Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 11
Регуляция калиевого гомеостаза клетки 11
Особенности диффузии в цитоплазме 18
Содержание актина в клетке 23
Полимеризация и диссоциация F-актина 24
Актин и АТФ 27
Актин и действие физических факторов 29
Актин и подвижность 34
Вязкость актина 37
Кинетика полимеризации актина 39
Полимеризация актина, обусловленная ионом К' 42
Глава 2. Методы и объект исследования 47
Физические принципы электронно-зондового микроанализа 47
Основы метода freeze-drying 51
Моделирование процесса переноса вещества в условиях влияния продуктов реакции на диффузионные свойства среды 54
Глава 3. Результаты исследования и их обсуждение 60
Изменение концентрации калия в зиготе мыши на фазах первого клеточного цикла (анализ цикличности изменения калия в цитоплазме зиготы) 60
Расчет коэффициента диффузии калия в зиготе мыши 63
Модель калий обусловленной полимеризации актина в цитоплазме зиготы мыши (полимеризация актина - механизм диффузии связанного калия в зиготе) 66
Модель гетерогенного распределения калия в зиготе мыши (формирование в клетке структуры, депонирующей калий) 69
Модель диффузии ионов К+ в актиновом геле (диффузия свободного иона К+ и его роль в стабилизации ячеек актинового геля) 71
Динамическая модель актинового геля 76
Моделирование диффузии калия в зиготе мыши в условиях калий обусловленной полимеризации актина 80
Заключение 88
Выводы 89
Цитируемая литература 90
- Особенности диффузии в цитоплазме
- Актин и действие физических факторов
- Моделирование процесса переноса вещества в условиях влияния продуктов реакции на диффузионные свойства среды
- Расчет коэффициента диффузии калия в зиготе мыши
Введение к работе
Актуальность темы.
Из феноменологической теории следует, что митотическое деление клетки сопряжено с рядом условий: повышение внутриклеточной концентрации натрия; уменьшение по абсолютной величине мембранного потенциала, приобретение клеткой сферической формы (Cone, 1969; 1971). Одновременно было показано, что подготовка к митозу проходит на фоне трансформации калиевого гомеостаза клетки (Hempling, 1958; Shank et al.5 1973). Этот процесс вызывает изменение концентрации калия во всей цитоплазме и поэтому, протекает относительно медленно, растягиваясь во времени на все фазы клеточного деления.
Первый клеточный цикл эмбриональной клетки (зиготы) качественно
отличается от митоза специализированной клетки. Зигота - уникальное
состояние, когда в пространственных рамках одной клетки осуществляется
переход от мейотического к митотическому способу деления. В течение
первого клеточного цикла одновременно реализуется две клеточные
программы: завершение развития ооцита и начало дифференцировки. За этот
период раннего эмбриогенеза полностью преобразуются функциональные
свойства одноклеточного эмбриона. Именно на стадии подготовки зиготы к
делению формируется тотипотентность бластомера и биологическая
полифункциональность, которая, расщепляясь в процессе морфогенеза,
трансформируется в множественность типов специализированных клеток.
Уникальность зиготы млекопитающих во многом определяют условия окружающей ее среды. Интригу вносит то, что развитие зародыша млекопитающих протекает при гипоксии (Newsholme, Leech, 1989; Macphee et al., 1994; Donnay, Leese, 1999; Sturmey, Leese, 2003). Однако для зиготы гипоксические условия представляют составляющую нормального развития, в то время как для специализированной клетки - экстремальную ситуацию. Возможно, это является причиной того, что на начальной стадии доимплантационного развития у раннего зародыша редуцировано окислительное фосфорилирование - эффективная система синтеза АТФ (Stem et al., 1971; Blggers, Borland, 1976; Drovak et al., 1985; Houghton et al., 1996). При этом в полном объеме еще не сложился и комплекс ферментов, поддерживающий гликолиз - более древний способ обеспечения клетки энергией (Gilbert, Colton, 1999).
