Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Применение ферментов в медицине 8
1.2. Модификация ферментов 10
1.2.1. Функциональные группы белков 11
1.2.2. Модификация белков природными и модифицированными природными полимерами 12
1.2.3. Модификация синтетическими полимерами 13
1.2.3.1. Системы депонирования белковых лекарств в организме 13
1.2.3.2. Модификация белков монофункциональными полимерами 14
1.2.3.3. Синтетические полифункциональные полимеры 16
1.2.4. Фермент-белковые конъюгаты 16
1.2.5. Проблемы биоконъюгации 19
1.3. Механизмы биологического действия РНКаз 20
1.4. Факторы, необходимые для проявления РНКазами биологического действия .23
1.5. Сывороточный альбумин человека (САЧ) 26
1.5.1. Метаболизм и распределение альбумина 26
1.5.2.1. Аминокислотная последовательность альбумина 27
1.5.2.2. Вторичная структура и доменная организация 29
1.5.2.3. Пространственная структура молекулы альбумина в растворе 30
1.5.2.4. Распределение аминокислотных остатков и зарядов 32
1.5.3. Физико-химические свойства молекулы САЧ 33
1.5.4. Влияние физико-химических факторов на структуру и свойства альбумина 34
1.5.4.1. Влияние значения рН среды 34
1.5.4.2. Денатурация макромолекулы САЧ 37
1.5.4.2.1. Температурная денатурация 37
1.5.4.2.2. Влияние мочевины на структуру САЧ 38
1.5.5. Функции альбумина в организме 38
1.5.5.1. Связывающие центры альбумина 39
1.5.5.1.1. Главные центры неспецифического связывания («лекарственные») 40
1.5.5.1.2. Центр связывания двухвалентных катионов 41
1.5.5.1.3. Тиоловая группа остатка Cys34 41
1.5.5.1.4. Центры связывания неэтерифицированных жирных кислот 41
1.5.5.1.5. «Минорные» центры 43
1.5.5.1.6. Билирубин связывающие центры 43
1.5.6. Группы молекулы САЧ, доступные для химической модификации 44
1.6. Получение конъюгатов ферментов с белками при помощи глутарового альдегида 45
1.6.1. Химическое поведение глутарового альдегида в растворе 45
1.6.2. Взаимодействие ГА с белками 47
1.6.3. Факторы, определяющие успешную иммобилизацию ферментов 50
Глава 2. Экспериментальная часть 53
2.1. Материалы и методы 53
2.2. Характеристика химических реактивов 62
2.3. Характеристика используемых белков 63
2.3.1. Рибонуклеаза из Bacillus Intermedins 7р 63
2.3.2. Бычья панкреатическая рибонуклеаза 65
Глава 3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Конъюгаты ферментов с сывороточным альбумином человека, их получение и характеристики .66
3.1.1. Получение и исследование физико-химических свойств безлигандного сывороточного альбумина
человека 66
3.1.2.Способ получения конъюгатов ферментов с БЛСАЧ 74
3.1.3. Исследование физико-химических характеристик конъюгатов и их биологической активности in vitro 80
3.1.3.1. Ферментативная активность конъюгатов 80
3.1.3.2. Определение «молекулярной массы» конъюгатов 83
3.1.3.3. Активность конъюгатов БЛСАЧ и панкреатической РНКазы в отношении двунитевой РНК 84
3.1.4. Способ очистки конъюгатов от примесных агрегатов САЧ 86
3.1.5. Изучение биологической активности конъюгатов in vivo 91
3.1.5.1. Пролонгация действия модифицированного фермента в организме 91
3.1.5.2. Исследование проникновения панкреатической рибонуклеазы через гематоэнцефалический барьер 94
3.2. Компьютерное моделирование межмолекулярных комплексов БЛСАЧ и РНКазы А...97
3.2.1. Молекулярный докинг обезжиренного альбумина и РНКазы А 97
3.2.2. Анализ поверхности контактов предполагаемых комплексов 101
3.2.3. Анализ влияния взаимодействия РНКазы А и обезжиренного САЧ на активность фермента 103
3.2.4. Анализ структуры центров связывания РНКазы А макромолекулы албьумина 109
3.2.5. Анализ возможных взаимодействий макромолекул в составе полимерного комплекса 111
3.2.6. Гидрофобные взаимодействия 114
3.2.7. Конформационный анализ 117
3.2.8. Предсказание биологической активности БЛСАЧ-модифицированных ферментов (РНКаз) 123
Заключение 128
Выводы 130
Список работ, в которых опубликовано основное содержание диссертации 131
Список цитируемой литературы 133
Приложения 163
