Введение к работе
Актуальность работы. Онкологические заболевания занимают второе место в мире по смертности после сердечно-сосудистых патологий. Недостаточная эффективность лечения онкологических заболеваний обусловлена в первую очередь отсутствием избирательного действия существующих противоопухолевых препаратов, недостаточно эффективным проникновением противоопухолевых субстанций в опухолевую ткань и возникновением, при определенных условиях, резистентности опухолевых клеток к повреждающим воздействиям.
Возникновение резистентности опухолевых клеток к действию химиотерапевтических препаратов связывают, в основном, с внутриклеточными механизмами активации и/или повышенной экспрессии белков-транспортеров суперсемейства ABC (Р-гликопротеина (Pgp), MRP1-MRP-5, BCRP и LPR), осуществляющих выведение ксенобиотиков различного происхождения из клетки (Gottesman et al., 2002). С другой стороны, известно повышение резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в двумерных (конфлюентные монослойные культуры распластанных клеток) и трехмерных (сфероиды) многоклеточных образованиях в условиях in vitro, отражающее резистентность клеток в опухолевой паренхиме к действию химиотерапевтических препаратов (Chitcholtan et al., 2012), окислительного стресса (Акатов и др., 2000), гипертермии (Khoei et al., 2004), радиации (Zou et al., 2010). Это говорит об общности механизмов повышения резистентности опухолевых клеток к различным повреждающим воздействиям в плотных многоклеточных образованиях. Механизм такой резистентности до сих пор остается не выясненным.
В настоящее время одним из наиболее перспективных подходов противоопухолевой терапии является потенциальное применение рекомбинантных белков, созданных на основе цитокина TRAIL (TNF alpha Related Apoptosis Inducing Ligand). Цитокин TRAIL является интегральным мембранным белком, относящимся к семейству фактора некроза опухолей, который обнаруживается у NK-клеток, а также части дендритных клеток (Ashkenazi et al., 2008). Уникальной особенностью цитокина TRAIL является его способность избирательно индуцировать апоптоз в опухолевых клетках, связываясь со специфическими рецепторами клеточной гибели (DR4, DR5) на внешней поверхности цитоплазматической мембраны, и при этом не повреждать нормальные клетки организма (Gonzalvez et al., 2010). В то же время известно, что не все опухолевые клетки чувствительны к TRAIL-индуцированному апоптозу. В литературе указывается, что около 50% исследованных линий опухолевых клеток обладают конститутивной резистентностью к действию цитокина TRAIL, подобно нормальным клеткам. Это связывают как с изменением структуры рецепторов DR4, DR5 или с повышенной экспрессией рецепторов ловушек (DcRl и DcR2), так и с конститутивной активностью внутриклеточных сигнальных путей ответственных за выживание клеток (Johnstone et а!., 2008). Однако, до сих пор, остается неизвестным, способны ли чувствительные к действию TRAIL опухолевые клетки приобретать
резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от условий околоклеточного микроокружения, в частности, в плотных многоклеточных структурах, таких как конфлюентные культуры. Ответ на этот вопрос имеет большое теоретической значение для биологии клетки, а также принципиально важен для создания на основе рекомбинантных белков TRAIL эффективных препаратов для противоопухолевой терапии.
Целью работы является изучение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
-
Изучение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от плотности клеточных культур;
-
Исследование резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от пролиферативной активности клеток;
-
Изучение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в зависимости от адгезии клеток и параметров околоклеточной среды;
-
Выяснение механизма резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу и оценка возможности ее подавления.
Новизна работы. В работе впервые показано, что в условиях конфлюентной культуры опухолевые клетки способны приобретать резистентность к TRAIL-индуцированному апоптозу. Формирование приобретенной TRAIL-резистентности показано не только для конфлюентных культур зависимых от прикрепления опухолевых клеток эпителиального и мезенхимального происхождения, но и для независимых от прикрепления (суспензионных) клеток лейкоцитарного происхождения в многоклеточных агрегатах. Обнаружено, что повышение резистентности опухолевых клеток к TRAIL-индуцированному апоптозу в конфлюентных культурах осуществляется на фоне снижения пролиферативной активности клеток, однако значительная часть резистентных клеток может оставаться в клеточном цикле.
Установлено, что механизмы конфлюентной резистентности опухолевых клеток различного происхождения могут отличаться. Конфлюентная TRAIL-резистентность опухолевых клеток может осуществляться с привлечением тирозин-киназных рецепторов некоторых ростовых факторов (IGF и EGF, но не PDGF) и реализоваться через внутриклеточные сигнальные пути, связанные с протеинкиназами PI3K, Akt (РКВ).
Установлена возможность подавления конфлюентной TRAIL-резистентности путем нетоксичного воздействия на внутриклеточные молекулярные мишени.
Практическая значимость. Показана возможность подавления резистентности опухолевых клеток к TRAIL- индуцированному апоптозу в плотных многоклеточных структурах при использовании в нетоксичных концентрациях таргетных противоопухолевых препаратов, действующих на мишени внутриклеточных сигнальных путей. Это представляет интерес для разработки на основе рекомбинантных белков TRAIL и таргетных
ингибиторов приобретенной TRAIL-резистентности новых
противоопухолевых препаратов, вызывающих гибель опухолевых клеток, подавляющих их резистентность и при этом нетоксичных для клеток здоровых тканей и организма в целом.
Апробация. Основные результаты диссертационной работы были представлены на Международной Путинской школе-конференции молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пушино, 2011), IV Всероссийском с международным участием конгрессе студентов и аспирантов-биологов, «Симбиоз» (Воронеж, 2011), Международном молодежном научном форуме «ЛОМОНОСОВ» (Москва, 2011, 2012), Конференции Экспериментальная и теоретическая биофизика '10, 11, 12 (Пушино, 2010, 2011, 2012), Международном междисциплинарном конгрессе «Нейронауки для медицины и психологии» (Судак, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 15 печатных работ, в том числе 6 статей в журналах рекомендованных ВАК РФ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из ведения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на //г страницах, содержит ЗЛ- рисунков и / таблиц. Список цитируемой литературы включает ЛИ источников.