Указанные различия между специализированной и эмбриональной клетками, по-видимому, обусловлены тем, что гены многих белков (ферментов), участвующих в энергетическом метаболизме и регуляции транспорта ионов, экспрессируются только после оплодотворения по мере созревания раннего зародыша (Harvey et al., 1995; Leese, 1995; Semenza, 1999, 2000; Wenger, Gassman, 1999; Wenger, 2000; Hamatani et al, 2004). В последней работе подчеркивается, что первый пик транскрипции ДНК de novo соотносится с активацией генома зиготы. Это может объяснить низкий
уровень Na"7K"h-ATOa3bi или NaVH4" обмена и, в результате, относительное закисление внутриклеточного рН (6.8) у раннего эмбриона (Baltz et al., 1991).
Трансформация системы транспорта ионов продолжается весь предымлантационный период развития эмбриона. Например, у зиготы не показан механизм Na+/tT обмена, который обязательно присутствует на мембране дифференцированной клетки (Baltz et al., 1990; Baltz et al., 1993). Вплоть до стадии ранней бластоцисты прогнозируется наличие внутриклеточного дефицита калия, обусловленного низким уровнем Na/K-АТФазы (Powers, Tupper, 1977; Watson, Kidder, 1988; VanWikle, Campione, 1991; Baltz et al, 1997). Пока не ясно на стадии транскрипции, трансляции или модификации белков, встроенных в мембрану клетки, осуществляется комплектация ионтранспортирующеи системы в течение первого клеточного цикла.
Изложенное выше позволяет предположить, что регуляция ионного
гомеостаза зиготы осуществляется древними, эволюционно обусловленными
системами, которые теряют свою активность после имплантации в процессе
«кислородной» дифференцировки. Например, в эмбриональной клетке, на
фоне дефицита калия, должен накапливаться натрий, В отличие от
специализированной клетки этот феномен обусловлен не компенсацией
клеточного ацидоза, а транспортом кальция из цитоплазмы эмбриональной
клетки через обратный Na /Са обмен (DiPolo 1989; Crespo et al., 1990). Этот
механизм использует градиент натрия на цитоплазматической мембране для
того, чтобы вывести один катион Са + в обмен на вход трех катионов Na+ (Rueter, Seitz, 1968; Baker et al., 1969; Eisner, Lederer, 1985; Crespo et al., 1990). Рассматриваемый антипорт зависит от потенциала на цитоплазматической мембране и может быть обратим (Carroll, 2000). Специфическим для клетки раннего эмбриона является 240 pS К1" канал (Day et al., 1993; 1998; 2001).
Особенность в обеспечении зиготы энергией, отсутствие у нее системы транспорта ионов, характерной для специализированной клетки, наличие специфических ионтраиспортирующих систем предполагает формирование особого калиевого гомеостаза. Конкретику в прогноз об изменении содержания калия в одноклеточном эмбрионе вносит 240 pS К+ канал. Эффективность и длительность активной фазы этого канала позволяют предположить колебания концентрации цитоплазматического калия в течение первого клеточного цикла. Учитывая свойства 240 pS К+ канала, колебания должны быть синхронизированы с фазами развития зиготы и иметь амплитуду, достаточную для того, чтобы индуцировать молекулярно-генетические изменения в эмбрионе.
Несмотря на интерес к этой проблеме, исследование внутриклеточного
калия в зиготе млекопитающих оставалось невозможным. Основной
причиной было отсутствие прямого метода измерения концентрации
элемента в отдельной клетке, таких малых размеров (—80 мкм) как эмбрион.
Развитие технология электронно-зондового микроанализа позволило
преодолеть это ограничение и обеспечило подходы не только для измерения концентрации калия в цитоплазме зародыша, но и для изучения локального распределения элемента в клетке (Погорелов и др., 2004; 2005). В работе основной акцент сделан на математическом моделировании процессов диффузии и накопления калия в одноклеточном эмбрионе мыши на основе экспериментальных данных электронно-зондового микроанализа (Гольдштейн и др., 2004а; 20046; Погорелов и др., 2005а; 20056).