- Модификация белков природными и модифицированными природными полимерами
- Факторы, необходимые для проявления РНКазами биологического действия
- Главные центры неспецифического связывания («лекарственные»)
- Ферментативная активность конъюгатов
Введение к работе
Разработка новых лекарств представляет собой длинный и трудный процесс, который включает в себя несколько стадий: идентификацию и валидацию цели, скрининг или дизайн лидирующего соединения, его оптимизацию, выделение или синтез и клинические испытания [1]. При этом она сопряжена с огромным числом непредвиденных сложных задач как научных, так и медицинских [2]. Современные подходы к разработке новых лекарственных средств основаны на понимании молекулярных механизмов как нормального развития живого организма, так и возникающих в нем патологических процессов. Поэтому в создании новых или модификации известных лекарственных средств все большую роль начинают играть подходы, основанные на молекулярной биофизике.
Особое место среди лекарственных средств занимают ферменты - макромолекулы белковой природы, имеющие разнообразную структуру и функцию, роль которых в фундаментальных биологических процессах делает их как превосходными мишенями для лекарств при многих заболеваниях, так и непосредственно действующими веществами при лечении многих патологий. В частности, рибонуклеазы (РНКазы) являются высокоактивными противовирусными средствами. Существенным недостатком нативных ферментов при внутривенном введении является короткое время удерживания их в кровеносной системе, а для ферментов из микробиальных источников еще и их токсичность.
Изменение физико-химических свойств и биологической активности белков путем посттрансляционной модификации является широко распространенной стратегией регуляции метаболических процессов в живой клетке. Особенно перспективными являются межмолекулярные комплексы (конъюгаты) активного фермента с инертным стабилизирующим носителем. При этом носитель не должен вызывать накопления препарата в отдельных органах и трудностей с его выведением из организма. Поэтому в качестве носителей удобнее всего использовать гомологичные транспортные белки плазмы крови, и в частности сывороточный альбумин человека (САЧ). Его физиологическая роль и уникальная способность связывать и переносить огромный спектр лигандов различной природы наряду с умеренной иммуногенностыо позволяют предполагать перспективность использования гомологичных альбуминов в качестве носителей лекарственных средств. Разработанные ранее системы гетероолигопротеинов на основе олигомеров гемоглобина и донорского сывороточного альбумина (САЧ) и
7 химически фиксированных на них молекул фермента позволяют стабилизировать и пролонгировать действие фермента. Однако такие гетероолигопротеины характеризуются высокой молекулярной массой и низким содержанием биологически активного вещества (не более 7%) и не могут быть эффективно использованы в качестве лекарственных препаратов. В связи с этим весьма актуальной является задача разработки на основе молекулярно-биофизического подхода рациональных путей модификации ферментных препаратов, а также создания и отбора наиболее эффективных и безопасных носителей.
Данная работа посвящена разработке биофизической стратегии конструирования высокоактивных ферментных препаратов пролонгированного действия, используя принципы и подходы, открытые природой и отобранные ею в результате эволюции. Стратегия основана на выявлении фундаментальных закономерностей взаимодействия лекарственных препаратов с транспортным белком плазмы крови человека (САЧ) и получению на их основе водорастворимых конъюгатов безлигандного сывороточного альбумина человека (БЛСАЧ) с панкреатической РНКазой и РНКазой из Bacillus intermedins 7Р с высоким содержанием и высокой биологической активностью действующего фермента. Применение этой стратегии позволит целенаправленно конструировать лекарственные препараты с новыми полезными фармакологическими свойствами.
