Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ПРИНЦИПЫ ПОСТРОЕНИЯ АВТОМАТИЗИРОВАННОГО КОМПЛЕКСА ДЛЯ АНАЛИЗА МИКРОИЗОБРАЖЕНИЙ 15
1.1. Состав комплекса 17
1.2. Структура комплекса 31
1.3. Реализация комплекса 40
Выводы по главе I 53
ГЛАВА II. МЕТРОЛОГИЧЕСКИЕ ХАРАКТЕРИСТИКИ УСТРОЙСТВА ВВОДА ИЗОБРАЖЕНИЙ 55
2.1. Анализ шумов фотометрического канала 55
2.2. Способы реализации фотометрического канала 73
2.3. Исследование разрешающей способности сканирующего устройства 83
Выводы по главе II 95
ГЛАВА III. МАТЕМАТИЧЕСКОЕ ОБЕСПЕЧЕНИЕ КОМПЛЕКСА . 96
3.1. Пакет программ морфологического анализа изображений 97
3.2. Комплекс программ статистического анализа клеточных популяций 114
3.3. Алгоритмы выделения односвязных областей 126
Выводы по главе III 137
ГЛАВА ІV. ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ 139
4.1. Восстановление слабоконтрастных электронно-микроскопических изображений 140
4.2. Анализ возрастной динамики эритроцитарных популяций 154
Выводы по главе ІУ 177
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 179
ЛИТЕРАТУРА 182
ПРИЛОЖЕНИЯ 191
- Состав комплекса
- Анализ шумов фотометрического канала
- Пакет программ морфологического анализа изображений
- Восстановление слабоконтрастных электронно-микроскопических изображений
Введение к работе
Одной из устойчивых тенденций в научных исследованиях является интенсивное привлечение вычислительной техники к управлению экспериментом и анализу его результатов. Это стало возможным благодаря нескольким факторам : интенсивному развитию вычислительной техники и появлению управляющих мини- и микро-ЭВМ, не уступающих по мощности большим вычислительным системам предшествующих поколений; распространению идеологии унифицированных узлов измерительной и управляющей аппаратуры, позволяющих создавать экспериментальные комплексы, сравнительно легко адаптируемые к конкретным условиям эксперимента (примером реализации такой идеологии может служить применение широко известного в настоящее время стандарта КАМАК); быстрому совершенствованию технологии изготовления интегральных электронных приборов, особенно больших интегральных схем; освоению дешевых и компактных микропроцессорных средств, существенно повышающих "интеллектуальный" уровень приборного оборудования. Основной же причиной, повлекшей применение в научных исследованиях вычислительной техники, явилась способность вычислительной машины наряду с выполнением громоздких вычислений эффективно управлять ходом эксперимента или процессом анализа полученных результатов.
Среди систем автоматизации научных исследований особое место занимают системы, предназначенные для анализа данных, представленных в виде изображений. Такие данные поставляют исследователю самые различные области науки и техники : астрономия и астрофизика - снимки звездного неба, физика элементар- ных частиц - фотографии треков, полученные в искровых и пузырьковых камерах, биология - микроперпараты клеточных популяций, ч материаловедение - шлифы различных композиционных материалов и т.д. В последние годы в связи с развитием космических исследований огромное количество изображений поступает с космических летательных аппаратов. В одних случаях изображения оказываются естественной формой представления исходных данных, в других -способом регистрации результатов эксперимента. Преимущества изображений перед другими способами регистрации заключаются в их высокой информационной емкости и наглядности, обеспечивающей исследователю удобство интерпретации. Однако качественный визуальный анализ изображения исследуемого объекта или явления не может обеспечить объективной интерпретации.
Повышению объективности анализа изображения способствуют количественные методы. В простейших случаях они сводятся к прямым измерениям оптических или геометрических характеристик некоторых фрагментов изображения. Так делается, например, при определении координат треков элементарных частиц или координат и яркостей небесных объектов. Более сложные случаи требуют предварительного выполнения ряда преобразований изображения или вычисления статистик от первичных геометрических и оптических параметров. Например, функциональное состояние некоторых клеток отражается на текстурных параметрах их ядер, которые вычисляются через значения оптической плотности в различных участках ядра и могут быть использованы как объективные диагностические признаки. Описание изображения в количественных терминах позволяет применять при его интерпретации строгие математические методы. - б -
Для выполнения координатных измерений и фотометрирова-ния изображений вручную существует ряд обладающих потенциально высокими метрологическими характеристиками приборов (коор-динатометры, просмотровые столы, микроденситометры), однако такие факторы как утомляемость оператора и присущие ему субъективные ошибки не позволяют полностью реализовать эти характеристики. Трудоемкость ручных измерений обуславливает их невысокую производительность. Более того, при ручных измерениях практически исключена возможность получения параметров, требующих выполнения предварительных преобразований изображения или сложных вычислений.