Цель и основные задачи исследований
В связи с изложенным, целью настоящей работы было: используя результаты электронно-зондового микроанализа, оценить параметры диффузии иона К+ в условиях цитоплазмы зиготы мыши. Центральным был вопрос создания математической модели распространения и компартментализации цитоплазматического калия в течение первого клеточного цикла. Для достижения цели необходимо было решить следующие основные задачи:
Разработать метод цифровой регистрации кривой распределения характеристического рентгеновского излучения К Ка вдоль линии сканирования по клетке;
Разработать метод расчета локальной концентрации калия по кривым распределения интенсивности характеристического рентгеновского излучения К Ка;
Получить кривые распределения концентрации калия для цитоплазмы зиготы мыши на разных фазах развития эмбриона;
Разработать математический алгоритм анализа диффузии калия в условиях цитоплазмы зиготы.
Научная новизна
Получены кривые распределения концентрации калия в цитоплазме зиготы мыши на разных фазах развития эмбриона;
Показано, что цитоплазматическии калий распределен в зиготе мыши гетерогенно;
Впервые выявлено, что пространственное распределение депо калия в одноклеточном эмбрионе мыши имеет радиальную симметрию и меняется со временем;
Определен порядок величины коэффициента диффузии калия в цитоплазме зиготы мыши;
Практическая значимость
Разработан метод цифровой регистрации кривых распределения интенсивности рентгеновского излучения для кристалл-дифракционных спектрометров сканирующего электронного микроскопа JSM-U3 (JEOL, Япония);
Разработан метод перевода в цифровой вид кривых распределения
интенсивности рентгеновского излучения, записанных в аналоговой
форме на фотоматериале;
Предложен алгоритм количественной обработки кривых распределения интенсивности рентгеновского излучения;
Предложен алгоритм оценки коэффициента диффузии калия в клетке по данным электронно-зондового микроанализа
Апробация работы
Основные результаты диссертационной работы представлены на совместном заседании секций Ученого совета ИТЭБ РАН «биосинергетика» и «биологическая подвижность», XIV Российском симпозиуме по растровой электронной микроскопии и аналитическим методам исследования твердых тел (Черноголовка, 2005) и V Сибирском физиологическом съезде (Томск, 2005).
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания методов, главы собственных исследований, заключения, выводов и указателя литературы. Работа изложена на 122 страницах, включает 7 таблиц и 22 рисунка, В списке цитируемой литературы указано 234 источника.
Публикации.
По материалам диссертации опубликовано 7 печатных работ из них 5 статей в реферируемых журналах.
Особенности диффузии в цитоплазме
Диффузия - это процесс переноса вещества из одной части системы в другую, вызванный тепловым движением молекул (Туницкий, Н.Н., 1970). Растворенные вещества часто диффундируют через границу раздела к областям с более высокой концентрацией (Эрдеи-Груз, Т., 1976). В отличие от случая термической энергии, которая всегда переносится в направлении снижения температуры (в т.ч. перенос через границу раздела) и для достижения равновесия требует равенства температуры в любой точке системы, при диффузии концентрации обычно различаются с обеих сторон поверхности раздела, даже при достижении равновесного состояния (Эрдеи Груз, Т., 1976). Условием диффузионного равновесия является равенство химических потенциалов в каждой точке системы, и равным химическим потенциалам в разных фазах могут соответствовать значительно различающиеся концентрациии (Эрдеи-Груз, Т., 1976). Уставновление стационарного состояния при диффузии требует много времени (Эрдеи-Груз, Т., 1976). Точность описания явления трения при диффузии с применением приближенного закона Стокса повышается при увеличении молекул растворенного вещества по сравнению с молекулами растворителя и при повышении центральной симметрии диффундирующих молекул (Эрдеи-Груз, Т., 1976).
