Введение к работе
Актуальность темы. Использование нанотехнологий в медицине является одним из приоритетных направлений в современной науке, которое может дать реальную отдачу уже в самом ближайшем будущем [Л1]. Одно из таких направлений – лазерный фототермолиз опухолей с использованием резонансно-поглощающих наночастиц [Л2]. Конъюгаты золотых наночастиц с антителами селективно присоединяются к раковым клеткам, а облучение клеток лазерным излучением приводит к эффективной деструкции раковых клеток без повреждения здоровых. Лазерное излучение в ближнем инфракрасном диапазоне, попадающее в «окно прозрачности биотканей» (750-1100нм) при соответствующем уровне мощности не должно вызывать гипертермию (> 42 0С) и соответственно функциональное фотоповреждение нормальных клеток, при этом присутствие плазмонно-резонансных наночастиц в патологических клетках или связанных с их внешней плазматической мембраной вызывает некроз.
Однако с точки зрения ряда перспективных медицинских приложений, связанных с диагностикой и терапией раковых клеток, традиционные сферические золотые наночастицы диаметром от 5 до 100 нм имеют плазмонный резонанс (520-560 нм), попадающий в полосу поглощения хромофоров клетки, что существенно ограничивает доставку лазерного излучения без повреждения нормальных биотканей. Наночастицы, состоящие из диэлектрического сферического ядра и металлической нанооболочки [Л3], представляют большой интерес для фототермальной терапии [Л4] и оптической визуализации раковых клеток [Л2]. Принципиальным преимуществом золотых нанооболочек перед обычными коллоидными золотыми наносферами является возможность настройки максимумов плазмонного резонанса поглощения и светорассеяния в нужный спектральный диапазон от видимого до ИК за счет изменения размера ядра и толщины оболочки [Л2,Л5], а также благодаря возможности конструирования наночастиц с заданными спектральными коэффициентами поглощения в ближней ИК области, совпадающими с длинами волн наиболее распространенных и недорогих полупроводниковых инжекционных лазеров. Аналогичное спектральное управление возможно реализовать на основе золотых наностержней, изменяя соотношение длина-диаметр [Л2]. Конъюгирование золотых нанооболочек с различными типами биополимеров, позволяет повысить их биодоступность и селективность накопления наночастиц в опухолевых клетках и тканях, при этом экспериментальные данные подтверждают эффективность использования нанооболочек в качестве меток для лазерной гипертермии раковых клеток. Впервые в 2003 г. была продемонстрирована фотодеструкция раковых клеток с помощью золотых наносфер [Л6,Л7] и нанооболочек [Л8]. Золотые наностержни впервые в 2006 г. были апробированы для селективной фототермической терапии (ПФТТ) раковых клеток in vitro в группе El-Sayed [Л9]. Последние достижения по векторной доставке наночастиц и селективному лазерному фототермолизу раковых клеток представлены в обзоре [Л4]. Для селективной лазерной гипертермии клеток в 2003 году был апробирован метод резонансного облучения наносекундными импульсами [Л6], что позволило осуществить интенсивный локальный пространственный нагрев наночастиц и прилегающего объема в пределах характерного размера клеток. Однако, традиционные лазеры, генерирующие нано, пико и фемтосекундные оптические импульсы, работают в режиме синхронизации мод со скважностью более 100 и соответственно малой средней мощностью и энергией, но очень большой пиковой мощностью, что должно вызывать нелинейные термические эффекты при термолизе наночастиц и клеток, поэтому необходимо исследовать воздействие сверхкоротких оптических импульсов на устойчивость таких структур как нанооболочки. Предлагаемые лазерные технологии пока не вышли за рамки «чашечки Петри». В реальной ситуации при облучении лазерным пучком биотканей, обладающих сильным рассеянием, возникают существенные проблемы доставки излучения с определенной плотностью на заданную глубину [Л10], а тем более регулирование локальной температуры нагрева биотканей плазмонно-резонансными наночастицами для обеспечения некроза или апоптоза клеток. Для разработки управляемого лазерного фототермолиза биотканей необходимы детальные исследования ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней при различных режимах, наиболее оптимальных для фотодеструкции биотканей полупроводниковых лазеров (810 нм), в которых реализуется как непрерывный, так и импульсный режимы с милли и микросекундной длительностью, с регулируемой скважностью для различной концентрации наночастиц. Для разработки технологии управляемой лазерной гипертермии раковых опухолей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц с контролем температуры необходимо проведение экспериментальных исследований, как на фантомах, так и in vivo на лабораторных животных, а также апробация на спонтанных опухолях.
