Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор 7
1.1. Современные концепции пищеварения в кишечнике рыб 7
1.2. Характеристика процессов пищеварения рыб 8
1.2.1. Полостное (внеклеточное или дистантное пищеварение) 10
1.2.2. Внутриклеточное пищеварение 12
1.2.3. Мембранное пищеварение 13
1.2.4. Адаптация пищеварительной системы рыб к характеру питания 15
1.2.5. Адаптация пищеварительной системы рыб к температуре 20
1.2.6. Адаптация пищеварительной системы рыб к изменению концентрации водородных ионов в среде обитания. 28
2. Материалы и методы исследования 32
2.1. Характеристика объектов исследования 32
2.2. Техника приготовления ферментативно - активных препаратов и условия проведения экспериментов по исследованию уровня активности пищеварительных гидролаз 39
2.3. Определение уровня активности ферментов 40
2.4. Расчет температурных характеристик ферментативных реакций 46
2.5 Исследование влияния концентрации водородных ионов на активность ферментов 48
2.7. Статистическая обработка данных
3. Влияние температуры инкубации на уровень ферментативной активности слизистой оболочки кишечника лососеобразных рыб 49
3.1. Оценка воздействия различных температур инкубации на уровень активности мальтазы 56
3.2. Воздействие различных температур инкубации на уровень активности а - амилазы
3.3. Изменение уровня активности щелочной фосфатазы при действии различных температур инкубации 63
3.4. Влияние температуры инкубации на уровень активности суммарной протеиназы 69
4. Влияние концентрации водородных ионов на уровень активности пищеварительных ферментов слизистой оболочки кишечника лососеобразных рыб 77
4.1. Воздействие различных значений рН на уровень активности щелочной фосфатазы 77
4.2. Оценка влияния различных концентраций водородных ионов на уровень активности мальтазы 83
4.3. Влияние концентрации водородных ионов на уровень активности суммарной протеиназы 88
4.4. Исследование воздействия различных концентраций ионов водорода на уровень активности амилазы 93
5. Оценка корреляционных зависимостей, характеризующих степень активность пищеварительных ферментов лососеобразных рыб 99
6. Обсуждение результатов 113
Выводы 127
- Характеристика процессов пищеварения рыб
- Техника приготовления ферментативно - активных препаратов и условия проведения экспериментов по исследованию уровня активности пищеварительных гидролаз
- Воздействие различных температур инкубации на уровень активности а - амилазы
- Оценка влияния различных концентраций водородных ионов на уровень активности мальтазы
Введение к работе
Актуальность проблемы. В настоящее время известно, что одними из наиболее важных параметров, определяющих ряд свойств ферментов, является температура и рН среды (Диксон, Уэбб, 1982). Объясняется это тем, что указанные параметры вызывают изменения кинетических характеристик химических реакций и трансформацию структуры активного центра ферментов (Диксон, Уэбб, 1982; Плакунов, 2001). Способность изменять фундаментальные характеристики ферментов, делает указанные факторы важными при изучении процессов биохимической адаптации.
Для гидроэкосистем также установлено, что изменения характеристик биохимических процессов в организмах гидробионтов определяются температурой (Александров, 1975; Голованов, Валтонен, 2000; Голованов, 2001,.и др.) и концентрацией водородных ионов (Кузьмина, Неваленный, 1983; Виноградов, 1986; Иванов и др., 2000, и др.).
Полифункциональность пищеварительной системы, реализующей ряд функций, среди которых необходимо отметить пищеварительную, транспортную, трофическую и эндокринную, с учетом открытости по отношению к воздействию факторов внешней среды (Кузьмина, 1986; Кузьмина, 2000; Туктаров, 2002; Пономарев, Пономарева, 2003, и др.) делает ее одной из наиболее интересных и доступных для исследований такого фундаментального свойства жизни как адаптация.