Исследование особенностей взаимодействия САЧ с различными лигандами и лекарственными препаратами, в частности, со временем приобретает все большее фундаментальное и прикладное значение. Вследствие этого особую актуальность приобретает разработка новых способов очистки коммерческого альбумина от его лигандной нагрузки. Решение данной задачи позволит не только увеличить способность САЧ к связыванию с полипептидными препаратами и синтезировать высокоактивные лекарственные препараты, но и получить очищенный альбумин для исследования механизмов и движущих сил взаимодействия транспортного белка с обширным спектром соединений различной природы.
Рассмотрение проблемы «сохранения» биологической активности лекарственных веществ белковой природы с общих позиций физической и структурной химии: проведение теоретического анализа связи структуры комплексов транспортного белка с ферментом и биологической активностью последнего с использованием пакета специализированного программного обеспечения позволяет конструировать лекарственные препараты с заданными свойствами.
Модификация белков природными и модифицированными природными полимерами
Значительное место среди носителей, применяемых для иммобилизации белков, занимают природные полимеры (целлюлоза, декстраны, крахмал, хитин и др.) и их производные [41]. Эффективность применения в качестве носителей декстранов обусловлена высокой степенью их биосовместимости и утилизации в организме. Стрептокиназа была первым ферментом, модификация которого декстраном (35 кДа) позволила достигнуть значительного терапевтического эффекта. После утверждения к клиническому использованию для лечения сердечно-сосудистых и офтальмологических патологий, вызываемых тромбами, она широко используется под коммерческим названием стрептодеказа. Данный конъюгат стрептокиназы сохраняет свое действие до трех дней, в то время как исходная форма фермента находится в организме всего несколько минут. При использовании нативного фермента геморрагические осложнения или аллергические реакции наблюдали в 72,16 и 27% случаев соответственно, тогда как в случае применения стрептодеказы аналогичные проблемы уменьшились до 6 и 2%, соответственно [44].
Другой белок, который модифицировали декстраном - плазмин. Присоединение этого протеолитического фермента к оксидекстрану привело к образованию конъюгата, который сохранил до 85% начальной активности и также продемонстрировал фармакологические и иммунологические преимущества, описанные для стрептокиназы [45]. При связывании гемоглобина с бромоамино- или альдегиддекстраном получили продукты, полностью сохраняющие способность переносить кислород, но имеющие в 3-20 раз большее время циркуляции в крови по сравнению с нативным гемоглобином [46].
Тем не менее, декстран не получил всеобщего распространения в качестве полимерной производной для конъюгации ввиду возникновения определенных сложностей при сшивании. Поскольку и декстран, и белки являются полифункциональными молекулами, их присоединение часто приводит к образованию комплексов или гетерогенной смеси продуктов. Эту проблему обычно решают, используя монофункциональные полимеры [47], с помощью которых могут быть получены химически гомогенные препараты, включающие пептиды и белки. Однако, микрогетерогенность может иметь место и в этом случае, т. к. на поверхности макромолекулы последних присутствуют несколько аминокислотных остатков, причем все они реакционоспособны, но характеризуются различной доступностью и реактивностью [48]. Только в некоторых характерных случаях белковой конъюгации полифункциональные полимеры предпочтительнее монофункциональных. Как, например, в случае необходимости повышенной конформационной стабильности.
Использование синтетических полимеров для модификации ферментов обусловлено возможностью синтеза носителей желаемого молекулярного веса с достаточно низкой полидисперсностью и необходимой структурой. Благодаря сотрудничеству нескольких исследовательских групп под руководством R.Duncan, J. Kopecek и К. Ulbrich, а также корпорации Pharmacia, были получены замечательные результаты в биоконъюгации при производстве противоопухолевых препаратов [49, 50], которые представляют собой ангиогенин или меланоцит стимулирующий гормон, пришитый к Ы-(2-гидроксипропил)-метил-акриламиду (НРМА) [51], в которых нетоксичный водорастворимый полимер предохраняяет лабильное лекарство от деградации и снижает почечную ультрафильтрацию. Кроме того, эта новая конструкция благодаря своей специфической структуре позволяет использовать новые способы доставки к определенным органам - мишеням (таким как опухоли) [52].