Водный матрикс окружающий и содержащий элементы цитоплазматического пространства определяется как цитозоль. (Lardy, 1965). Однако цитоплазматический матрикс нельзя рассматривать просто в качестве жидкости, несмотря на содержание воды порядка 75-80% от общего веса (De Robertis et al., 1970). Цитоплазма содержит 20% белка (Lanni et al., 1985; Fulton, 1982) и обладает свойствами вязкоупругого геля (Conklin,1940; Marsland, 1942; Frey-Wissling, 1953; Allen, 1961; Pollard,1984; Porter, 1984, Stossel et al., 1985; Taylor and Condeelis, 1979, Taylor and Fecliheimer, 1982). Данный гель представлен в виде сети цитоскелетных филаментов, которые в основном представлены мышечными микрофиламентами F-актина. (Allen, 1961; Hartwig and Stossel, 1979; Taylor and Fechheimer,1982; Pollard,1984; Wolosewick and Porter, 1979; Schliwa and Van Blerkom, 1981). Диффузия макромолекул в пористых средах (гелях) представляет интерес для различных областей биологической науки. Данный процесс существен при использовании методов биотехнологического разделения, таких как электрофорез, size-exclusion хроматография (Pluen A et al, 2000).
В качестве модели для изучения данного процесса можно рассматривать диффузию внутриклеточной жидкости и растворенных веществ в растворах фибриллярных белков, которая в значительной степени ограничивается плотностью и геометрией цитоскелетных полимеров, связанных с формированием и интегрированием цитоплазматического матрикса (Leterrier JF, 2001), или геле, представляющем сеть, составленную из перекрывающихся, поперечно-связанных цепей. В качестве основного параметра обычно рассматривается размер поры или ячейки (Doi and Edwards, 1986). Диффузию полимера в фиксированной сети определяют как движение цепи в цилиндре; таким образом, цепи, формирующие гель, рассматривают как неподвижные тормозящие образования (Doi and Edwards, 1986). Структуры цитоскелета четко регулируются действием специфических белков, определяющих длину филаментов посредством capping и severing активности, объединяющих филаменты в связки с образованием трехмерных структур (Stossel et al, 1985). Ранние исследования показали (Hou L et al, 1990), что диффузия FTC-Ficoll трассера в запутанной сети F-актина зависит от его размеров. Исследования, проведенные с использованием трассеров 50-70 нм в диаметре в растворе F-актина выявили, что при определенных условиях процесс диффузии не зависит от длины актиновых филаментов. Однако, в некоторых случаях, в условиях длины филаментов менее 1.0 цм наблюдалось замедление диффузии. Использование CL (cross-linking) агентов изменяло геометрию сети актиновых филаментов, что могло, как ускорять диффузию, так и замедлять ее, в зависимости от используемого вещества. (Jones et al, 1996). Результаты, полученные в условиях концентрации актина 1 мг/мл показали, что маленькие бусинки (0,09 мкм в диаметре) диффундируют также как в водном растворе, в то время как бусинки размеров порядка 0,5 мкм в диаметре неподвижны. Измерение параметров движения бусинок среднего размера выявили, что диффузия тормозится (по сравнению с водным раствором) и что поведение во времени не может быть представлено как простой диффузионный процесс. Более того, в условиях торможения диффузии, наблюдаемой для расстояний свыше 1 мкм, бусинки диаметром 0,23 мкм демонстрировали на более коротких дистанциях более быстрое движение. На основе измерения скорости этого быстрого движения было сделано предположение о том, что бусинка пребывает в клетке со стороной порядка 0,67 мкм, равной длине филамента содержащего 250 субъединиц. (Qian Н et al, 1992). Коэффициент диффузии актинового мономера в геле образованном вокруг бусинки, облицованной ActA (в том числе фрагментами ActA) бактериального фактора, ответственного за актин обусловленное движение Listeria monocytogenes равен примерно 2x10"8 см2/с (Plastino J et al, 2004). Отношение D/D0 коэффициентов диффузии частиц Ficol 400 или Ficol 70 в раствора F-актина и водного раствора монотонно убывает с возрастанием гидродинамического радиуса RH частиц в растворах F-актина при концентрациях от 1 до 12 мг/мл( Hou L et al, 1990). Вместе с тем D/D0 FF-частиц (fluorescein-Ficolls) в концентрированных растворах глобулярных белков в значительной степени не зависят от размеров частиц (Luby-Phelps et al, 1987), что предполагает отсутствие влияния белков «без посторонней помощи» на диффузию, несмотря на высокую их концентрацию в цитоплазме («20%) ( Hou L et al, 1978).