В течение последних лет появился ряд работ, посвященных как исследованиям температурных адаптации пищеварительных ферментов рыб (Голованов, 2001; Озернюк, 2002), так и влиянию на них различных концентраций водородных ионов (Виноградов, 1986; Иванов и др., 2000; Morgan et al., 2000; Голованова, 2000). Необходимо отметить, что указанные исследования выполнены, как правило, на пресноводных видах рыб, в то время как сведений, касающихся ферментативных адаптации к данным факторам среды у проходных и, в частности, лососеобразных рыб, обитающих как в дальнево сточных, так и южных регионах, являющихся ценными объектами промысла и аквакультуры, ограниченное количество (Швыдкий, 2000; Lee et al., 2003). Цель и задачи исследований. Целью данной работы явилось изучение in vitro влияния температуры инкубации и концентрации ионов водорода на уровень активности некоторых пищеварительных ферментов лососеобразных рыб (Oncorhynchus nerka, O.gorbusha, O.keta, Salvelinus malma, Salmo gairdneri gairdneri, Salmo gairdneri Rich, Stenodus Leucichtys L.).
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Исследовать влияние различных температур инкубации на гидролитическую активность пищеварительных ферментов некоторых видов рыб.отряда лососеобразных (Salmoni formes).
2. Изучить влияние различных концентраций водородных ионов на уровень активности пищеварительных ферментов некоторых лососеобразных рыб.
3. Выявить различия характера ответной реакции гидролитических систем кишечника лососеобразных рыб, обитающих в различных экологических условиях, на действие температуры и концентрации водородных ионов.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые получены данные по исследованию влияния температуры инкубации и концентрации водородных ионов на уровень активности комплекса пищеварительных ферментов (а-амилазы, мальтазы, щелочной фосфатазы, суммарной протеиназы) слизистой оболочки кишечника лососеобразных рыб, обитающих в различных климатических зонах.
Продемонстрированы видовые отличия в уровне ферментативной активности исследуемых лососеобразных рыб при действии на них факторов среды обитания.
Впервые был исследован процесс адаптивных перестроек пищеварительной системы лососеобразных рыб, филогенетически адаптированных к условиям южного аквакомплекса.
Получены регрессионные модели, которые могут использоваться в рыбоводной практике, а также специалистами для изучения вопросов пищева--рения лососеобразных рыб.
Установленные факты могут быть применены для оптимизации условий выращивания лососеобразных рыб.
Апробация работы. Основные положения диссертационной работы представлялись на NPAFC International Workshop "BASIS-2004: Salmon and Marine Ecosystems in the Bering Sea and Adjacent Waters" (Япония, 2004), Международной конференции 6-9 сентября 2004г. (Петрозаводск, 2004), научно-методических конференциях профессорско-преподавательского состава АГТУ в течение 2002-2005 г.г.
Публикации. По теме диссертации опубликовано 7 работ.
Объем и структура работы. Диссертация представлена на 149 страницах машинописного текста, иллюстрирована 43 рисунками и двумя таблицами. Работа состоит из введения, обзора литературы, описания материала и методов исследования, трех глав с изложением собственных результатов исследований, обсуждения результатов, выводов, указателя цитируемой литературы. Список литературы включает 222 источника, в том числе 152 работы отечественных и 69 работ зарубежных авторов.
Выражаю глубокую благодарность своему научному руководителю Не-валенному Александру Николаевичу, а также Туктарову Андрею Валерьевичу и Беднякову Дмитрию Андреевичу за постоянное внимание и помощь при выполнении работы. А также личную благодарность заведующему лабораторией "Прибрежных экосистем" КамчатНИРО Коростелеву Сергею Георгиевичу.
