилизованных градиентов рН для изоэлектрического фокусирования. Иммобилизованный градиент рН в геле создаётся предварительно, перед проведением электрофореза в нём.
Принцип метода заключается в том, что для создания градиента рН используются вещества, молекулы которых имеют в своём составе кислую или оснбвные ионогенную группу (скажем, карбоксильную или аминогруппу) и молекулы эти встраиваются в полимерный гель процессе его полимеризации. Поэтому, если создать с помощью градиентного смесителя градиент концентрации таких молекул в в растворе мономеров полимерного геля, то в результате полимеризации геля в нём получится химически связанный с полимером геля, иммобилизованный градиент концентрации соответствующих ионогенных групп и, тем самым, градиент рН [35, 50]. Поскольку наличие зоны низкой концентраций ионов крайне нежелательно для электрофореза из-за её низкой электропроводности, нужно использовать по меньшей мере два встраиваемых в гель компонента с ионогенными группами, чтобы область низкой концентрации одного из них перекрывалась областью существенной концентрации другого. Так, для создания иммобилизованных градиентов рН в полиакрила-мидном геле, в растворе акриламида перед полимеризацией создаётся градиент концентрации производных акриламида: где в состав радикала R входит карбоксильная группа или третичная аминогруппа. Большим преимуществом иммобилизованных градиентов рН является их стабильность и независимость от процессов, протекающих при электрофорезе, возможность (в определённых пределах) задавать требуемую форму градиента рН. Использование диффузии буферных растворов исторически было первым методом создания градиентов рН для изоэлектрического фокусирования, применявшимся ещё до изобретения метода на основе амфолитов-носителей. Первыми экспериментами, в которых, по сути дела, было осуществлено изоэлектрическое фокусирование в непрерывном градиенте рН, были эксперименты А. Колина, проведённые в середине 1950-х годов.
В них градиент рН создавался при постепенном перемешивании наслоенных друг на друга неамфотерных буферных растворов, различающихся как по плотности (что достигалось с помощью различных концентраций сахарозы, также растворённой в буферном растворе), так и по величине рН. Такой градиент был нестабилен в электрическом поле, поскольку при подаче напряжения на него ионы буферов начинали мигрировать, что приводило к быстрому смещению и изменению формы градиента. Естественно, такой градиент не годился для изоэлектрического фокусирования в течение сколько-нибудь длительного времени, однако времени его существования (от 40 секунд до нескольких минут в экспериментах Колина) было достаточно, чтобы произвести разделение смеси некоторых белков на набор изоэлектрических линий (сфокусированных зон) [36]. Наилучшие результаты удавалось получить, используя пару буферных растворов с одноимёнными ионами, например два фосфатных буфера с разными исходными рН, между которыми находилась область значений pi разделяемых веществ. Аппарат Колина представлял собой U-образную ячейку, каждое колено которой сообщалось со своей электродной камерой. Одно колено U-образной ячейки заполнялось более кислым, другое — более щелочным буферным раствором, разделяемое вещество помещалось на границе между ними [35]. Намного более стабильный градиент рН позднее продемонстрировал в своих экспериментах S. Pollack [49]. Изоэлектрическое фокусирование белков производилось в трубке с полиакриламидным гелем, находящейся между анодной и катодной камерами, заполненными, соответственно слабой кислотой (0,1 М уксусной кислоты) и слабым основанием (0,1 М ТРИС (рН 9,5)). Эксперименты показывали, что в трубке устанавливался градиент рН. Это подтверждалось как непосредственными измерениями рН в трубке, так и фокусированием белков в узкие зоны, взаимное расположение которых соответствовало их изоэлектрическим точкам.
Решение электродиффузионных уравнений по методу асимптотических разложений
Как уже отмечалось выше, для системы электродиффузионных уравнений характерно, что множитель при производной в одном из уравнений системы (а именно, в уравнении Пуассона (2.6Ь)) чрезвычайно мал. Это особенно наглядно выглядит при записи системы в безразмерном виде (2.9), где малым параметром является /і2: Таким образом, система электродиффузионных уравнений является сингулярно-возмущённой, и это позволяет использовать для её ре- шения приближённые методы, разработанные в теории сингулярно-возмущённых дифференциальных уравнений. Для многих классов сингулярно-возмущённых уравнений решение задачи Коши и краевых задач могут быть найдены в виде асимптотических разложений по степеням малого параметра при производной [5, 6, 8]. Будем решать краевую задачу, состоящую из уравнений (2.26) и граничных условий, которыми заданы определённые значения s+r=(b Метод приближённого решения краевых задач такого вида описан в статье А.Б.Васильевой [7]. 0dy Сделаем замену переменных: з = ju-г! О — РУ- В новых переменных уравнения (2.26) примут вид: и будем искать решение краевой задачи (2.27), (2.29) методом, описанным в [7]. Ограничимся при этом нулевым приближением, то есть, будем искать приближённое решение с точностью до слагаемых порядка fi, пренебрегая слагаемыми величиной порядка \i и более высоких порядков малости. Поскольку параметр /І очень мал, точность нулевого приближения можно считать достаточно высокой. Решение краевой задачи ищется в виде асимптотического разложения по степеням малого параметра \і.