Актин и действие физических факторов
В растворе устанавливается равновесное состояние между G-актином и его активированной формой, что препятствует образованию димера или олигомера белка (Pardee, Spudich, 1982). Олигомеры, сформированные в результате обработки ультразвуком G- или F-актина, по завершении воздействия, в зависимости от концентрации калия в растворе, переходят в форму мономера или F-актина (Grazi et al., 1983). При этом ультразвук смещает равновесное состояние в сторону увеличения концентрации активированного мономера.
Характеристики G и F форм актина различаются по величине и равны: -0.75 см3/г и -0,65 см3/г для парциального удельного объема; 9,3х10 12 см7дин и (7-13)х1СГ смЗ/дин для сжимаемости, соответственно (Suzuki et al., 1996). Денситометрия и калориметрические измерения выявили уменьшение молярного объема на 720 мл/моль и снижение теплоемкости на 69,5 кДж/(К моль) при Mg2+ индуцированной полимеризации актина (Quirion, Gicquaud, 1993). Это соответствует результатам эксперимента, когда при высоких давлениях регистрировали уменьшение молярного объема (Suzuki et al, 1995). Однако получены данные, которые свидетельствуют и об увеличении молярного объема при полимеризации актина на 391 мл/моль (Ikkai, Ооі, 1966) и большей сжимаемостью F-актина, по сравнению с его мономером (Swezey, Somero, 1985). Эти результаты согласуются с гипотезой о конформационных флуктуациях белков (Ъшпгу and Gregory, 1989). Увеличение объема системы, которое сопровождает сборку F-актина, отражает эффект гидрофобных взаимодействий в стабилизации филамента и наличие жесткосвязывающих сайтов (Swezey RR, Somero GN, 1985).
Данные по влиянию рН на кинетику полимеризации, коэффициент диффузии и критическую концентрацию в зависимости от вида катиона и его концентрации приведены в таблицах 1.1-1.3 (Wang et al., 1989).
Показано, что значение упругого модуля сдвига 2 мг/мл F-актина составляет порядка нескольких сотен Па и строго зависит от длины филаментов или манипуляций с образцом при подготовке проб. Укорочение длины филаментов, вызванное гелсолином, и механические возмущения уменьшают величину значения модуля сдвига (Janmey et al, 1994). Молекулы F-актина в растворе способны образовывать между собой нестабильные связи. Интенсивность этих процессов определяется модулем сгибаемости или постоянной длинны (-10 мкм). Очищенный G-актин при физиологических концентрациях (-0.1 мМ) полимеризуется в филаменты длиной несколько микрометров (Janmey et al., 1994). Такой полимер ( 1мкм), содержит около 370 мономеров (Janmey, 1986). Для F-актина в присутствии агентов, стабилизирующих цепи белка, модуль упругости составляет несколько тысяч паскаль (Janmey et al., 1986; Janmey et al, 1988; Janmey et al., 1990; Janmey et al., 1991; Hvidt et al 1990). Длина филаментов актина в клетке достигает 100- 600 нм и содержит до 200 мономеров (Niederman et al., 1983). В данной работе указывается на то, что актин локализован на периферии цитоплазмы в концентрации 10 мг/мл (-0.3 мМ).
Наблюдается выраженное различие в величине коэффициента динамической вязкости для водного раствора и цитоплазмы, что отражает проявление ассоциативных и полимеризационных свойств актина или способности белка к гелеобразованию (Mastro A.M., 1984). Для сравнения в таблице 1.4 приведены характеристики G-актина и ряда водорастворимых веществ в воде и цитоплазме клетки. Таблица 1,4, Характеристики G-актина и других водорастворимых веществ для водного раствора и для цитоплазмы клетки (по: (Mastro A.M., 1984).
Высокая скорость диффузии G-актина и деполимеризации F-актина способны обеспечить доставку клеточного пула мономера на сайт мембраны, где формируются условия для полимеризации. В клетках эукариот, за счет локальной полимеризации актина, возможна деформация плазматической мембраны, как механизм не мышечной подвижности (Plastino et al., 2004). При этом в клетке происходит два процесса: быстрое перемещение мономер актина (G-форма) и медленная диффузия полимера актина (F-форма). Коэффициент диффузии форм актина отличается на 3-4 порядка .