Характеристика процессов пищеварения рыб
Отделы пищеварительной системы рыб могут иметь различное строение в зависимости от типа питания (обзоры: Al-Hussaini, 1949; Строганов, 1969; Kapoor et al., 1975; Веригина, Жолдасова, 1982, и др.). В результате рыбы делятся на две большие группы: 1) имеющие желудок (преимущественно хищники); 2) безжелудочные рыбы (к которым относятся карповые Cyprinidae). При этом, и первые, и вторые могут встречаться в пределах одного семейства и даже рода (Kapoor et al., 1975; Веригина, Жолдасова, 1982, и др.). Морфология пищеварительного тракта рыб в значительной мере зависит от формы их тела. Так, у сома он имеет мешкообразный вид и помещается в относительно небольшом пространстве в передней части тела. У угря, наоборот, пищеварительный тракт вытянут почти по всей длине тела (Строганов, 1962). В зависимости от строения и расположения отдельных частей, Г. Г. Вундш (1937) предложил различать пять типов пищеварительной системы рыб: 1 — лососевый (стенка желудка тонкая, имеется от 80 до 400 пилориче-ских придатков); 2 — окуневый (толстостенная глотка, цилиндрический желудок, 3 пилорических придатка); 3 — щуковый (толстостенный пищевод, удлиненный желудок, печень вытянута в направлении продольной оси тела); 4 — карповый (пищеварительный тракт имеет вид трубки, которая делает несколько петель, передняя часть кишки расширена, желудка нет); 5 —.угревый (узкий мускульный пищевод, печень окружает пищевод). Кишечник у примитивных рыб представлен в простейшей форме и является трубкой, площадь внутренней поверхности которой увеличивается за счет продольной складки, называемой спиральным клапаном. У костистых рыб площадь поверхности кишечника увеличивается за счет продольных петель и пилорических придатков, а также различных по величине и форме складок слизистой оболочки. У большинства рыб длина кишечника близка длине тела, однако у бентофагов и макрофитофагов может превышать длину тела в 2—5 и даже 15 раз. (Пучков, 1954; Халилов, 1969, Kapoor et al., 1975; Веригина, Жолдасова, 1982, и др.). Характер питания оказывает значительное влияние на структурную организацию пищеварительной системы рыб. Наибольшей адаптивной изменчивостью характеризуются производные головной кишки, (рот, ротовая полость, глотка). Однако производные туловищной кишки также способны изменяться под влиянием диеты и пищевого поведения, сформировавшегося в ходе эволюции (Никольский, 1963). Наиболее характерным признаком большинства видов хищных рыб является наличие хорошо развитого желудка и связанного с ним пепсинокислого пищеварения.
Качество корма также оказывает большое влияние на длину кишки и площадь поверхности кишечной слизистой (Al-Hussaini, 1949а; Siankova 1966, и др.). Наибольшая относительная длина кишечника характерна для микрофитофагов и травоядных видов, пища которых содержит большое количество трудноперевариваемых и неперевариваемых компонентов, наименьшая — для хищников. При этом определенное влияние на морфологию пищеварительного тракта могут оказывать филогенетические особенности рыб разных видов. Кроме того, на длину кишечника влияет обеспеченность пищей: у локальных групп, удовлетворительно обеспеченных пищей, длина кишки и вариабельность меньше, чем у рыб, кормовая база которых неудовлетворительна (Kapoor et al, 1975). В связи с отсутствием слюнных желез, процессы пищеварения и всасывания у рыб реализуются, главным образом, в желудке, кишечнике и пилори-ческих придатках (Buddington, Diamond, 1987), куда пища поступает без предварительной химической обработки. Некоторые хищные рыбы глотают пищу целиком даже без предварительной механической обработки (Строганов, 1962). В пищеварительный тракт впадают протоки печени и поджелудочной железы (Шпарковский, 1986), по которым в пищеварительный тракт поступают желчь и продукты секреции поджелудочной железы. Только у хрящевых и осетровых рыб имеется обособленная поджелудочная железа, у костистых же рыб она разбросана в виде островков между кишечными петлями или в печени (в последнем случае орган получил название гепатопанкреас) (Фандж, Гроув, 1989). Необходимо отметить, что диффузное расположение поджелудочной железы не позволяет однозначно решить вопрос о происхождении ряда ферментов (Сорвачев, 1982). Несмотря на огромное разнообразие в строении пищеварительного тракта и различный характер питания, у рыб отмечены все основные типы пищеварения (полостное (внеклеточное или дистантное), внутриклеточное и мембранное, симбионтное и индуцированный аутолиз), также как и у высших позвоночных животных (Кузьмина, 1999; Кузьмина и др., 2000; Кузьмина и др., 2003; Извекова, Лаптева, 2004). 1.2.1. Полостное (внеклеточное или дистантное пищеварение) Так же как и у высших позвоночных животных, полостное пищеварение у рыб осуществляется в полости желудочно-кишечного тракта за счет фер ментов, секретируемых пищеварительными железами (Пучков, 1954; Строга нов, 1962; Краюхин, 1963; Phillips, 1969; Kapoor et al., 1975; Сорвачев, 1982, Фандж, Гроув, 1983; Ojeda, Caceres, 1995 и др.). Энзимы, осуществляющие полостное пищеварение, характеризуются как эндогидролазы (Диксон, Уэбб, 1982), т.е. ферменты, расщепляющие внутренние связи макромолекул пище вых компонентов. У рыб, имеющих желудок, начальные этапы полостного пищеварения протекают в полости желудка, где ферментативные реакции и осуществляются в кислой среде (рН 2-4) в основном за счет пепсина (обзоры: Пегель, 1950; Сорвачев, 1982; Фандж, Гроув, 1983; Аминев, Яржомбек, 1984, и др.). У безжелудочных рыб ферментативные процессы происходят в кишечнике в слабощелочной среде (рН 7,2-7,8) (Щербина, Эрман, 1971). Из желудка пища в полужидком виде порционно попадает в кишечник. Процессы гидролиза в кишечнике осуществляются преимущественно под воздействием ферментов поджелудочной железы (трипсина, химотрипсина, эсталазы, а-амилазы и др.). Важно отметить, что протеолитические фермен- {. ты секретируются в неактивной форме - в виде зимогенов (обзоры: Аминева, Яржомбек, 1984; Уголев, Кузьмина, 1993). Одновременно в процессах поло- стного пищеварения могут принимать участие и такие собственнокишечные ферменты, как ос-амилаза, мальтаза, сахараза, щелочная фосфатазы и другие, появляющиеся в просвете кишечника в результате десквамации энтероцитов (Кузьмина, 1978; Уголев, 1972).