Появившиеся в 21 веке в медицинских клиниках, в основном офтальмологических, оптические низко-когерентные томографы (ОСТ) позволили получать трехмерные изображения сильно рассеивающих биотканей с пространственным разрешением по глубине среза от 20 до 5 микрон при общей глубине сканирования 1,5-2 мм [Л11]. В 2004 году эта технология была применена для идентификации золотых плазмонно-резонансных нанооболочек, а в 2007 для наностержней [Л12]. В ряде работ предпринята попытка использования золотых нанооболочек в качестве вещества, повышающего контрастность визуализации слоев кожи [Л13]. Для оптимизации технологии ИК лазерного фототермолиза на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц в фантомах и биотканях и оценки их пространственного распределения необходимо апробировать потенциальные возможности ОСТ для различных типов золотых наночастиц, включая нанооболочки и наностержни, эффективно поглощающие и рассеивающие оптическое излучение в ближней ИК области спектра. Субклеточного пространственного разрешения позволяет достигнуть конфокальный лазерный томограф, однако в реальных биотканях сильные эффекты оптической неоднородности могут создавать существенные ограничения на идентификацию наночастиц, что требует экспериментального подтверждения.
Для технологии лазерного фототермолиза опухолей коллоидный раствор золотых плазмонно-резонансных наночастиц может вводиться непосредственно в патологическую биоткань или внутривенно для селективного накопления в раковых клетках [Л2,Л4]. При этом возникает серьезная проблема, связанная с динамикой накопления золотых плазмонно-резонансных наночастиц в различных органах лабораторных животных. Опубликованная в конце 2007 года первая в этом направлении работа голландской группы [Л14] по эффекту накопления наночастиц разных размеров в различных органах лабораторных крыс требует уточнения вследствие образования кластеров наночастиц. Необходимо оценить возможности визуализации наночастиц в гистологических срезах. Кроме того необходим поиск и апробация традиционных методов визуализации in vivo таких как рентгеновская, магниторезонансная томография.
Одним из конкурентных методов интенсивно развиваемого в ведущих биомедицинских центрах ИК лазерному фототермолизу клеток и биотканей на основе технологии золотых плазмонно-резонансных наночастиц является фототермолиз на основе ИК фотосенсибилизаторов, эффективность поглощения которых может быть достигнута существенно выше, чем в коллоидном растворе наночастиц. Типичным представителем таких ИК фотосенсибилизаторов является Индоцианин зеленый (ICG), разрешенный для введения in vivo. Процессы резонансного поглощения лазерного излучения молекулами красителя (ICG), представляющие собой однородную распределенную поглощающую среду в отличие от дискретных центров поглощения и рассеяния для коллоидного раствора наночастиц должны, по-видимому, вызывать различную эффективность фототермолиза клеток и биотканей. Поэтому представляет интерес сравнение эффективности лазерного фототермолиза для этих двух технологий, особенно при импульсных лазерных воздействиях.