По оценке эластично-упругой модели коэффициент диффузии G-актина для геля на порядок меньше, чем для водного раствора (Plastino et al., 2004). Еще более выраженные изменения этого параметра регистрируется в условиях цитоплазмы (табл. 1.4). В результате полимеризации образуются филаменты актина, которые формируют структуру подобную гелю, что обусловлено низкой скоростью диффузии F-актина. Реорганизация системы актиновых филаментов происходит в непосредственной близости от плазматической мембраны (Gerisch G. et al., 2004). Предполагается, что в начале F-актин собирается в глобулярные комплексы (кластеры), передвигающиеся по периферии клетки со скоростью до 10 мкм в минуту. Далее, актиновые кластеры деполимеризуются, порождая волну мономера белка, которая распространяется со скоростью до 26 мкм в минуту по направлению к мембране (Vicker, 2000).
Обсуждается роль локальной полимеризации актина в механизме немышечной подвижности через образование выпячивания на мембране -псевдоподий (Gerisch et al., 2004). Например, для Dictyostelium показано, что образование филаментов актина во времени предшествует деформации движущейся границы клетки. Другими словами, полимеризация начинается раньше, чем выпячивание мембраны.
Моделирование процесса переноса вещества в условиях влияния продуктов реакции на диффузионные свойства среды
Реакция калий обусловленной полимеризации актина может быть представлена в виде следующей схемы (рис. 2.2), приведенной в работе Pardee, Spudich (1982). K + G [KG] F K + G (2.2) Схема калий-обусловленной полимеризации F актина, где К, G, [KG] и F - концентрация калия, G-актина, G-актин-калиевого комплекса и F-актшіа, соответственно. Полученные экспериментальные данные формализуются для математической модели исходя из следующих допущений: 1) В начальный момент времени при t=To: (а) G-актин равномерно распределен в эмбрионе; (Ь) комплекс G-актина и калия равномерно распределен в цитоплазме зиготы и при его начальной концентрации не приводит к образованию ядер полимеризации; (с) F-актин сосредоточен на границе области. 2) В условиях инактивации калиевых каналов при T0 t Ti: (а) на границе эмбриона существует градиент калия, направленный внутрь зиготы; (Ь) скорость полимеризации в любой точке цитоплазмы зависит от концентрации комплекса G-актина и калия в данной точке области клетки (образование ядер полимеризации) и концентрации F-актина (в т.ч. увеличение длины филамента). 3) В условиях последующей активации калиевых каналов при Ti t T2: (а) на границе эмбриона существует градиент калия, направленный из зиготы; Анализ экспериментальных данных позволяет предположить, что образование ядер полимеризации под влиянием иона К+ происходит значительно медленнее процесса элонгации. Положим, что в точках с равной концентрацией F-актина диффузионные свойства среды схожи.
Зависимость диффузионного члена от концентрации F-актина отражает влияние полимерной формы белка на процесс диффузии. Для ооцита и зиготы мыши характерна низкая внутриклеточная концентрация калия (Powers, Tupper, 1977; Lee, 1987). Причиной этого может быть интенсивный пассивный транспорт иона К+ из эмбриональной клетки. Например, показано, что первый клеточный цикл мыши синхронизирован с работой калиевого канала (240 pS К+) на мембране эмбриональной клетки (Day et al., 1993;2001). Предполагается, что канал регулируется цитоплазматическим осциллятором, опосредовано взаимодействующим с ядерным циклом через циклинзависимую киназу- cdkl (Day et al., 1998). В качестве посредника между cdkl и 240 pS К"1 каналом рассматривается митогенактивируемая протеинкиназа, которая активна у ооцита на метафазе II мейоза и в митозе первого клеточного цикла. Ингибирование канала в начале S фазы и на S/G2 переходе, по-видимому, обусловлено активацией тирозинкиназы. 240 pS К+ канал относится к типу "макси", совмещая высокую ионную избирательность и высокую проводимость. Эффективность канала и длительность его активного состояния позволяют предположить, что в течение подготовки зиготы к первому делению дробления 240 pS К 1" канал индуцирует циклические изменения концентрации калия во всей клетке. Данная гипотеза вполне обоснована, если учесть, что быстрая компенсация потерь калия невозможна, так как заметная активность Na/K-АТФазы проявляется только на стадии бластоцисты (Watson, Kidder, 1988).