Для частичного или полного устранения этих недостатков и более интенсивного внедрения количественных методов в практику интерпретации изображений создаются автоматизированные системы, которые, помимо измерительных функций, в зависимости от назначения и степени сложности, могут выполнять и функции последующего анализа изображений. Применение автоматизированных систем позволяет : а) повысить скорость измерений и увеличить объем обрабатывае мых данных для получения качественно новых результатов ис следований; б) повысить точность и устранить субъективные ошибки измере ний, свойственные ручным методам; в) использовать специальные методы преобразования изображений с целью выделения недоступной визуальному наблюдению инфор мации; г) выполнять законченный цикл обработки до получения конечного результата анализа изображения.
Одна из областей применения автоматизированной обработки изображений - анализ микроизображений, характерные структуры которых имеют минимальные размеры, сравнимые с длиной волны видимого света. Обычно они наблюдаются с помощью светового микроскопа. Максимальные размеры микроструктур не имеют строгого ограничения, но, как правило, они не превышают нескольких десятых долей миллиметра. Чаще всего такими изображениями являются специальным образом приготовленные препараты реальных объектов, реже - фотографии.
Класс объектов, с которыми имеет дело оптическая микроскопия, весьма широк. Несомненно, одно из первых мест занимают объекты биологические - различные микроорганизмы, клетки, как отдельные, так и их популяции, отдельные органоиды клеток и пр. В геологии, металлургии, строительной промышленности, материаловедении по микрошлифам и микросрезам изучается структура природных и искусственных материалов. В микроэлектронике под микроскопом наблюдают шлифы интегральных схем с целью выявления дефектов и причин их возникновения. В обрабатывающей промышленности, при производстве композиционных материалов микроскопическим исследованиям подвергаются порошковые материалы. В медицине микроскопический анализ клеток крови используется для определения функционального состояния организма в целом и в диагностике болезней крови, а исследование структуры тканей применяется при диагностике патологий различных органов, в особенности при опухолях.
В соответствии с данным определением микроизображений к ним можно отнести и фотографии, выполненные на фотоматериале с высокой разрешающей способностью. Так, электронно-микроскопи- ческие снимки кристаллических структур, изучаемых кристаллографией, содержат объекты размерами от сотен микрометров до 1-2 миллиметров, а разрешаемые фотоматериалом детали структур могут иметь размеры в несколько микрометров.
Автоматизация количественного анализа микроизображений начиналась в конце 50-х - начале 60-х годов созданием ряда устройств для исследования клеточных множеств /I, 2/. Основанием этому послужили работы Касперссона /3/, показавшие возможность количественного оценивания фотометрическими методами содержания определенных веществ в отдельных клетках, что открывало перспективное направление в количественной цитохимии, позволяя исследовать негомогенные популяции клеток и обнаруживать в них подмножества, обладающие разными свойствами. Однако такой подход для обеспечения статистической представительности наблюдений требовал анализа больших объемов исходного материала, что было недостижимо при ручных измерениях. К тому же было известно, что некоторые функциональные особенности клеток, связанные с содержанием того или иного вещества, проявляются в легко поддающихся измерениям характеристиках, таких как размеры клеток или ядер, их средняя или интегральная оптическая плотность. Все это обещало успех в решении проблем не только научных, но и прикладных, таких как клинический анализ крови или диагностика опухолевых заболеваний, что и повлекло разработку соответствующей аппаратуры. Первые анализаторы позволили выполнить ряд оригинальных исследований /4, 5/, однако широкого применения не нашли в силу своей функциональной ограниченности, обусловленной сравнительно низким уровнем элементной базы и отсутствием методов формального описания сложных характеристик изо- бражения. В частности, сейчас уже представляется очевидным, что для клинической диагностики важно не только точное определение содержания различных веществ (ДНК, РНК) в клетке, но и характер их распределения, выражающийся в форме и текстуре клеточных органоидов, т.е. в параметрах, которые по сей день не имеют однозначной количественной трактовки»
Развитие телевизионной техники и электроники, а также привлечение математических методов (теории вероятностей, интегральной геометрии) для количественного описания сложных пространственных структур (минералов, живых тканей, пористых материалов) повлекли создание телевизионных анализаторов, оснащенных набором специализированных блоков обработки видеосигнала, которые обеспечивали определенную гибкость в выборе измеряемых параметров и режимов работы. Одним из первых серийно освоенных телевизионных анализаторов был Quantimet-720 фирмы Італсо (Великобритания) /6/.