Так, опухолевую локализацию конъюгата стимулирует высокий молекулярный вес полимера, поскольку сосудистый эпителий в этой области более рыхлый [53]. Кроме того, тканевая специфичность конъюгатов может достигаться с помощью пришивки антител или части Сахаров вдоль молекулы полимера-носителя [54 - 57], что направляет биоконъюгаты в область со специфичными для этих молекул лигандами.
Продолжительное поддержание концентрации лекарственного компонента может быть достигнуто с помощью имплантации или введения биодеградируемых полимерных систем с включенным в них белком [58]. Современные исследователи предлагают множество таких систем, которые включают широкий спектр разнообразных полимеров и липосомальные формы [59 - 64], например, полиэлектролитные микрокапсулы из декстран сульфата, протамина и метиламин формальдегида для капсулирования инсулина и пероксидазы [65]. Хотя многие технологические проблемы их получения уже разрешены, до сих пор остается ряд вопросов, касающихся, главным образом, сохранения стабильности белка как на стадии инкапсулирования, так и на стадии его высвобождения [66]. Было предложено несколько методов преодоления этой нестабильности [67], но пока только одна такая система, в которой рекомбинантный гормон роста человека высвобождается из гидрофобного матрикса, представляющего собой сополимер молочной и гликолевой кислот (PLGA), вышла на рынок США в 1998 году: Nutropin Depot (Genentech). Медленная деградация матрикса приводит к постепенному высвобождению белка в постоянной терапевтической концентрации в течение 4 недель, против 20 часов при подкожной инъекции рекомбинантного человеческого гормона роста [68]. Однако, в 2004 продукт был отозван с рынка в силу сложностей производства и поставки продукта пациентам.
В настоящее время для биоконъюгации используется несколько монофункциональных полимеров, таких как ПЭГ, новая форма поли(СУУ-винил-пирролидон) и поли(\\ -акрилоилморфолин) [37], поли(оксазолины), поливиниловый спирт) [69]. Использование наиболее изученного среди них ПЭГ [70] одобрено Обществом по питанию и лекарственным препаратам США (FDA) для использования в медицине, продуктах питания и косметологии, поскольку этот полимер не токсичен, не иммуно-генен, не антигенен и хорошо растворим в воде [20, 33, 71]. Модификация с использованием ПЭГ получила название «пегилирование». Таким образом, были получены и уже выпущены на рынок конъюгаты ПЭГ-аспарагиназа (Oncaspar, Enzon), который используется в терапии острой лимфобластной лейкемии [72], и два ПЭГ-конъюгата а-интерферона (Pegasys, Roche) [73] и PEG-Intron (Schering-Plough) [74]), применяемые для борьбы с различными формами инфекционного гепатита С. Также в лечебной практике используются конъюгированные с ПЭГ белки, такие как ингибитор агпротеиназы человека (Aralast, Alpha Therapeutic Corp.) и аденозин дисмутаза (Adagen, Enzon) [75].
Данный метод модификации позволяет значительно увеличить время «жизни» препаратов в организме, снизить или исключить иммуногенность и повысить устойчивость в отношении метаболических ферментов. Такая модификация обычно значительно улучшает терапевтическую эффективность белков [75]. Например, действие препарата PEG-Intron в 3 раза эффективнее немодифицированного интерферона. РНКаза семени быка (Bs-РНКаза), находясь в конъюгате с ПЭГ, обладает очень низкой антигенностью и колоссальной антиопухолевой активностью в сравнении с нативным ферментом [76]. Некоторые ПЭГ-производные супероксидисмутазы (SOD) уже находятся на стадии клинических испытаний. Они показали более медленное всасывание конъюгата при подкожном или внутримышечном введении и значительный рост времени пребывания в организме после внутривенного введения (от 2-3 мин для нативного фермента до нескольких суток для ПЭГ-конъюгатов) [77].