Немаловажное значение в основе начальных этапов расщепления пищи приобретает механизм индуцированного аутолиза (Уголев, 1980; Уголев и др., 1983; Уголев, Цветкова, 1984), возможность участия которого в процессах пищеварения у рыб была открыта совсем недавно (Кузьмина и др., 1999а, б; Кузьмина, Голованова, 2001; Кузьмина и др., 2003; Кузьмина, Скворцова, 2001, 2003). Данный механизм основан на том, что желудочный сок хищника индуцирует самопереваривание жертвы ее же лизосомальными ферментами. При этом, происходит как протеолиз, так и гидролитическое расщепление всех клеточных структур за счет широкого спектра лизосомальных ферментов (Уголев, Цветкова, 1984). В последние годы было отмечено, что значительную роль в процессе пищеварения у рыб играют ферменты кормовых организмов. Показана, зависимость их вклада от возраста и характера питания гидробионтов (Кузьмина, Перевозчикова, 1988; Кузьмина, 1990; Егоров, Егорова, 2004). Особенное значение процесс индуцированного аутолиза приобретает и при исследовании ферментных систем цепи протеаз у рыб, когда необходимо І включать ферментные системы симбионтов и жертвы. Учитывая эти данные, свидетельствующие о возможности многократного увеличения активности протеиназ в процессе пищеварения за счет механизма индуцированного аутолиза, можно считать, что значимыми для естественного отбора, и, следовательно, адаптивными, были не столько активности пищеварительных гидро-лаз консументов, сколько суммарные активности трофических партнеров (Кузьмина, 1993; Егоров, Егорова, 2004). В то же время важную роль в процессах деполимеризации и трансфор- , мации первичной пищи играет микрофлора пищеварительного тракта, явля- ясь не только поставщиком некоторых ферментов, но и синтезирующая раз- 12 личные вещества (Уголев, Кузьмина, 1993; Spanggaard et al., 2000; Pav.ios et al., 2000; Dixon, Ramiraz, 2001; Кузьмина, Голованова, 2001; Извекова, 2004; Шивокене, Мицкенене, 2004). Интенсивность процессов пищеварения регулируется нервной и эндокринной системами, а также является чувствительной к сигнальным Метаболитам (Кузьмина, 2000; Кузьмина, Гарина, 2001; Кузьмина и др., 2002; Гарина, Герасимов, 2004; Кузьмина и др., 2004).
