Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
1.1. Фотомодифицированная кровь - полимодальный биоактивный фактор , 9
1.2. Действие оптического излучения на молекулярные и клеточные структуры , II
1.3. Функциональные фотореакции клеток 21
1.4. Фотоиммунологические реакции 24
ГЛАВА II, Материалы и методы
2.1. Выделение клеток крови человека . 31
а. Выделение эритроцитов из крови , 31
б. Выделение лимфоцитов из крови 31
2.2. Выделение лимфоидных клеток мыши . 32
а. Выделение спленоцитов 32
б. Выделение тимоцитов 32
в. Выделение клеток костного мозга . 33
2.3. Определение концентрации клеток и их жизнеспособности . 33
2.4. Условия облучения клеток 33
2.5. Регистрация оптических спектров . 35
2.6. Метод прижизненного выявления сорбщонных свойств клеток ,. 35
2.7. Прямые и перекрестные реакции агглютинации 36
2.8. Метод образования спонтанных розеток . 37
2.9. Метод образования иммунных розеток 37
2.10. Метод выявления Т- и В-лимфоцитов мышей . 38
2.11. Обработка данных 41
3. ГЛАВА III. ФОТОМОДИФИКАЦИЯ ИМУНОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК
КЛЕТОК КРОВИ 42
3.1, Фотомодификация реакции агглютинации эритроцитов 43
3.2. Фотомодификация реакции розеткообразования лимфоцитов . 49
ГЛАВА ІV. АНАЛИЗ ФОТОПЕРЕСТРОЕК ЭРИТРОЦИТОВ 58
4.1. Особенности спектров поглощения растворов гемоглобина, облученных оптическим излучением различного спектрального состава 59
4.2. Особенности спектров поглощения суспензий эритроцитов, облученных оптическим излучением различного спектрального состава 62
4.3. Анализ фотоперестроек сорбционных свойств облученных эритроцитов 73
ГЛАВА V. АНАЛИЗ ФОТОПЕРЕСТРОЕК ЛИМФОВИДНЫХ КЛЕТОК 79
5.1. Анализ сочетанного действия оптического излучения и антиоксидантов 80
5.2. Фотомодификация свойств лимфоидных клеток -кислородзависимый процесс 88
5.3. Модификация цитотоксического действия антисывороток, истощенных облученными лимфоцитами 92
ЗАШПОЧЕВИЕ 98
ВЫВОДЫ . 104
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 106
- Фотомодифицированная кровь - полимодальный биоактивный фактор
- Выделение клеток крови человека
- Фотомодификация реакции агглютинации эритроцитов
- Особенности спектров поглощения растворов гемоглобина, облученных оптическим излучением различного спектрального состава
- Анализ сочетанного действия оптического излучения и антиоксидантов
Введение к работе
Актуальность темы.
Оптическое излучение будучи биологически активным физическим фактором внешней среды организма привлекает все более пристальное внимание. Достижения фотохимии, спектроскопии, технических разработок источников оптического излучения обусловило форсило рованное развитие фотобиологии. Наряду с интенсивно развивающимися направлениями классической фотобиологии: фотосинтезом, фоторецепцией, биолюминесценцией, эффектами митогенетического излучения, большую практическую значимость приобрели исследования механизмов действия оптического излучения на кровь. Повышенный интерес к этим исследованиям обусловлен тем, что аутологичная кровь, облученная оптическим излучением, при ее последующем введении в организм может оказывать мощное терапевтическое действие на различные патологические состояния организма человека и животных.
Метод переливания фотомодифицированной крови - фотогемотерапия был впервые применен в конце 20х-начале 30х годов в медицинской практике в качестве лечебного средства против общих сепсисов, По мере накопления клинического опыта показания к применению фотогемотерапии значительно расширились, помимо острых и рецидивирующих инфекций, метод стал применяться для лечения аллергических заболеваний, артропатий, атеросклероза, острой метаболической недостаточности сердца, инфарктах миокарда, болезни Рейно, болезни Ходжкина, силикозах, гипертониях, полиартритах, хронических экземах, посттромботических состояниях, трофических язвах и др. /4, 51,66,78,84,95,99,123,124,126,146,172,176,199/.