Факторы, необходимые для проявления РНКазами биологического действия
Первая необходимая ступень - взаимодействие фермента и плазматической мембраны целевой клетки (рис. 1.2). Показано, что РНКазы из лягшек Rana catesbeiana и Rana japonica связываются избирательно с плазменной мембраной раковых клеток [156, 157], а биназа преимущественно уничтожает клетки, экспрессирующие ras-онкоген [158]. Однако, является ли это связывание специфичным не установлено, поскольку рецепторы, с которыми взаимодействуют РНКазы, до сих пор не идентифицированы и невыясно, являются ли эти рецепторы свойственными раковым клеткам разного вида.
Известно, что связывание РНКаз панкреатического типа с мембраной и способ их проникновения в клетку отличается от такового, характерного для других белковых токсинов, которые преодолевают плазматическую мембрану через эндосомальные (дифтерийный токсин) [159] и пост-эндосомальные отделы (рицин, шига токсин) [160, 161]. Отличительной особенностью проникновения РНКаз в клетку является поступление РНКаз в цитозоль посредством транспорта из эндосом и пре-эндотелиального ретикулума, независимость эндоцитоза от динамина и ненасыщаемый характер данного процесса [143, 162,163].
Биологическое действие, проявляемое РНКазами в клетках и тканях зависит от РНКазной активности [152, 154, 164,]. Было показано, что модификации РНКаз, которые сопровождаются потерей ферментативной активности, приводит к утрате биологического действия ферментов [165,166].
Рибонуклеазная активность фермента - не единственное необходимое условие биологической активности РНКаз. Так, РНКаза А в 500 раз более эффективно катализирует растепление РНК по сравнению с гомологичным ей белком - онконазой, однако, она почти не токсична для раковых клеток при внеклеточном введении. Замены в положении Gly88 позволяют РНКазе А стать цитотоксичной [154]. Клетки млекопитающих содержат цитоплазматический ингибитор РНКаз (RI). Экспериментальные данные убедительно доказывают, что биологическая активность РНКаз коррелирует с их способностью избегать взаимодействия с RI. Предполагается, что не столь яркое проявление биологических свойств РНКазой А обусловлено именно тесным нековалент-ным взаимодействием RI и РНКазы А - одним из самых сильных известных белок-белковых взаимодействий, которое характеризуется Kd порядка фемтомолей ( = 4 10 14 М) [163]. В то же время мутантные варианты РНКазы А с заменами D38R/R39D/N67R/ G88R, имеющие в 20-106 раз меньшее сродство к RI, проявляют значительно более высокую токсичность по отношению к раковым клеткам человека, претерпевая при этом незначительные изменения конформационной стабильности и каталитической активности [167].
Кроме того, показано, что биологическая активность экзогенных ферментов, используемых в качестве лекарственных препаратов, тем выше, чем дальше степень физиологической удаленности данного фермента от организма - акцептора [168, 169]. Считают, что устойчивость онконазы и Bs-РНКазы к действию RI (для онконазы в 108 раз более низкое сродство к RI, чем у РНКазы А [170, 171]) позволяет данным ферментам проявлять высокую противоопухолевую активность, компенсируя даже свойственную им низкую ферментативную активность [165, 172]. РНКазы грибов и бактерий также слабо инактивируются RI. Установлено, что человеческий RI не ингибирует действия микробиального фермента из Streptomyces aureofaciens (РНКазы Sa) [173]. Предполагают, что вследствие этого при введении в организм микробиальных ферментов происходит более интенсивное повышение ферментативной активности, что и обусловливает более эффективное противовирусное действие РНКаз микробиального происхождения [174].