Фотодинамический эффект, обнаруженный ещё в начале 20 века, в настоящее время является одним из наиболее эффективных методов фотодеструкции опухолей в онкологии при воздействии резонансного лазерного излучения, поглощаемого фотосенсибилизаторами (порфиринами, хлоринами, фталоцианинами), которые селективно накапливаются в злокачественных опухолях и генерируют активные формы кислорода [Л15]. Одним из методов определения эффективности фотосенсибилизаторов для фотодинамической терапии и исследования клеточно-молекулярных механизмов фотоповреждения клеток является воздействие лазерного излучения на нервные клетки. Исследование импульсной активности медленно адаптирующихся нейронов изолированных рецепторов растяжения речного рака позволило оценить степень фотодинамического воздействия различных типов красителей [Л16]. Однако сложность нелинейно-динамического отклика нейрона, работающего в автоколебательном режиме, не позволяет однозначно интерпретировать механизмы фотодинамического воздействия и лазерного фототермолиза. Для исследования фотодинамического и фототермического отклика на лазерное воздействие нами предлагается классический объект биофизики - соматический нерв лягушки, потенциалы действия в котором возбуждаются в неавтономном режиме. Существование адекватной математической модели активной плазматической мембраны нейрона [Л17], описывающей возбуждение потенциалов действия должно позволить интерпретировать процессы лазерного фототермолиза и фотодинамического воздействия, а также сравнить с результатами эксперимента.
Целью диссертационной работы являлась разработка управляемого ИК лазерного фототермолиза клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц и фотосенсибилизаторов, оценка возможности оптической визуализации наночастиц с помощью конфокального и низко-когерентного томографа, а также исследование механизмов инактивации нейронов при фототермической и фотодинамической терапии.
Задачи исследования
1. Экспериментальное исследование 2D и 3D температурных полей коллоидного раствора золотых нанооболочек и наностержней, имеющих плазмонный резонанс в ближней ИК области спектра, при облучении лазерным пучком с регулируемым уровнем мощности, временем облучения для установления допустимого уровня лазерной мощности, вызывающей селективное повреждение биотканей, оценка оптимальной концентрации наночастиц и режимов работы лазера (непрерывный, импульсный) для эффективного разрушения биотканей, включая раковые опухоли, а также клетки крови.
2. Апробировать возможность детектирования в коллоидном растворе, а также в фантомах и биотканях отдельных золотых плазмонно-резонансных наночастиц с помощью лазерного конфокального томографа и оптического низко-когерентного томографа, оценить чувствительность метода и возможность контрастирования.
3. Исследовать особенности резонансного лазерного фототермолиза с использованием ИК фотосенсибилизатора (Индоцианин зеленый) и сравнить с возможностями фототермолиза на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц для различных режимов облучения (непрерывного, импульсного).
4. Экспериментально исследовать динамический отклик соматического нерва лягушки, прокрашенного ИК фотосенсибилизатором (Индоцианин зеленый) при фототермическом лазерном воздействии, при внеклеточном возбуждении потенциалов действия и установить возможные механизмы инактивации нейронов.
Научная новизна работы
-
Впервые проведено сравнение особенностей ИК лазерного нагрева коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц (дискретная поглощающая и рассеивающая среда) и фототермических сенсибилизаторов (непрерывная поглощающая среда) при одинаковом уровне лазерного воздействия. Экспериментально установлено, что использование импульсных (длительность менее миллисекунды) режимов работы лазеров с различной скважностью по сравнению с непрерывным при одинаковой вводимой оптической энергии позволяют осуществить локальный фототермолиз клеток при использовании золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней в отличие от технологии на основе фотосенсибилизаторов (индоцианин зеленый), где степень нагрева в импульсном и непрерывном режиме практически одинакова. Проведена оптимизация импульсных параметров ИК лазеров (длительность импульсов, скважность, средняя мощность) для локального разрушения биотканей.
-
Впервые неинвазивно исследованы 2-D и 3-D температурные пространственные поля при нагреве коллоидного раствора золотых плазмонно-резонансных наночастиц в воде и глицерине при воздействии лазерного излучением ближнего ИК диапазона (810 нм) для различных уровней мощности, режимов работы (непрерывный, импульсный), различной концентрации наночастиц, при этом использование глицерина повышает эффективность нагрева в 1.6 раза по сравнению с водой в соответствии с отношением теплоемкостей. Впервые экспериментально установлены пороговые уровни плотности энергии и лазерной мощности, вызывающие дефрагментацию золотых плазмонно-резонансных нанооболочек в наносекундной и фемтосекундной области.