Техника приготовления ферментативно - активных препаратов и условия проведения экспериментов по исследованию уровня активности пищеварительных гидролаз
Воздействие различных температур инкубации на уровень активности а - амилазы
Рыб сразу после отлова обездвиживали, проводили морфометрический анализ, извлекали кишечник (без пилорических придатков) и промывали его 20 мл охлажденного раствора Рингера для холоднокровных животных (рН 7,3) с целью удаления содержимого и полостных ферментов. Затем на предварительно охлажденном стекле кишечник очищали от жира и замораживали в термосе при температуре -18С - 20С, где хранили до опытов. Далее пробы подвергали биохимическому анализу. В частности, в гомогенатах слизистой оболочки кишечника определяли активность суммарной протеиназы, щелочной фосфатазы, мальтазы и а - амилазы. После разморозки слизистую оболочку кишечника снимали при помощи специального скребка, взвешивали на торсионных весах (ВТ-500), затем эти образцы измельчались гомогенизатором с тефлоновым поршнем в растворе Рингера (для а - амилазы, мальтазы, щелочной фосфатазы и суммарной протеиназы), или дистиллированной воде (для суммарной протеиназы) в соотношении 1:9. Таким образом, получали исходный гомогенат, который за- вующим буфером до рабочего разведения для дальнейшего определения уровня ферментативной активности. Слизистая, предназначенная для определения уровня активности маль-тазы и щелочной фосфатазы, гомогенезировалась в растворе Рингера (рН 7,4) для холоднокровных животных. Состав раствора Рингера: 111 мМ NaCl, 1,9 мМ КС1, 1,1 мМ СаС12, 1,2 мМ NaHC03. Требуемое значение рН достигалось добавлением 0,1 Н раствора НС1 или NaOH. Глициновый буфер (рН 1,5) готовился следующим образом: растворяют в дистиллированной воде 7,505 г глицина, 6,85 г NaCl и доводят объем до 1 литра. Затем к 33 мл этого раствора прибавляют 67 мл 0,1N НС1 и проверяют рН. Хранят буфер в холодильнике. При определении уровня активности мальтазы в качестве субстрата использовался 2% раствор мальтозы, щелочной фосфатазы - 0,6 мМ раствор п-нитрофенилфосфата, для суммарной протеиназы в качестве субстрата использовался 1% раствор казеина, для а - амилазы - растворимый крахмал. 2.3. Определение уровня активности ферментов В работе исследовали гидролитическую активность ферментов комплекса суммарной протеиназы, мальтазы, щелочной фосфатазы и а - амилазы, локализованных в слизистой оболочке кишечника рыб при действии различных температур инкубации и значениях рН
Определение активности суммарной протеиназы Активность суммарной протеиназы определяли модифицированным методом Лоури (Алейникова, Рубцов, 1988). Сущность метода заключается в том, что во время гидролиза казеина ферментами, содержащимися в ферментативно активном препарате, образуются продукты, растворимые в трихлоруксусной кислоте (ТХУ), содержание тирозина в которой затем определяется измерением оптической плотности при помощи фотоэлек- трокалориметра. При фотометрии используется цветная реакция тирозина с компонентами раствора Фолина. Реактивы -1% раствор казеина (субстрат); - 10% раствор трихлоруксусной кислоты (ТХУ); - 0,0025 М раствор CuS04; - 0,5 N раствор NaOH; - реактив Фолина (маточный раствор разводится перед употреблением дистиллятом в соотношении 1:1). Приготовление субстрата Для приготовления субстрата необходимо взять 1г казеина и растворить его в небольшом количестве (25 мл) гидроортофосфата натрия 0,05 N Na2HPC 4 и довести до кипения при постоянном помешивании. Затем в раствор добавить 0,1 N раствор NaOH, доводя рН до нужного значения. (7,4), Затем к раствору приливают дистиллят с соответствующим значением рН и доводят объем раствора до 100 мл. Дистиллят нужного значения рН также готовят, приливая к нему 0,1 N раствор NaOH. Ход определения К 0,5 мл субстрата приливают 0,5 мл гомогената в рабочем разведении и помещают в термостат при температуре 25С на 60 минут. Затем к инкубату добавляют по 1 мл ТХУ и выдерживают в течение 15 минут. Далее пробы фильтруют. К 0,5 мл фильтрата приливают 0,5 мл CuS04, 4 мл NaOH, 1 мл раствора Фолина. Через 20 минут проводится колометрирова-ние на фотоэлектрокалориметре при X = 670 нм против холостой пробы. Контроль: к 1 мл ТХУ прилить 0,5 мл гомогената. Через 5 минут добавляется 0,5 мл субстрата. Холостая проба: 1 мл дистиллята смешивают с 1 мл ТХУ. Стандарт: 2 mM раствор тирозина. Расчет активности фермента производили по формуле: тг 2х(Е(1-Ек.)