Параллельно создавались системы, в которых центральную роль при управлении процессом измерений и при обработке результатов играла универсальная ЭВМ /7-Ю/. В них для ввода изображений использовались либо электромеханические сканирующие устройства /7/, либо телевизионные передающие камеры /8/, либо сканирующие устройства на проекционных электронно-лучевых трубках /9,10/. Несомненным достоинством таких систем являлась их гибкость по отношению к алгоритмам анализа изображений. Набор измеряемых параметров, алгоритмы их получения и обработки могли быть запрограммированы в полном соответствии с требованиями задачи.
Подавляющее большинство современных систем анализа изобра- жений так или иначе опираются на ЭВМ, причем по-прежнему сохраняются два основных направления : а) системы, работающие с телевизионным видеосигналом, состоящие из ряда взаимосвязанных специализированных модулей, на кото рые возлагается первичная обработка изображений и вычисление параметров, которые передаются затем в ЭВМ для дальнейшего анализа /11-13/; б) системы, в которых все функции управления, вычислений и ана лиза выполняются ЭВМ /14-16/.
Первые обладают высокой производительностью, полный цикл первичной обработки выполняют, как правило, за время одного телевизионного кадра, наиболее развитые из них имеют логически перестраиваемую под управлением ЭВМ структуру /II/, но в силу ап-паратно заложенной ограниченности набора первичных параметров их функциональные возможности могут расширяться только наращиванием объема оборудования. Экономное использование аппаратных средств и высокая функциональная гибкость вторых достигается за счет снижения производительности. Следует отметить, что системы первого типа, как правило, предназначены для выполнения рутинных лабораторных исследований и выпускаются серийно /12,13/, напротив, системы второго типа обычно создаются исследователями для решения уникальных задач и существуют обычно в единственном экземпляре /14-16/.
В то же время существует потребность в системах, сочетающих на всех этапах анализа изображений высокую производительность специализированных средств обработки с функциональной гибкостью универсальных ЭВМ. Эта потребность определяется следующими факторами : - II -
Эффективность использования в научных исследованиях системы для рутинного анализа изображений зависит от того, насколько широкий спектр различных задач она способна перекрыть, обеспечивая своими ресурсами многих пользователей. В связи с этим в наиболее развитых серийных зарубежных системах предлагается широкая номенклатура специализированных модулей, обеспечивающих выполнение различных преобразований и вычисление различных параметров. Такой путь приводит к аппаратурной избыточности системы и, как следствие, низкому коэффициенту использования входящего в её состав специализированного оборудования.
Развитие методов количественного анализа изображений состоит, с одной стороны, в создании новых алгоритмов получения и обработки информации и новых способов количественного описания изображений, адекватных целям исследований, что затруднительно, а подчас и невозможно выполнить, пользуясь ограниченным заранее набором функций, а с другой - в их практической проверке за обозримое время на реальном статистически представительном материале, что требует высокой производительности всех компонентов системы.
Приступая к работе с новым объектом или явлением, исследователь не всегда априори может указать, каким образом его характерные особенности проявляются в параметрах изображения (типичным примером является отражение функциональной патологии клеток в их морфологии), и вынужден опытным путем искать оптимальные варианты параметров и способы их получения. Очевидно, что и в этом случае высокопроизводительная функционально гибкая система является наиболее удобным инструментом решения за- дачи.
Актуальность создания высокопроизводительных функционально гибких систем для анализа микроизображений обусловлена необходимостью повышения объективности результатов широкого круга , научных и производственных исследований и подтверждается заданиями 06.10 и 01.34 целевой научно-технической программы 0.Ц.027 "Создание и развитие автоматизированных систем научных исследований (АСНИ) и систем автоматизации проектирования (САПР) с применением стандартной аппаратуры КАМАК и измерительно вычислительных комплексов", утвержденной Постановлением Государственного комитета СССР по науке и технике, Государственного планового комитета СССР и Президиума Академии наук СССР № 474/250/172 от 12 декабря 1980 года, в соответствии с которыми проводилась данная работа.
Цель данной работы состоит в создании многоцелевого автоматизированного комплекса, представляющего собой инструмент : а) решения методических задач, разработки новых средств, способов и алгоритмов обработки изображений; б) высокопроизводительного количественного анализа микроизображений, вариабельных по своему содержанию, целям и задачам исследований.