Это разложение представляет собой трёх степенных рядов по \1\ (X означает з, 9, s+ и s- в совокупности). Ряд X, называемый регулярной частью, представляет собой ряд по степеням \i с коэффициентами, зависящими от г, и описывает плавные изменения X вне близости границ. Ряд ИХ, называемый левым пограничным рядом, представляет собой ряд по степеням [і с коэффициентами, зависящими от TQ = jj, (левыми пограничными функциями) и описывает резкие изменения X вблизи левой границы. Ряд QX, называемый правым пограничным рядом, представляет собой тоже ряд по степеням fi, но с коэффициентами, зависящими от т\ = 21 , г (правыми пограничными функциями) и описывает резкие изменения X вблизи правой границы. Таким образом, для нахождения приближённого решения с невязкой порядка \i нужно найти нулевые, а для \) — нулевые и первые члены разложений: Будем полагать, что концентрации ионов на границах электрофорети-ческой камеры таковы же, как и в растворе, которым заполняются электродные камеры. Поэтому будут выполнятся соотношения с+ (0) = с_ (0) и c+(L) = c_(L), а краевые условия для уравнения (2.26) будут (по определению величин с, s+, S-) таковы: В нулевом приближении для регулярных членов получатся уравнения: но s+0 и s-Q пока не определяются и определятся из уравнений для регулярных членов в первом приближении. Левые пограничные функции в нулевом приближении будут опреде- с дополнительными условиями: При этом оказалось, что пограничные функции в нулевом (а для t) также в первом) приближении равны нулю и это является следствием электронейтральных граничных условий (2.29). Таким образом, при этих граничных условиях суммарные концентрации анионов, суммарные концентрации катионов и напряжённость электрического поля в электрофоретиче-ской камере изменяются плавно, без резких изменений в пограничных слоях у границ камеры. Итак, получив в нулевом приближении: и получим тот же результат, который был получен в п. 2.4, когда в электродиффузионных уравнениях членами, содержащими множитель /і2 просто пренебрегли (2.20): Теперь этот результат получен с большей математической строгостью, и, кроме того, точность полученного приближённого решения теперь можно оценить, пользуясь теорией асимптотических разложений сингулярно возмущённых дифференциальных уравнений. Согласно [7], невязка полученного в нулевом приближении решения — величина порядка /І.
Приближённое решение уравнений электродиффузии для движущейся среды
Более определённые результаты теоретического исследования электродиффузионных градиентов концентраций ионов в движущейся среде (аналогично тому, как и в случае неподвижной среды) можно получить, ограничившись рассмотрением систем, в которых все ионы имеют одинаковую валентность: При этом условии все уравнения (3.4) для катионов и все уравнения (3.4) для анионов можно просуммировать, в результате чего система (3.3) сведётся к системе из трёх уравнений: В уравнениях (3.8) и (3.9) присутствует параметр /І2, который чрезвычайно мал. (Это по-прежнему та же самая величина, малость которой была использована в предыдущей главе при получении приближённых решений для распределений концентраций ионов в неподвижной среде.)
Поэтому для нахождения приближённого решения этих уравнений можно пренебречь в них членами, содержащими множитель /І2, получив таким образом аппроксимирующую систему уравнений: Видно, что аппроксимирующие уравнения для s+ и s_ совпадают с точностью до обозначений. Следовательно, s+(r) = s_(r). Решением уравнения (3.10а) будет: Для системы, состоящей из двух видов ионов, распределение концентраций ионов будет описываться непосредственно формулой (3.13). На рисунках 3.1, 3.2 и 3.3 показаны, соответственно, распределения концентраций ионов, форма градиента рН и напряжённость электрического поля в электрофоретической камере, рассчитанные для двухионной системы (раствора НС1), при нескольких различных скоростях течения среды v. Для сравнения на тех же графиках показаны распределения концентраций ионов, градиент рН и Е{х) при v = 0, рассчитанные согласно результатам, полученных для неподвижной среды в п. 2.4 (формулы (2.21а) и (2.21Ь)). Во всех расчётах (для всех значений v) полагалось (0) = 38,1 В/м, то есть, в качестве Е{0) была взята величина, которой в неподвижной среде соответствует разность потенциалов между границами электрофоретической камеры ері = —10 В. Из приведённых графиков видно, что даже небольшие скорости течения жидкости в электрофоретической камере оказывают сильное влияние на форму электродиффузионных распределений концентраций ионов и электрическое поле в ней. В более общем случае, для произвольного числа видов ионов, распределение концентрации любого из них может быть приближённо вычислено с помощью подстановки в формулу (3.5) напряжённости электрического поля, выраженной приближённой формулой (3.14).