Успехи медицины 40х-60х годов, связанные с применением сульфаниламидов, антибиотиков и других медикаментозных средств лечения, на время снизили интерес к этому эффективному и доступному
5. способу лечения. Последующее падение эффективности фармакотерапии в результате возникновения резистентных форм возбудителей инфекционных заболеваний, накопление большого количества побочных эффектов в результате длительного применения лекарственных средств, возникновение различных ферментопатий вновь обусловило значительный интерес к фотогемотерапии.
Вместе с тем, на сегодняшний день сложилась определенная диспропорция между широтой применения метода и пониманием тех механизмов, которые лежат в основе действия фотомодифицированнои крови. Механизмы фотогемотерапии можно разбить на две группы -первичные, включающие фотохимические реакции, происходящие непосредственно при облучении крови, а также темновые свободноради-кальные и ферментативные процессы непосредственно в крови, вторичные механизмы - совокупность реакций на всех уровнях интеграции, вплоть до системных ответов организма. Актуальность изучения механизмов фотогемотерапии продиктовано тем обстоятельством, что современная медицинская практика опирается на несколько эмпирических рекомендаций, найденных еще на заре применения метода, и вследствие этого, не может дифференцированно подходить к лечению различных заболеваний. Кроме того, остаются практически незатронутые вопросы, связанные с индикацией состояния крови после облучения. Следует отметить, что кровь является чрезвычайно гетерогенной системой, компоненты которой проявляют различную чувствительность как в отношении доз облучения, так и в отношении его спектрального состава.
Очевидно, что каждая модификация физико-химических и биологических характеристик крови при определенных условиях и параметрах облучения, будет иметь различную функциональную и/или терапевтическую значимость для организма рецепиента. Это особенно важно для больного организма, у которого резко сужены пределы адаптации.
Вычленение и анализ, физиологически и/или терапевтически значимых характеристик облученной крови,позволит разработать индексы терапевтической широты для различных модификаций крови, а также обосновать разработку технических средств воздействия на кровь.
Известно, что введение фотомодифицированной крови оказывает влияние на различные иммунные процессы организма, а также может повышать уровень его неспецифической резистентности. В этом плане представляет значительный интерес исследование модификаций иммунобиологических характеристик клеток крови, индуцированных оптическим излучением.
Цель и задачи исследования.
Изучить иммунобиологические характеристики клеток крови, облученных различными дозами оптического излучения разных участков спектра (248-578 нм), методами комплементнезависимых (агглютинация и розеткообразование) и комплементзависимых (ци-тотоксическое действие специфических антисывороток) реакций.
Изучить зависимость перестроек поверхностных структур клеток и связанных с этими перестройками изменений иммунобиологических характеристик фотомодифицированных клеток от условий облучения (в атмосфере азота, в присутствии антиоксидан-тов).
Научная новизна.
С помощью прямых и перекрестных серологических реакций агглютинации эритроцитов групп А(П) и В(ІІІ) впервые показано увеличение титров d - и & -агглютининов при физиологичес- ких дозах облучения с А 280-365 юл, что свидетельствует об увеличении сорбционных свойств поверхностных структур этих клеток как по отношению к специфическим агглютининам в прямых реакциях, так и к неспецифическим - в перекрестных. При этом,чувствительность к специфическим агглютининам превышает таковую в 20 раз для неспецифических агглютининов.
Анализ спектрофотометрических характеристик суспензий облученных эритроцитов выявил, что изменения их оптических спектров коррелирует с изменением сорбционных свойств этих клеток. Такая же зависимость установлена при изучении связывания Альци-анового синего фотомодифицированными эритроцитами. При воздействии минимальных доз оптического излучения характерна противоположная по отношению к облучению большими дозами тенденция изменений сорбционных свойств облученных эритроцитов.
В модельных экспериментах при помощи перекрестного истощения анти-Т- и анти-В-сывороток фотомодифицированншж сплено-цитами и тимоцитами, соответственно, впервые установлена возможность проявления на поверхности лимфоидных клеток антигенов, не типичных для этих клеток в интактном состоянии.
Впервые показано, что ингибиторы перекисного окисления липидов - антиоксиданти ( ъ( -токоферол, ионол) в физиологичес- —7 —fi ких концентрациях 10 -10 М в пределах использованных в работе доз нивелировали им/зуномодифицирующее действие оптического излучения на клетки, а также изменения спектральных характеристик облученных эритроцитов. Облучение в бескислородных условиях (в атмосфере азота) в физиологических дозах также не приводило к модификациям иммунобиологических характеристик лимфоцитов.