Еще одной ключевой детерминантой проявления биологической активности данной группы ферментов является их высокая стабильность [175]. Установлено, что конформационная стабильность прямо коррелирует с биологической активностью, также как и с устойчивостью к протеолитической деградации [176]. Гликозилированные формы РНКазы А [177], равно как и конъюгаты нативной РНКазы А и ее олигомеров с ПЭГ, обладающие повышенной стабильностью и устойчивостью к протеолизу, показали значительное увеличение ингибирующего действия на рост опухолевых клеток меланомы UB900518 in vivo [178]. При этом они, как и свободные олигомеры РНКазы А, лишены эмбриотоксической активности [179]. Это указывает на то, что конформационная стабильность связана с чувствительностью к протеолизу in vitro и что цито-токсичность коррелирует с конформационной стабильностью [176].
Из всего сказанного выше видно, что помимо основной функции деградации РНК в пищеварительном тракте, члены семейства панкреатических РНКаз, как полагают, являются частью древней эволюционной системы антивирусной и антипаразитарной защиты организма. После проникновения в клетку РНКазы проявляют различное биологическое действие, в том числе противовирусное и противоопухолевое. Важнейшими факторами для проявления биологической активности ферментов являются 1) их способность связываться с мембраной и проникать в клетку; 2) избегая взаимодействия с цитоплазматическим ингибитором РНКаз, сохранять каталитическую активность и избирательно деградировать вирусную РНК или tPHK раковой клетки; 3) стабильность и устойчивость к протеолизу.
Главные центры неспецифического связывания («лекарственные»)
За многие годы изучения связывания альбумином биологически значимых соединений сложились следующие представления о связывающих центрах. Существуют два главных неспецифических центра связывания лекарств - центры I и II (так называемые сайты Sudlow I и Sudlow II; рис. 1.9). Центр I находится в субдомене ПА, его маркерами являются варфарин, азопропазон и фенилбутазон. Связывание лигандов с этим центром происходит за счет Ван-дер-ваальсовых и гидрофобных взаимодействий [256]. Центр II, маркерами которого являются иопановая кислота и бензодиазепам, находится в субдомене III А. Он образован катионной областью на поверхности макро молекулы и гидрофобным карманом. В приложении 1 (табл. 1) приведены аминокислотные остатки, которые участвуют в связывании лигандов в этих центрах.
При изучении связывания лигандов различной длины было установлено, что глубина связывающего центра Sudlow І (варфаринового) составляет 1,9 нм, а размеры центра Sudlow II (бензодиазепамового) -1,2-1,6 нм в глубину и 0,6-0,8 нм в ширину [257]. Эти представления хорошо согласуются с моделью J.R. Brown, согласно которой гидрофобный канал в домене защищен от молекул воды "стенками" из а-спиралей. С этой точки зрения, отсутствие связывающей области в субдомене IA (гомологичном доменам НА и IIIA) можно объяснить отсутствием дисульфидной связи с Cys34 и растянутостью белковой цепи после остатка Cys62, что устраняет потенциальный связывающий регион [197,258].
Кроме того, на поверхности макромолекулы САЧ существуют специфические центры связывания. Так, изучение связывания ионов металлов с различными мутантными вариантами альбумина показало, что в первом домене существует место связывания для двух-валентных катионов Ni2+, Са2+, Zn2+, Cu2+, которое характеризуется очень высокой константой связывания (для Си2+ она составляет около 10 л/моль). Этот центр связывания образован N-концевым трипентидом Asp-Ala-His. Считается, а-аминогруппа и карбоксильная группа аспарагина, имидазольная группа гистидина и два депротонированных пептидных азота (Ala-NH и His-NH) [259] образуют плоский комплекс с ионом металла, в котором последний фиксирован четырьмя координационными связями [260], Этот аминокислотный остаток рассматривается как место ковалентного присоединения ионов меди CuI+ или Си2+, а также некоторых органических соединений, в частности, окиси азота [261].