-
Проведено детектирование и визуализация золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней в объемных фантомах и биотканях на основе технологии оптического конфокального и низко-когерентного томографа. Впервые установлена и запатентована возможность определения концентрации наночастиц в объеме и динамика пространственной неоднородности наночастиц, связанной с процессами диффузии в фантомах и биотканях. Обнаружено, что при концентрации наночастиц более 109 см-3, когда в объем когерентности попадает более одной наночастицы, ОСТ позволяет измерить объемный коэффициент отражения и оценить динамику пространственной неоднородности распределения наночастиц, степень кластеризации коллоидного раствора наночастиц и позволяет создавать управляемые фантомы для тестирования ОСТ.
-
Разработана технология резонансного ИК лазерного фототермолиза биотканей и фантомов при использовании различной концентрации фотосенсибилизаторов (индоцианин-зеленый) при ИК резонансном непрерывном и импульсном лазерном воздействии и измерений локальной температуры с помощью тепловизора.
-
Впервые реализован неинвазивный оптический метод контроля функциональной инактивации эритроцитов цельной крови человека при субклеточном лазерном фототермолизе на основе анализа комбинационного рассеяния, измеренного конфокальным микроскопом.
Впервые обнаружен размерный эффект влияния золотых наночастиц на функциональную активность тромбоцитов.
-
Впервые предложена методика для оценки фотодинамического или фототермического воздействия на нейроны на основе анализа динамических (с миллисекундным разрешением) процессов инактивации соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенсибилизаторами при измерении составного потенциала действия при лазерном облучения как в видимой, так и в ближней ИК области спектра. Проведенные эксперименты и численное моделирование позволили интерпретировать процессы инактивации нейронов при фотодинамическом или фототермическом повреждением плазматической мембраны аксонов и мембраны митохондрий, что отражается на функционировании активного транспорта.
Научно-практическая значимость работы:
-
Экспериментально апробирован ИК лазерный фототермолиз клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц и фотосенсибилизаторов. Установлены диапазоны допустимых концентраций наночастиц и фотосенсибилизаторов для достижения заданного уровня температуры и глубины поражения биотканей от уровня лазерного воздействия и режимов облучения (непрерывный, импульсный, средняя мощность, длительность импульса, скважность). Апробация ИК лазерного фототермолиза спонтанных раковых опухолей мелких животных (собаки, кошки, крысы) показала эффективность лазерной гипертермии на основе технологии золотых плазмонно-резонансных наночастиц и фотосенсибилизаторов.
-
Апробированная технология субклеточного комбинационного рассеяния должна позволить неинвазивно определять степень функционального необратимого разрушения клеток, например, крови при гипертермии.
-
Обнаруженный размерный эффект влияния золотых наночастиц на функциональную активность тромбоцитов крови может быть использован в гематологии для управления процессами свертываемости крови.
-
Использование оптического конфокального и низко-когерентного томографа позволило бесконтактно детектировать золотые плазмонно-резонансные наночастицы (нанооболочки и наностержни) до глубины 1 мм в фантомах из агара и определять концентрации наночастиц и их пространственную неоднородность. Предложено использовать коллоидный раствор золотых плазмонно-резонансных нанооболочек для тестирования ОСТ.
-
Исследование динамического отклика нейронов при возбуждении соматического нерва лягушки с помощью последовательности электрических импульсов позволило обнаружить нелинейные свойства нейронов, проявляющихся в хаотической последовательности потенциалов действия при регулярном внешнем возбуждении, что принципиально важно для понимания функционирования живых динамических систем в нейрофизиологии и разработке систем управления в робототехнике.
-
Установленные механизмы инактивации клеток при фотодинамическом и фототермическом лазерном воздействии позволяет выработать стратегию фотооблучения и соответствующие уровни оптической энергии, а также оценивать эффективность различных фотосенсибилизаторов.