хразв V = —K-f—j —,где ст Х ШІК V - уровень активности фермента, мкмоль/(г мин); Еоп - экстинкция опытного раствора; Ее- - экстинкция стандартного раствора; Ек - экстинкция контроля; Тинк-время инкубации, мин; разв - рабочее разведение, количество раз. Определение уровня активности мальтазы Для определения уровня активности мальтазы использовался глюко-зооксидазный метод (Балаховский, 1987). Сущность использованного метода заключается в том, что дисахарид мальтоза, содержащаяся в растворе субстрата, под действием мальтазы слизистой кишечника гидролизуется на составляющие его мономеры. Увеличивающаяся в связи с этим в растворе субстрата концентрация глюкозы и определяется на основе реакции окисления углевода кислородом воздуха, катализируемой глюкозооксидазой. В результате этого взаимодействия образуется глюколактон и перекись водорода. В свою очередь, образующаяся перекись водорода вызывает окисление субстратов пероксидазы с образованием окрашенного продукта. Реактивы - 2% раствор мальтозы; -0,45% раствор ZnS04; - 0,1 N раствор NaOH; - Таблетизированная буферно - субстратная смесь (реагент 1); - Таблетизированная ферментная смесь (реагент 2); - 0,05% раствор глюкозы. Приготовление рабочего реактива 2 таблетки реагента 1 растворяют в 200 мл дистиллированной воды при обязательном непрерывном помешивании; 1 таблетка реагента 2 растворяется в 5 мл дистиллированной воды. При этом приготовленные растворы хранятся в темном месте при 2-8С, сохраняя в таких условиях стабильность в течение 30 суток. В данной работе применены наборы для клинической биохимии «Фотоглюкоза». Для получения рабочего реактива реагент 1 и реагент 2 смешивают в отношении 40:1. Рабочий реактив стабилен не менее 7 суток в посуде из темного стекла при температуре 2-8С. Если предполагается использовать весь рабочий раствор в течение 7 суток, то реагенты 1 и 2 растворяют совместно в 205 мл дистиллированной воды. В пробирки приливают по 0,5 мл 2% раствора мальтозы и такое же количество ферментативно активного препарата. Полученную смесь инкубируют в термостате при температуре 25С в течение 20 мин. Затем к 1 мл инкубационной смеси добавляют 1,0 мл 0,45% раствор ZnSC 4 и 0,5 мл 0,1 N раствор NaOH, пробы тщательно перемешивают.
Через 10 минут их фильтруют. Из отфильтрованных растворов отбирают по 0,2 мл и к этому количеству фильтрата прибавляют 1 мл рабочего реактива глюкозооксида-зы. Пробы инкубируют при температуре 37С в течение 15-20 минут. За этим проводят калориметрию напротив холостой пробы при X = 505 нм. Контроль: к 0,5 мл раствора глюкозы приливают 0,5 мл раствора Рингера. Расчет величины уровня активности фермента проводят по формуле: т. 2.8 х(Е т-Еч)х разе V = , где IliK X 1 инк V -уровень активности фермента, мкмоль/(г мин); ,К\ 4 л- \ \ Л Л N 2,8 - концентрация контрольного раствора глюкозы, мкмоль; Еоп - экстинкция опытного раствора; Ем - экстинкция раствора субстрата; Ек - экстинкция контроля; Т„нк- время инкубации, мин; разв - рабочее разведение, количество раз. Определение активности щелочной фосфатазы .. ч1 -у \ ч Принцип метода основан на том, что под действием щелочной фосфо-тазы п-нитрофенилфосфат гидролизуется с образованием п-нитрофенола, который в свою очередь в щелочной среде дает интенсивное желтое окрашива- v ниє, интенсивность которого определяется спектрофотометрически. Реактивы - раствор субстрата (0,6 тМ раствор п - нитрофенилфосфата Na, приготовленного на растворе Рингера); - 0,2 N раствор NaOH для остановки ферментной реакции; - Дистиллированная вода; - 0,6 тМ раствор п - нитрофенола, растворенном в 0,1 N растворе NaOH (стандартный раствор). Ход определения . V к" \ Исследуемый ферментативно - активный раствор инкубируют с субстр а- том в течение 30 минут (1 мл субстрата + 1 мл ферментативно - активного препарата). После инкубации к пробам приливают 0,4 мл NaOH для остановки ферментативной реакции и проявления окраски. Пробы колориметрируют при X = 505 нм против раствора, содержащего те же реактивы в том же количестве, которые использовались в опыте, только вместо субстрата и гомогената используются 2 мл раствора Рингера или дистиллята. г Активность фермента рассчитывают по формуле: Ь ч 45 \ООх(Еоп-Ек)хразв у= , где 1 N Ест Тш,к т ч s N V - активность фермента (VxlO 3), мкмоль/(г мин); Еоп - экстинкция опытной пробы; Ест- экстинкция стандартной пробы; Ек - экстинкция контроля; разв - рабочее разведение, количество раз; ТИнк - время инкубации, мин.