Основным физиологическим лигандом САЧ являются ненасыщенные жирные кислоты (FA) с длинной цепью. Связывание FA с САЧ исследовали в течение 40 лет, однако понимание этих взаимодействий до сих пор далеко не достигнуто. Для связывания неэтерифицированных жирных кислот (НЭЖК) имеются участки альбумина, отличные от мест связывания лекарств [212, 262, 263]. Структурные исследования, проведенные Curry S. и соавторами показало, что все семь сайтов связывания являются общими для насыщенных и ненасыщенных жирных кислот с различной длиной цепи С 10:0 - С20:4 (от декановой до арахидоновой кислот, соответственно) [264, 265]. Они расположены во всех трех гомологичных доменах САЧ (рис. 1.10, [266]): FA 1 в субдомене IB, FA 2 связывается между субдоменами IA и ПА, FA 3 и FA 4 размещаются в ША, FA 5 внутри ШВ, FA 6 втиснута между IA и ИВ, и FA 7 связывается внутри гидрофобного кармана в ПА. Наблюдается некоторое сходство в способах связывания жирных кислот в различных сайтах. Для FA 1-5 карбоксильные части жирных кислот прикрепляются электростатическими взаимодействиями к основным и полярным боковым цепям независимо от длины цепи, тогда как метиленовые хвосты размещаются внутри глубоких гидрофобных впадин. Данный способ связывания имеет место как в случае короткого и широкого «кармана» (сайты FA 1 и FA 3), так и для узкого, но глубокого (сайты FA 2, FA 4 и FA 5). Поскольку в энергию связывания вносят вклад и электростатические и гидрофобные взаимодействия, то сродство быстро увеличивается с ростом длины метиленового хвоста. Напротив, в сайте FA 6 в домене II САЧ нет основных и полярных боковых цепей для заякоривания карбоксилатной части связанной жирной кислоты.
Применение комплекса биохимических и биофизических методов исследований привело к заключению, что существует два или три высокоаффинных сайта связывания ЖК и, по крайней мере, три дополнительных сайта связывания с меньшей аффинностью (рис. 1.10). Предполагается, что высокоаффинные сайты связывания локализованы в доменах I и III, связывание осуществляется посредством комбинирования гидрофобных и электростатических взаимодействий [267]. Хотя имеются данные о расположении первичного центра в субдомене II [268]. По мнению Curry S. и соавторов связывание в центрах 2, 4 и 5 идет с высокой аффинностью, в то время как центры связывания 1, 3, 6 и 7 характеризуются низким сродством к данному лиганду [269]. В норме молекула альбумина содержит 0,4 - 3 молекулы НЭЖК. Ассоциация с жирными кислотами может вызывать конформационные трансформации молекулы САЧ и тем самым изменять характер взаимодействия САЧ с другими лигандами, в частности с лекарствами
Ферментативная активность конъюгатов
Задача сохранения ферментативной активности иммобилизованных ферментов является одной из центральных в биоконъюгации. Панкреатическая РНКаза и химотрипсин полностью сохраняли свою специфическую активность, как в составе полимерных комплексов, так и конъюгатов, полученных на основе БЛСАЧ по разработанному авторами методу. Однако, на стадии комплексообразования бактериальной РНКазы с БЛСАЧ мы наблюдали падение ферментативной активности. А именно, комплексы, образованные РНКазой Bacillus intermedins 7Р и свежерастворенным БЛСАЧ, сохраняли только 40-60% активности. Взаимодействие этого фермента с исходным САЧ, а также с БЛСАЧ через 2 ч после его растворения не сопровождалось ни уменьшением активности комплексов, ни изменением объемов выхода содержащих их фракций при хроматографии по сравнению с таковыми, характерными для исходных белков.
Поэтому представлялось важным ответить на вопрос: связано ли уменьшение активности в данном поликомплексе с инактивацией фермента или это наблюдение следует объяснять недоступностью его активного центра? В последнем случае латентная ферментативная активность может проявиться, например, при протеолитическом расщеплении олигоальбумина.