Действительно, анализ литературных данных показывает, что концентрации калия в зиготе мыши на Gi/S фазе увеличивается почти в 2,5 раза относительно ооцита и затем, уменьшается более чем в три раза на профазе митоза (Гольдштейн и др., 2004а; 20046; 2005; Погорелов и др., 2004а; 20046; 2005а; 20056; 2005в). В таблице 3.1 суммированы результаты электронно-зондового микроанализа цитоплазматической концентрации калия в одноклеточном эмбрионе мыши.
Из сравнения данных видно, что уже в начале Gt фазы концентрация калия в зиготе не значительно, но отличается от таковой в ооците (табл. З.1.). В течение первого клеточного цикла цитоплазматическая концентрация калия претерпевает драматические изменения. При блокировании 240 pS К+ канала на Gi/S переходе содержание элемента меняется от 66 мМ (начало G\ фазы) до 148 мМ (S фаза). Этот факт свидетельствует о высокой активности Na/K-АТФазы в этот период развития зиготы, достаточной чтобы поддерживать концентрацию калия в эмбриональной клетке на уровне —150 мМ. Указанная величина значительно выше цитоплазматической концентрации калия, регистрируемой в дифференцированной клетке ткани.
Следует отметить низкий уровень внутриклеточного калия в начале Gj фазы зиготы (табл. З.1.). Близкая по величине концентрация калия также наблюдается при переходе из G2 фазы в профазу митоза (-44 мМ). Для обеих ситуаций характерным является начало деконденсации ДНК сперматозоида или ядра зиготы, соответственно. То, в какой степени уменьшение цитоплазматического калия представляет собой необходимый атрибут подготовки ДНК к репликации, требует дополнительных исследований. Однако известно, что присутствие катиона К+ в физиологических концентрациях стабилизирует молекулу ДНК, предотвращая ее деградацию и рекомбинацию (Parkinson et al., 2002).
Расчет коэффициента диффузии калия в зиготе мыши
Принято считать, что скорость движения иона К в цитоплазме соизмерима с его скоростью в водном растворе с коэффициентом диффузии - 2 10" м/с. При размерах зиготы 60 мкм это означает отсутствие заметного градиента концентрации калия между периферией и центральной областью клетки, так как концентрационное различие между зонами цитоплазмы нивелируется за доли секунды. Если принять данное положение, то в течение первого клеточного цикла, который длится почти сутки, следует ожидать плавного изменения уровня внутриклеточного калия с гомогенным распределением элемента по цитоплазме. Однако предположение об однородном распределении калия в цитоплазме зиготы достаточно гипотетично, так как известно, что калий депонируется клеточными структурами (Burovina et al., І 987; Sobota et al., 1984; Burovina et al., 1985). Существующие данные также не подтверждают однородности в распределении калия в одноклеточном эмбрионе мыши (табл.3.2). Следует отметить, что гетерогенное распределение калия в цитоплазме обнаруживалось и ранее, например, для миоцита (Нестеров, 1964).
Из таблицы видно (табл. 3.2.), что на Gi/S и G2/M переходе наблюдается значимое различие между периферической цитоплазмой эмбриона и его центральной частью. Эти данные свидетельствуют о том, что параметры диффузии иона К+ в условиях зиготы, не соответствуют таковым для буфера. При расчете коэффициента диффузии калия в зиготе с учетом сферической формы клетки, возможно использование трехмерной модель диффузии в однородном шаре (Араманович, Левин, 1964; Тихонов и Самарский, 1972). Аналитическое решение уравнения диффузии в данном случае можно свести к решению задачи о диффузии в стержне конечной длины. Численные методы позволяют существенно расширить класс рассматриваемых задач. Задача о диффузии калия в зиготе решалась с использованием пакета программ Tool Box Partial Equation среды MatLab методом конечных элементов.