Достоверность научных результатов:
Достоверность полученных результатов обусловлена использованием в экспериментах стандартной измерительной аппаратуры, подтверждается воспроизводимостью экспериментальных данных, а численные расчеты основаны на общепринятых моделях.
Положения и результаты, выносимые на защиту
-
Управляемый ИК лазерный фототермолиз клеток и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней при концентрации наночастиц в объеме, равной 107–109 см–3, оптимальном режиме облучения (непрерывный или импульсный, средняя плотность лазерной мощности 10–20 Вт/см2) и бесконтактном контроле 2-D температурных полей с помощью тепловизора. Технология управляемого резонансного лазерного фототермолиза с помощью золотых наночастиц и ИК фотосенсибилизатора – индоцианина зеленого – апробирована на фантомах и спонтанных раковых опухолях мелких животных in vivo.
Реализован неинвазивный оптический метод контроля функциональной инактивации клеток крови при субклеточном лазерном фототермолизе на основе анализа комбинационного рассеяния, измеренного с помощью конфокального микроскопа.
-
ИК лазерное облучение золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и стержней (дискретная поглощающая и рассеивающая среда) и фотосенсибилизаторов (краситель индоцианин зеленый) (непрерывная поглощающая среда) при одинаковом уровне вводимой непрерывной лазерной энергии и соответствующем выборе концентрации позволяет реализовать соизмеримую эффективность разрушения фантомов и биотканей, однако при облучении последовательностью лазерных импульсов с длительностью менее миллисекунды и скважностью более двух, средняя температура фантомов и биотканей с золотыми наночастицами оказывается холоднее (на единицы - десятки градусов) в отличие от нагрева окрашенных сред.
Установлены допустимые уровни плотности лазерной энергии одиночных лазерных импульсов Е>200 мДж/см2 при длительности 4 наносекунды и 6 Дж/см2 при длительности 60 фемтосекунд, вызывающие дефрагментацию золотых плазмонно-резонансных нанооболочек.
-
Однозначное детектирование и определение пространственной неоднородности концентрации золотых плазмонно-резонансных нанооболочек и наностержней в объемных фантомах и биотканях с помощью ИК низко-когерентного томографа возможно, если в объем когерентности Vc, определяемый произведением длины продольной когерентности излучателя и диаметра фокального пятна зондирующего пучка, попадает не более одной наночастицы. Изменением концентрации золотых наночастиц возможно создание фантомов с управляемым коэффициентом обратного отражения от объемных сред для тестирования ОСТ.
-
Методика оценки степени фототермического и фотодинамического воздействия на нейронные клетки ex vivo на основе измерения амплитуды и формы составного потенциала действия при внеклеточном возбуждении миллисекундными электрическими импульсами соматического нерва лягушки, прокрашенного фотосенсибилизаторами и подверженного воздействию резонансного лазерного излучения. Анализ изменения динамического отклика соматического нерва при лазерном облучении позволяет интерпретировать результаты воздействия как фотоповреждение плазматической мембраны аксонов и нарушение функционирования активного транспорта.