Практическая значимость работы.
Выявленная зависимость ряда иммунобиологических характе-
8. ристик облученных эритроцитов и лимфоцитов от процессов пере-кисного окисления липидов,позволяет управлять процессами, определяющими конечные характеристики клеток перед их реинфузи-ей, а также наметить пути для оптимального терапевтического сочетания медикаментозных средств и фотомодифшщрованнои ауто-крови. Кроме того, сравнительные исследования эффектов, вызываемых облучением различными участками спектра и доз, использованы в разработке аппаратуры для облучения крови и режимов ее работы.
Апробация.
Материалы диссертации докладывались и обсуждались на:
Ш Всесоюзной межуниверситетской конференции по "Физи-кохимической биологии", Тбилиси, 25-29 октября 1982 г. ІУ Всесоюзной межуниверситетской конференции по проблеме: "Биологические мембраны в норме и патологии", Кутаиси, 15-17 ноября 1983 г.
Заседании Бюро Проблемных комиссий АН СССР "Нейрогуморальная регуляция иммунного гомеостаза" и АМН СССР "Нервные механизмы защитно приспособительных реакций", посвященном научно-практическим аспектам проблемы "Изолированное облучение крови", Ленинград, 17 марта 1983 г.
Фотомодифицированная кровь - полимодальный биоактивный фактор
Клеточные и гуморальные компоненты крови, а также большое число различных гемодериватов применяются в современной клинике в качестве эффективного средства лечения многих заболеваний. С каждым годом увеличивается потребность медицинских учреждений в гемодериватах (эритроцитарная, лейкоцитарная, тромбоцитарная массы, взвеси, различные криопреципитаты, сыворотки, белки и т.п.), на производство которых расходуется значительная часть общего объема заготавливаемой крови. И тем не менее, спрос на эти гемодериваты не удовлетворяется ни в одной стране мира /18, 29/.
Мощным средством лечения большого числа патологий является аутологичная кровь, а также ее дериваты. Одним из производных аутологичной крови является кровь, обработанная различными излучениями (рентгеновским, микроволновым, оптическим). Наиболее перспективным и распространенным средством лечения и профилактики является реинфузия фотомодифицированной аутологичной крови (см.обзоры 2, 6, 56, 146, 197). Физиологически и терапевтически активными дериватами являются порции аутокрови, облученные ультрафиолетовым светом в спектральном диапазоне 248-365 нм.
Известно, что различные модификации крови при ее реинфу-зии могут приводить к разнонаправленным реакциям организма /7, 26/.
Возможность получения положительного терапевтического эф 10. фекта при введении в организм облученной ультрафиолетовым излучением аутокрови впервые была предложена Бехером в 1925 году /87/. Он исходил,при этом из бактерицидной активности УФ излучения, полагая, что воздействие ультрафиолета на циркулирующую кровь больного, позволит прямым способом провести обеззараживание ее при общей гнойничковой инфекции. Хотя эта исходная теоретическая посылка не оправдалась, метод реинфузии фотомодифицированной крови как средство борьбы с генерализованными инфекциями, стал успешно применяться в медицинской практике /84, 87, 146, I68-I7I/.
Абсорбционная фотометрия образцов проводилась на спектрофотометре Specord L/1/-VIS в диапазоне 200-800 нм, в поддиапазонах 200-350 нм и 350-800 нм. Запись спектров производилась с использованием шкалы оптической плотности, погрешность для которой составляла 1%. С целью избежания ошибок, связанных с оседанием клеток в процессе фотометрирования и светорассеиванием клеточной суспензии,спектры регистрировались при времени регистрации 2.2 мин в канале сравнения для "мутных" образцов.
Фотоальтерацию гликокаликса клеток изучали по методу Кры-ленкова и др. /41/, окрашивая их Альциановым синигл (АС) - кати-онным красителем (М.в.1382), который избирательно связывается с полисахаридами и гликопротеинами клеточной поверхности /182/. Использовался АС фирмы "Сшухарт".