В соответствии с поставленной целью основными задачами работы являются : выбор состава и структуры комплекса, обеспечивающих высокую производительность, функциональную полноту и гибкость и возможность развития; создание экспериментального образца комплекса; теоретический анализ и разработка фотометрического канала, экспериментальное исследование фотометрического и оптиче- - ІЗ - ского каналов сканирующего микроденситометра, являющегося основным устройством ввода изображений, как одного из важнейших компонентов комплекса, влияющего на его производительность, определяющего точность и достоверность результатов анализа; создание прикладного программного обеспечения, ориентированного на статистический анализ микроизображений и на разработку алгоритмов анализа, опирающихся на методы математической морфологии; разработка и теоретический анализ способа восстановления слабоконтрастных изображений; создание методики измерений для проведения исследований клеточных популяций, представленных в виде мазков.
Научная новизна : обоснована структура многоцелевого автоматизированного комплекса для анализа микроизображений, обеспечивающая его полноту, функциональную гибкость, способность к аппаратному и алгоритмическому развитию; в результате теоретических и экспериментальных исследований ошибок фотометрирования предложен способ фотометрирова-ния, обеспечивающий постоянную величину падающего на образец светового потока, вследствие чего полностью исключается влияние нестабильности источника света; предложена процедура оценивания функции рассеяния точки (ФРТ) оптического канала устройства ввода по реакции на резкий скачок коэффициента пропускания, позволяющая корректировать фильтрующее влияние оптики на результаты измерений и оценивать разрешающую способность устройства ввода; определены статистические свойства метода подавления шумов на слабоконтрастных изображениях, основанного на совмеще- ний и накоплении изображений одинаковых объектов, что позволяет выбирать оптимальный режим накопления и оценивать ошибки восстановления изображений; - предложена методика исследований эритроцитарных популя ций, основанная на их описании распределениями параметров от дельных клеток и статистическом анализе этих распределений.
На защиту выносятся : состав и структура многоцелевого автоматизированного комплекса для анализа микроизображений; способ фотометрирования и структура фотометрического канала сканирующего микроденситометра, обеспечивающие стабильность результатов измерений при сильных флуктуациях источника света; результаты экспериментального исследования метрологических характеристик фотометрического и оптического канала разработанного сканирующего микроденситометра; методика исследования клеточных множеств, основанная на статистическом анализе распределений параметров отдельных клеток; результаты использования комплекса в задачах восстановления электронно-микроскопических изображений и изучения возрастной динамики эритроцитарных популяций.
Состав комплекса
Любая автоматизированная система обработки изображений включает в себя четыре основных компонента : устройство.ввода изображений, устройство обработки, устройство вывода и устройство управления. Уровень организации и технические возможности каждого из них определяются его ролью в решении задач, на которые ориентирована система.
Устройства ввода изображений. В специализированных системах с целью повышения общей производительности и сокращения объема обрабатываемых данных на устройства ввода часто возлагают задачу предварительной сортировки, с тем чтобы вводить только параметры изображения, специфические для данной задачи. Так в известных системах для анализа снимков с искровых и пузырьковых камер /27/, устройства ввода давали в ЭВМ только координаты треков (или объектов, похожих на треки), существенным образом сжимая объем анализируемой информации. Однако такая предобработка допустима только при жестких ограничениях, накладываемых на цели обработки и содержание обрабатываемых изображений.
Другой способ ввода, реализованный в большинстве телевизионных анализаторов изображения, предназначенных для массовых лабораторных исследований, состоит в передаче аналогового видеосигнала в специализированные модули для его предобработки и формирования первичных параметров /11,12/.
Однако наиболее распространенными являются устройства, осуществляющие адекватное преобразование исходного изображения, представленного в виде непрерывного двумерного поля, в цифровой код посредством пространственной дискретизации и присвоения каждому элементу дискретного поля числового значения, определяемого его отражающей способностью, оптической плотностью или коэффициентом пропускания (возможно в определенном спектральном диапазоне) /7-Ю, 14-16,29,30/, Для таких устройств основными характеристиками являются кодируемая величина (оптическая плотность, коэффициент отражения, яркость и т.д.) и её динамический диапазон, координатная и фотометрическая точность, максимальная производительность, размеры рабочего поля, разрешающая способность.