Личный вклад диссертанта и результаты, полученные совместно с другими исследователями:
Основные экспериментальные результаты диссертации, прежде всего по фототермической инактивации нейронов и лазерному фототермолизу клеток крови и биотканей на основе золотых плазмонно-резонансных наночастиц были проведены лично соискателем. Постановка задач исследования и обсуждение экспериментальных результатов проведена под руководством профессора, д.ф.-м.н Тучина В.В. Эксперименты in vivo и in vitro по лазерному фототермолизу опухолей животных на основе плазмонно-резонансных золотых наночастиц проведены совместно с к.в.н. Терентюком Г.С.(первая ветеринарная клиника), а эксперименты по агрегации тромбоцитов крови с к.м.н. Ивановым А.Н.(СГМУ). Интерпретация результатов расчета по распространению фотонов в растворе наночастиц, температурных полей и сравнение с экспериментом по лазерному воздействию проведена совместно с д.ф.-м.н Максимовой И.Л., к.ф.-м.н. Ермолаевым И.А., аспирантом Скапцовым А.А. (СГУ). Исследование оптических свойств плазмонно-резонансных золотых наночастиц при воздействии лазерного излучения и интерпретация результатов измерений проводились совместно с профессором, д.ф.-м.н. Хлебцовым Н.Г. и к.ф.-м.н. Хлебцовым Б.Н. (ИБФРМ РАН), а при воздействии фемтосекундных лазерных импульсов совместно с к.ф.-м.н. Р. Р. Летфуллиным (Розе-Халман технологический институт, США). Совместно с к.ф.-м.н. Меглинским И.В. и аспирантом Векслером Б. (Крэнфилдский университет, Англия) проведены исследования визуализации наночастиц на конфокальном оптическом томографе, а исследования на ОСТ проведены совместно с врачом Наумовой О.Г.(Областная офтальмологическая больница г. Саратов) и доцентом, к.ф.-м.н. Акчуриным Г.Г.(СГУ). Эксперименты in vitro по лазерной фотодинамической инактивации нейронов лягушки проведены совместно с к.м.н. Селиверстовым Г.А.(СГМУ).
Работа выполнена на кафедре оптики и биофотоники Саратовского государственного университета им. Н.Г.Чернышевского.
Гранты
Работа выполнена при финансовой поддержке Федерального агентства по науке и инновациям Госконтракт №02.512.11.2034, РФФИ, грант 07-02-01434; CRDF BRHE RUXO-006-SR-06, CRDF BRHE RUXO-006-SR-06/BP1M06, Grant № 224014 PHOTONICS4LIFE of FP7-ICT-2007-2 (2008-2013), Тематический план НИР СГУ по заданию федерального агентства по образованию РФ 1.4.09. (2009-2010), Грант президента РФ “Для поддержки ведущих научных школ” – НШ - 208.2008.2 (2008-2009), Аналитическая ведомственная целевая программа “Развитие научного потенциала высшей школы” РНП.2.1.1.44.73 (2006-2008), Аналитическая ведомственная целевая программа “Развитие научного потенциала высшей школы” № 2.1.1/4989 (2009-2010), Аналитическая ведомственная целевая программа “Развитие научного потенциала высшей школы” №2.2.1.1/2950 (2009-2010).
Апробация
1) Международная школа по лазерной физике, оптике и биофизике в 2001-2008, (Saratov Fall Meeting) – 8 стендовых докладов;
2) Международная конференция “Оптика лазеров” LO’2003 и LOYS’2003 (Санкт-Петербург) - 2 стендовых доклада;
3) Международная конференция “Synchronization of chaotic and stochastic oscillations” SYNCHRO-2002 - стендовый доклад;
4) Всероссийская конференции “Нелинейные дни в Саратове для молодых” -2002, 2003 – 2 стендовых доклада;
5) 4 съезд фотобиологов России, Саратов, 2005, - 2 стендовых доклада;
6) Photonic West, SPIE 2002, 2005, 2006, 2008 - 5 стендовых докладов;
7) Международная конференция “Optics and Photonics 2007” SPIE (San Diego) - устный доклад;
8) 5 съезд фотобиологов России, 2008, Пущино –2 стендовых доклада;
9) Международная конференция “Photonics4 life” 2008 (Belgium) – устный доклад.
Публикации по теме диссертации: опубликовано 21 работа, в том числе 4 статьи в рецензируемых журналах РАН и зарубежных журналах из списка рекомендованных ВАК и 14 статей в зарубежных и отечественных периодических изданиях, получены 3 патента РФ.
Структура и объем работы
Диссертация состоит из введения, 4-х глав, заключения и списка цитируемой литературы, состоящего из 136 наименований.
Диссертация изложена на 154 страницах текста, содержит 91 рисунок.