Приготавливали 0.01 -ный раствор АС в ЗФР, который хранили при 4С. Исследуемые суспензии эритроцитов в ЗФР, объемом 2 млв концентрации 20 10 кл/мл, смешивали с 2 мл 0.01$ АС и инкубировали при комнатной температуре в течение 30 мин. Контроль представлял собою суспензию с равной концентрацией необ-лученных эритроцитов в ЗФР. После инкубации с АС облученные суспензии клеток центрифугировали при 800о в течение 5 мин при комнатной температуре. Надосадочную жидкость фотометриро-вали. В качестве контроля инкубация с АС производилась с ин-тактными суспензиями эритроцитов.
class3 ФОТОМОДИФИКАЦИЯ ИМУНОЛОГИЧЕСКИХ ХАРАКТЕРИСТИК
КЛЕТОК КРОВИ class3
Фотомодификация реакции агглютинации эритроцитов
В ряде работ исследуются механизмы реакций компонентов крови при ее облучении ультрафиолетовым светом, анализируется роль этих процессов в проявлении клинических эффектов реинфу-зии фотомодифицированной крови в организм человека /4,20,21, 46,46а,57а,57б,65,81,85,88,89/.
Вместе с тем, данные о фотоиндуцированных перестройках иммунобиологических характеристик компонентов крови носят весьма ограниченный характер.
Иммунобиологические характеристики клеток в организме являются наиболее значимыми в плане их информационных взаимоотношений при интеграции иммунного ответа. При облучении крови ультрафиолетовым светом, для придания ей терапевтических свойств в основном подвергаются перестройкам эритроциты, составляющие 41-46% общей массы крови.
Эритроцитарные антигенные маркеры (групповые антигены и др.) играют, по-видимому, важную роль в поддержании иммунного статуса организма /35а/, их количество, состояние и выраженность на поверхности клетки должны нести сигнальные функции для различных иммунных перестроек в организме. Не менее значимым является состояние поверхностных структур облученных лимфоид-ных клеток.
Как известно, иммунобиологические характеристики клеток определяются наличием и состоянием маркеров поверхности этих клеток - мембранных рецепторов и антигенов - входящих в качестве составной части гликокаликса клеток /156,157/, а также состоянием мембраны в целом. Поэтому, в данной серии экспериментов мы
43. изучали модификацию способности эритроцитов агглютинировать в зависимости от различных доз оптического излучения с X = 280-365 нм.
Особенности спектров поглощения растворов гемоглобина, облученных оптическим излучением различного спектрального состава
Сравнение спектральных характеристик исходных растворов гемоглобина (оксигемоглобина - НЬ ) и спектров суспензий эритроцитов не выявляют заметных различий по положению максимумов и интенсивностям полос этих спектров поглощения (см.рис. 4.І.І и рис.4.2.1). Можно видеть, что в этой области спектры эритроцитарных суспензий определяются спектральными характеристиками молекул оксигемоглобина. Максимумы спектров поглощения оксигемоглобина распределены как в видимой, так и в ультрафиолетовой части спектра, причем,в видимой области имеются выраженные максимумы поглощения при 576, 544 и 415 нм, а в ультрафиолетовой области спектра - при 350, 280 и 208 нм. Максимумы при 415 (полоса Соре) и 544 нм характеризуют собственно порфи-риновую часть молекулы гема. Более коротковолновые максимумы поглощения при 208 и 280 нм характеризуют, соответственно, поглощение пептидной связи, ароматических аминокислот и ультрафиолетовую часть спектра поглощения порфирина /8,40,45-47/.
Как можно видеть из рис,4.1.1 и таблицы 4.І.І, облучение оптическим излучением в диапазоне 248-578 нм растворов гемоглобина, приводит к монотонному снижению интенсивности указанных полос поглощения гемопротеида
Анализ сочетанного действия оптического излучения и антиоксидантов
Анализ сочетанного действия оптического излучения разного спектрального состава и антиоксидантов проводили при облучении лимфоцитов селезенки мыши оптическим излучением с Л =254 нм или с А =365 нм в нелетальных и небольших летальных дозах, в присутствии кислорода или в среде азота.
В недавно появившемся сообщении /36/ есть указание на возможность ингибирования антиоксидантами фотоиндуцированных перестроек антигенных свойств лимфоидных клеток. Мы повели детальное исследование этих эффектов с целью выявления роли молекулярного кислорода.
Представлены данные о влиянии Л -токоферола на чувствительность клеток селезенки мыши, облученных оптическим излучением с А =254 нм, к анти-Т- и анти-В-сывороткам. Добавление L -токоферола в клеточную взвесь существенно не влияет на чувствительность необлученных клеток к цитоксическому действию этих антисывороток. Повышенная чувствительность облученных клеток к антисывороткам снижается при добавлении.