Для выяснения причин частичной утраты ферментативной активности РНКазой из Bacillus intermedius 7Р в составе комплекса с БЛСАЧ нами проведен модельный эксперимент. Полимерный комплекс был зафиксирован глутаровым альдегидом и получены конъюгаты РНКазьіВі с БЛСАЧ, а также олигоальбумин аналогичной молекулярной массы. Ферментативная активность полимерного комплекса при проведении соконденсации сохранялась полностью. Затем были подобраны условия, при которых трипсин расщеплял олигоальбумин, но не бактериальную РНКазу (трипсин в концентрации 0,03 мг/мл в 0,05 М Na-фосфатном буферном растворе, рН 6,5 при концентрации белка 4,3 мг/мл). Продукты протеолиза олигоальбумина разделяли гельхроматографией на колонке с Sephadex G-150. Приведенная на рисунке 3.9 хроматограмма показывает, что в этих условиях олигоальбумины подвергаются гидролизу до более мелких компонентов. В заданных экспериментальных условиях наблюдали за изменением активности бактериальной РНКазы и ее конъюгата с БЛСАЧ в течение 100 ч при комнатной температуре (рис. 3.10). За время эксперимента активность самой бактериальной РНКазы в растворе немного падала, присутствие трипсина на этом процессе не сказывалось. Конъюгат БЛСАЧ-РНКаза Bacillus intermedius 7Р сохранял активность в растворе в течение всего времени эксперимента, что свидетельствует о стабилизации фермента в составе конъюгата. При добавлении трипсина к раствору конъюгата БЛСАЧ-РНКаза в условиях, вызывающих протеолиз олигоальбумина, рибонуклеазная активность росла, достигая практически полной активности фермента, взятого и реакцию комплексообразования. Таким образом, можно прийти к заключению, что взаимодействие фермента со свежерастворенным БЛСАЧ приводило к образованию "депо" ферментативной активности, которая высвобождалась при протеолизе альбуминовой составляющей конъюгата, причем эта скрытая активность была сосредоточена главным образом в первой, более высокомолекулярной фракции. Все сказанное позволяет сделать вывод, что использование освобожденного от лигандов САЧ одновременно с предложенным методом получения конъюгатов позволило создать макромолекулярные «микрореакторы», способные под действием эндогенных протеиназ постепенно высвобождать действующий биологически активный компонент во время пребывания в организме. Этот пример еще раз красноречиво показал уникальность каждой ферментной системы и настоятельную необходимость тщательного подбора условий модификации в каждом конкретном случае.
Характеристика полученных конъюгатов в отношение такого параметра, как молекулярная масса (ММ) (в данном случае корректнее говорить о кажущейся молекулярной массе конъюгатов) имеет не меньшее значение, поскольку именно с ним преимущественно связана продолжительность циркуляции препарата в организме -реципиенте. Для определения «кажущихся молекулярных масс» (КММ) компонентов во фракциях I и II после гельхроматографического разделения мы применили использовавшейся ранее метод определения молекулярно-массового распределения конъюгатов олигоальбумина с панкреатической РНКазой гельпроникающей хроматографией на колонке с Сефарозой 6Р после градуировки колонки набором реперных глобулярных белков в диапазоне молекулярных масс 10 - - 440 кДА. Однако, поскольку при образовании комплексов с БЛСАЧ происходит «компактизация» (см табл. 3.1), метод гельхроматографии дает искаженные данные о молекулярных массах конъюгатов. В таком случае более корректно сравнивать размеры реперных и исследуемых белков после их частичной денатурации. Поскольку, применяемый нами в хроматографическом методе носитель (Сефароза), исключает использование детергентов, применили метод электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия в 7,0 % полиакриламидном геле (SDS-ПААГ-ЭФ). Для расщепления S-S-связей в белках использовали Р-меркаптоэтанол. Градуировку проводили с помощью набора реперных белков в интервале молекулярных масс 18,5 - 440 кДа. Результаты определения КММ конъюгатов БЛСАЧ и панкреатической РНКазы методом SDS-ПААГ-ЭФ представлены в таблице 3.4. Аналогичные результаты получены для конъюгатов БЛСАЧ-РНКаза Bacillus intermedins 7Р.