Для задач анализа микроизображений высокая разрешающая способность является важнейшим параметром устройства ввода. Подавляющее большинство изображений представляется в виде полупрозрачных образцов Смазки, микросрезы, микрофотографии), в которых информацию об их структуре несет оптическая плотность (коэффициент пропускания), причем обыкновенно оптическая плотность прямо связана с концентрацией некоторых веществ в образце и его толщиной. В частности, количество того или иного вещества и характер его распределения в клетках является одним из факторов, зависящих от их функционального состояния. Следовательно, высокая точность фотометрирования столь же важна для анализа микроизображений.
Анализ шумов фотометрического канала
В работе /48/ даны оценки потенциально достижимой при заданной производительности точности измерения коэффициента пропускания, которую может обеспечить сканер на ЭЛТ высокого разрешения. С целью выявления основных источников ошибок измерения и возможных способов их уменьшения ниже подробно рассматривается влияние основных элементов фотометрического канала -источника света и фотоприемника - на результаты измерения.
По оценкам, полученным в /48/, интенсивность светового потока, попадающего на фотоприемник микроденситометра, составля-ет примерно 10 фотонов/с. Получить при такой интенсивности выходной сигнал, достаточный для квантования, можно только после большого усиления, поэтому в качестве фотоприемника целесообразно использовать ФЭУ, который при коэффициенте усиления 10 10 в полосе частот до десятков мегагерц обладает сравнительно малыми собственными шумами.
Рассмотрим устройство фотометрирования (рис. 2.I.I), состоящее из источника света I, исследуемого образца 2, фотоэлектронного умножителя 3 и интегратора 4, накапливающего выходной заряд ФЭУ в течение времени измерения. Предположим, что источник излучает поток фотонов с интенсивностью / , образец имеет коэффициент пропускания V , а квантовая эффективность фотокатода равна А . Электронный умножитель содержит к. одинаковых каскадов с средним усилением At- и дисперсией усиления
V . Фотокатод за время измерения t испускает случайное число электронов У1 , подчиняющееся распределению p(ftj t} К А, /.
Если время измерения велико по сравнению с временем пролета вторичных электронов через динодную систему ФЭУ, можно считать, что электрон, испускаемый фотокатодом, мгновенно порождает / выходных электронов, где I - случайная величина с распределением.
Пакет программ морфологического анализа изображений
Описание и классификация отдельных объектов, их популяций или образованных ими пространственных структур с помощью количественных признаков, характеризующих форму, размеры и взаимное расположение объектов, являются типичными задачами анализа микроизображений. Формальной основой для их постановки и решения может служить аппарат математической морфологии /41/.
Количественное описание изображения, которое в рамках математической морфологии рассматривается как случайное множество в двумерном векторном пространстве, базируется на его преобразовании с помощью структурных элементов. Структурным элементом называется множество & ( В J состоящее из пары непересекающихся подмножеств о и о . Структурный элемент, начало которого помещено в точку X. пространства, обозначим через ох. Наиболее общая операция математической морфологии -сравнение (в первоисточнике Hit or Miss) определяется следующим образом.
class4 ПРИМЕНЕНИЕ КОМПЛЕКСА В МЕДИКО-БИОЛОГИЧЕСКИХ
ИССЛЕДОВАНИЯХ class4
Восстановление слабоконтрастных электронно-микроскопических изображений
Электронные микрофотографии биологических объектов, полученные при слабых электронных дозах в присутствие контрастирующего вещества, обладают сильньми шумами, скрывающими истинную структуру изучаемых объектов, в связи с чем невозможна непосредственная интерпретация этих фотографий. Восстановление структуры может быть достигнуто при накоплении большого количества изображений одинаковых объектов, что оказывается возможным благодаря наличию на фотографии множества таких изображений. Одним из способов накопления является цифровой способ, когда изображение дискретизуется по координатам и оптической плотности и подвергается обработке на цифровой вычислительной машине. В силу того, что фрагменты микрофотографии, содержащие изображения одинаковых объектов, расположены случайным образом, их точное совмещение, необходимое для осуществления накопления, является наиболее сложным этапом восстановления. Совмещение может быть выполнено с помощью метода максимального правдоподобия, который при весьма слабых ограничениях обеспечивает оценки с минимальной дисперсией /68/.
Выберем одно из имеющихся изображений в качестве опорного и представим его в дискретизованном виде
Здесь - элемент истинного восстанавливаемого изображения объекта, a f// - шум регистрации. Предположим, что имеется N изображений, которые необходимо совместить с опорным. Представим их в виде
При таком способе представления S -е изображение предполагается смещенным относительно опорного на $і » 5 шагов вдоль направлений дискретизации. Параметры к$ и s неизвестны и должны быть определены в процессе совмещения.