Оценка влияния различных концентраций водородных ионов на уровень активности мальтазы
При исследовании мальтазы для фермента кишечника нерки, горбуши (рис. 22), кеты (рис.23) и микижи (рис.24) максимальная ферментативная активность показана, как и при исследовании щелочной фосфатазы, при рН 8,0. Однако максимальная ферментативная активность кишечника гольца обнаружена теперь при 9,0 (рис. 23). Важно отметить, что значения уровня активности мальтазы намного превышают таковой щелочной фосфатазы и при увеличении концентрации ионов водорода от 3,0 до значения максимальной активности фермента наблюдается его увеличение у нерки от 2,65±0,07 до 3, 76±0,07, у горбуши - от 1,11±0,05 до 2,43±0,07, у кеты - от 2,06±0,08 до 2,70±0,04, у гольца - от 1,96±0,04 до 2,51 ±0,02, у микижи - от 1,84±0,05 до 2,64±0,04 мкмоль/гхмин. При этом зона оптимальных значений рН остается довольно широкой для мальтазы всех видов рыб. Так, при рН 7,0 относительная активность фермента кишечника исследуемых видов гидробионтов составляет 88-99% от максимального значения, принятого за 100%). При щелочных значениях рН также показано незначительное снижение ферментативной активности у нерки, горбуши, кеты, у которых уровень активности мальтазы снижается лишь на 2-4% от максимального значения, принятого за 100%), а у гольца и микижи активность мальтазы снижается на 13 и 38% от максимума, соответственно. Для фермента белорыбицы максимальный уровень активности мальтазы отмечается при рН 5,0 (рис. 25). Активность фермента при этом составляет 10,22±0,19 мкмоль/гхмин. При рН 5,5-6,5 происходит достоверное (р 0,05) снижение относительной активности фермента на 22-42%) от максимального значения, принятого за 100%. При дальнейшем повышении рН довольно высокая относительная активность фермента сохраняется и при рН 7,5-9,5, составляя 57-55% от максимума. Зона оптимальных значений рН суммарной протеиназы слизистой оболочки кишечника всех исследованных лососеобразных рыб сдвинута в сторону щелочной среды. Так, для ферментов кишечника горбуши (рис. 26), кеты, гольца (рис. 27) и микижи (рис. 28) максимальный уровень активности суммарной протеиназы наблюдается при рН 11,0, а у нерки (рис. 26) - при рН 10,0. Исключением является белорыбица, у которой максимальная ферментативная активность отмечена при нейтральном значении рН - 7,0 (рис. 29). Значения уровня активности суммарной протеиназы при увеличении рН от 6,0 до максимального значения увеличиваются у нерки от 0,26±0,01 до 0,44±0,02 мкмоль/гхмин, у горбуши - от 0,17+0,01 до 0,52+0,04 мкмоль/гхмин, у кеты - от 0,11±0,01 до 0,49±0,02 мкмоль/гхмин, у гольца -от 0,20±0,02 до 1,18±0,06 мкмоль/гхмин, у микижи - от 0,14±0,01 до 0,50±0,02 мкмоль/гхмин, у белорыбицы - от 12,16±0,16 до 18,85±0,24 мкмоль/гхмин.