Анализ пространственно временных особенностей распределения цитоплазматического калия в зиготе (табл. 3.2.) позволил сформулировать граничные и начальные условия для расчета коэффициента диффузии. В начальный момент времени калий в цитоплазме распределен равномерно с концентрацией как у ооцита на метафазе II мейоза. В примембранной области, за исключением двух противолежащих сегментов, поддерживается высокий уровень элемента, соответствующий его содержанию в периферической области на Gj/S фазе. На указанном интервале первого клеточного цикла 240 pS К+ канал инактивирован и, в результате, формируется поток калия, направленный от мембраны зиготы к ее центру. По завершении S фазы концентрация в центральной части зиготы увеличивается до 120ч-150 мМ. По нашей оценке коэффициент диффузии для калия в цитоплазме зиготы оказался на 4-5 порядков меньше величины, которая приводится для иона К+ в буфере ( 2 10 9 м2/с). Таким образом, скорость распространения калия в эмбрионе во много раз медленнее, чем в воде. Чем может быть обусловлено данное явление? Около 30% калия в клетке может находиться в связанном виде, что предполагает наличие систем аккумуляции этого элемента (Hempling, 1958). Одним из таких механизмов является полимеризация актина, индуцированная увеличением концентрации иона К+ (Kawamura, Maruyama, 1970; Pardee, Spudich, 1982; Shu et al., 2002).
Модель калий обусловленной полимеризации актина в цитоплазме зиготы мыши (полимеризация актина - механизм диффузии связанного калия в зиготе) Для объяснения феномена торможения диффузии калия в зиготе мыши предложена модель калий-обусловленной полимеризации актина. Предпосылкой создания такой модели явилась система экспериментальных данных, описывающих физико-химические особенности полимеризации актина и роль этого белка в формировании морфофункциональных свойств клетки. G-актин, большей частью, локализован в кортикальной цитоплазме и претерпевает обратимые изменения, характерные для водных растворов полимеров (Janraey et al., 1986). Раствор актиновых филаментов обладает существенно отличными от буфера вязкоупругими свойствами (Kasai et al., 1960). Ряд бактерий для перемещения по цитоплазме используют актин клетки-хозяина (Kocks et al., 1992; Theoriot at al., 1994; Dramsi, Cossart, 1998). Этот факт свидетельствует о том, что количества G-актина, которое содержится в клетке вполне достаточно, чтобы шобое изменение локальной концентрации катиона или рН среды запустило полимеризационные процессы. В физиологических условиях фактором, отражающим скорость и полноту полимеризации белка, является ион К 1" (Martonosi et al., 1964). При переходе в F форму актин связывает катион, после чего этот пул калия диффундирует в составе молекулы полимера.
Последовательность событий, реализующихся при полимеризации актина (по: Pardee, Spudich, 1982). В результате полимеризации образуются сформированные актиновыми филаментами структуры подобные гелю. Они могут обладать различными вязкоупругими свойствами, которые зависят как от типа взаимодействия между нитями F-актина, так и от их пространственного расположения (Jen et al, 1982). Очень медленную диффузию актиновых филаментов в растворе F-актина, наряду с высокой концентрацией иона К" ", можно рассматривать в качестве причины стабильности актинового геля (Zaner, Stossel, 1982; 1983). В последнем случае взаимодействием между молекулами белка, как правило, пренебрегают (Doi, Frieden, 1984).
Таким образом, основным положением предложенной модели калий обусловленной полимеризации актина в зиготе является вывод о том, что ион К+ инициирует создание гелеподобных актиновых структур. Стабильность этих компартментов обусловлена низкой скоростью диффузии F-актина, полимерная форма которого поддерживается локально высокой концентрацией калия. Следует отметить, что величина коэффициента диффузии, рассчитанного для калия в условиях зиготы, близка по значению к коэффициенту, характеризующему диффузию F-актина в водном растворе (Wang et al., 1989). Данное совпадение поддерживает нашу гипотезу, формализованную в виде модели калий обусловленной полимеризации актина в зиготе.