При постепенном увеличении значений рН до 12,0 отмечено снижение уровня ферментативной активности до 0,19± 0,01 мкмоль/гхмин у нерки, до 0,48±0,02 мкмоль/гхмин у горбуши, 1,12±0,02 мкмоль/гхмин у гольца, 0,32±0,02 мкмоль/гхмин у микижи и при рН 10,0 у белорыбицы значение уровня активности мальтазы соответствует 16+0,31 мкмоль/гхмин. У кеты увеличение рН до 12,0 не вызывает изменений в уровне ферментативной активности. Для суммарной протеиназной активности слизистой кишечника нерки отмечается высокая относительная активность при рН 7,0-8,0 и значительное снижение ее при 6,0. Так, отмечено, что при щелочных и нейтральных значениях (рН 7,0-8,0) относительная активность ферментов снижается на 20-25% от максимальной, а при рН 6,0 - на 40% максимальной активности. У гольца при рН 8,0 отмечен максимум относительной активности по сравнению с остальными видами лососеобразных рыб, который снижается лишь на 9%, при нейтральном значении - на 50%, а при рН 6,0 отмечено максимальное ее снижение по отношению к относительной активности ферментов других исследованных рыб - на 83% от максимальной величины. В. среднем у горбуши, кеты, микижи и белорыбицы при значении рН 6,0 относительная активность составляет от 64% от максимума у белорыбицы до 22% -у кеты. При нейтральных и щелочных значениях рН относительная актив7 ность суммарной протеиназы этих видов рыб снижается до 50-65% от максимума, а у белорыбицы до 95%». Кроме того, для данной группы ферментов слизистой кишечника нерки, горбуши, кеты, гольца и белорыбицы показан широкий диапазон оптимальных значений рН и смещение его в нейтральную и щелочную стороны. В отличие от вышеперечисленных видов, для фермента кишечника микижи зона оптимальных значений рН не велика. Так, при рН 10,0 и 12,0 снижение относительной активности суммарной протеиназы микижи происходит на 40% от максимума, принятого за 100% . 4.4. Исследование воздействия различных концентраций ионов водорода на уровень активности «-амилазы Исследования уровня активности а-амилазы слизистой оболочки кишечника лососеобразных рыб при различных значениях рН среды не показали видимых отличий по сравнению с изменением уровней активности других пищеварительных ферментов. Так, максимальная активность фермента кишечника нерки, горбуши (рис. 30), кеты (рис. 31) и белорыбицы (рис.33) отмечается при рН 8,0. При этом значения ферментативной активности изменяются от 0,90±0,13 до 9,24±0,18 мг/гхмин у нерки, от 1,01±0,13 до 11,22±0,47 мг/гхмин у горбуши, от 5,70±0,17 до 9,04±0,12 мг/гхмин у кеты и от 7,74±0,2 до 13,08±0,09 мг/гхмин у белорыбицы. Для фермента кишечника гольца (рис. 31) и микижи (рис. 32) оптимальное значение обнаружено при рН 9,0. Изменение значений ферментативной активности происходит у гольца от 0,76±0,18 до 4,15±0,18 мг/гхмин и от 3,76±0,40 до 7,00±0,2 мг/гхмин у микижи. Кроме того, отмечено, что у кеты, горбуши и белорыбицы значения ферментативной активности превышают таковые нерки, гольца и микижи почти в 2 раза.
Для данного фермента кишечника всех исследованных видов характерна широкая зона оптимальных значений рН. У белорыбицы, кеты и микижи при значениях рН ниже 7,0 (рН 5,0-6,0) отмечается высокая относительная активность а-амилазы (наблюдается достоверное (р 0,05) снижение гидролитической активности фермента только до 86-88% от максимума). Для фермента кишечника остальных видов рыб (нерки, горбуши, гольца) отмечено снижение относительной активности при рН 5,0 до 38-49% от максимальной. Однако при рН выше 7,0 показано сохранение высокой относительной активности фермента у всех исследованных лососеобразных рыб. Так, при рН 9,0-10,0 не отмечается снижения ферментативной активности более чем на 20% от максимума, а у белорыбицы при рН 9,0 относительная активность энзима составляет 92% максимальной активности. Сопоставление уровней активности пищеварительных ферментов исследованных видов рыб при различных значениях рН среды показало отсутствие особенностей характера изменения ферментативной активности лососеобразных рыб в зависимости от их систематического положения и экологических условий обитания. Показанные результаты свидетельствуют о значительной адаптирован-ности исследованных пищеварительных ферментов к функционированию при различных значениях рН среды. Сохранение высокой относительной активности ферментов при сдвиге рН как вправо, так и влево от зоны оптимума для большинства исследованных видов лососеобразных рыб свидетельствует о важной роли структур, в том числе липидного матрикса мембран, в поддержании оптимальной конформации ферментов.
