Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Исследование биотканей методами оптической томографии (литературный обзор) : 5
1.1 Предпосылки создания оптической томографии 2:5
1.2 Актуальность разработки неинвазивных методов оптической 26 диагностики
1.3 Исследование биотканей методом ОКТ и его модификаций 28 КП ОКТ и ОКМ
1. 4 Развитие оптической диффузионной томографии 3 8
1.5 Развитие кросс-поляризационной оптической спектроскопии 4-1
1.6 Использования наночастиц для контрастирования изображений 4-2 оптической томографиии
1.7 Краткое описание теоретическое исследование 4-5 рассеяния и распостранения оптического излучения биотканью
1.8 Заключение 47
ГЛАВА 2. Интерпретация окт изображений мягких тканей для диагностики неопластических процессов и окт наблюдение границ злокачественной опухоли гортани
2.1 ОКТ и ОКМ изображения мягких биотканей 53
2.2 Методика проведения органосохраняющих операций 60 под контролем ОКТ
2.2.1 Материалы и методы 62
2.2.2 Определение неопластических изменений 63
2.2.3 Методика маркирования границ опухоли 63
2.2.4 Методика лазерной эксцизии 63
2.3 Заключение 36
ГЛАВА 3. Развитие методов кросс-поляризационной томографии и кросс-поляризационной отражательной спектроскопии для диагностики злокачественных образований
3.1 Исследование биотканей животных и человека методом кросс-поляризационной ОКТ
3.2 Развитие метода КП ОКТ для диагностики злокачественных образований
3.2.1 Материалы и методы 73
3.2.2 Результаты экспериментального исследования 73
3.3 Развитие метода КПОС для мониторинга границы 74
злокачественных образований
3.3.1 Материалы и методы 78
3.3.2 Результаты экспериментального исследования Схема прибора 81
3.3.3 Результаты экспериментов с модельными средами и биотканями 82
3.3.3.1 Эксперимент на модельной среде 86
3.3.3.2 Эксперимент на ex vivo образцах 87
3.3.3.3 Эксперимент in vivo 90
3.4 Заключение 91
ГЛАВА 4. Управление оптическими свойствами биоткани компрессией и диффузией наноразмерного коллоидного золота для повышения информативности ОКТ
4.1 Комплексная оценка возрастных морфофункциональных 94
особенностей кожи
4.1 Метод увеличения глубины визуализации 99
и контрастности слоев поверхностных биотканей компрессией 4.1.1 Материалы и методы 101
4.1.2 Результаты исследования компрессии на ex-vivo препаратах 102
4.1.3 Результаты исследования компрессии in-vivo 106
4.2 Метод увеличения контраста слоев и включений с использованием золотых наночастиц и наноразмерных частиц диоксида титана для метода ОКТ
4.2.1 Материалы и методы 111
4.2.2.Результаты исследования на фантомах биоткани ИЗ
4.2.3. Исследование аппликации коллоидного золота на коже 116
животных
4.3 Заключение 120
ГЛАВА 5. Наблюдение процессов модификации биоткани при помощи окт in situ при воздействии излучения лазеров и вч источников
5.1 Материалы и техника эксперимента 126
5.2 Наблюдение зоны воздействия при помощи ОКТ 129
5.3 In situ ОКТ мониторинг воздействия лазерного ИК излучения на 131 биовещество
5.3.1 Томограммы кинетики воздействия излучения YAG:Er лазера 131
5.3.2 Томограммы кинетики воздействия излучения YAG:Nd лазера 132 на длине волны 1.32 мкм
5.3.3 Томограммы кинетики воздействия излучения KGSS:Er лазера 133 и YAG:Nd лазера на длине волны 1.44 мкм
5.4 Исследование процессов фототермической денатурации и свеллинга биоткани в доабляционном режиме
5.4.1 Экспериментальное исследование вздутия 144
при воздействии лазерного излучения
5.4.1.1 Исследование кинетики образования вздутия с помощью ОКТ 144
5.4.1.2 Исследование временных параметров образования вздутия. 146
5.5 Сравнительные исследования ИК лазерного и ВЧ воздействий на 151
биоткани in vitro методом поляризационно-чувствительной оптической когерентной томографии
5.5.1 Материалы и методы 153
5.5.2 Результаты исследований 157
5.6 Заключение 163
ГЛАВА 6. Развитие методов проекционной одт 165 и дфт для диагностики злокачественных опухолей
6.1 Развитие метода ОДТ проекций для определения компонентного 170
состава злокачественных опухолей молочной железы
6.1.1 Схема установки 170
6.1.2 Объекты исследования 173
6.1.3 Результаты исследования методом ОДТ 174
6.1.3.1. Исследование на модельных средах 174 6.1.3.2 Результаты предклинических экспериментов 175
6.1.3.3 Результаты клинических экспериментов 176
6.2 Метод проекционной ДФТ для диагностики опухолей меченных 181
коллоидными квантовыми точками
6.2.1 Материалы и методы 183
6.2.2 Эксперименты на лабораторных животных post mortem 184
6.3 Заключение 187
Литература
- Развитие кросс-поляризационной оптической спектроскопии 4-1
- Методика маркирования границ опухоли
- Результаты экспериментов с модельными средами и биотканями
- Результаты исследования компрессии на ex-vivo препаратах
Введение к работе
Актуальность темы
Сложноорганизованная структура биологических объектов, сложность химического состава и отклика организма на воздействие, которое может значительно изменить физические характеристики биоткани, еще недавно практически не позволяли изучать динамику процессов внутри биоткани.
Аналитическое рассмотрение процессов взаимодействия излучения с веществом и распространения излучения в таких сложных комплексных средах началось с появлением численных методов, вызвавших резкий рост публикаций, посвященных построению математических моделей биообъектов.
В то же время, измерять характеристики in vivo можно только методами, которые не нарушают относительного динамического постоянства состава и свойств внутренней среды и устойчивость основных физиологических функций организма (гомеостаза), или же исследовать биоткань ex vivo. Следует отметить, что оптические характеристики в in vivo и ex vivo исследованиях часто кардинально отличаются. При этом разрешение методов должно позволять наблюдать структуру ткани на клеточном уровне или хотя бы на уровне слоев или групп клеток. Поэтому, с появлением новых оптических технологий, таких как волоконная оптика и фемтосекундные лазеры, усилия ученых были направлены на создание новых методов диагностики. Всем этим требованиям отвечают методы оптической визуализации, которые открыли принципиально новые возможности для мониторинга большинства биологических процессов. Осуществляя мониторинг лечебного процесса, можно своевременно корректировать его, вмешиваясь и управляя переходным состоянием, т.е. судьбой биологического организма.
Созданные за последнее время методы оптической визуализации [1] можно разделить на методы, позволяющие наблюдать микроструктуру ткани – оптическую томографию, и методы, регистрирующие биохимические изменениям, прежде всего спектроскопические и флуоресцентные методы.
Фундаментальной исследовательской задачей оптической томографии является получение изображений структуры живых биологических объектов на тканевом, клеточном и субклеточном уровнях на различных глубинах неинвазивным образом в реальном времени, а прикладной целью – создание новых методов диагностики и контроля процессов (например, процесса лечения больного).
Для зондирования в оптической томографии используется излучение ближнего инфракрасного диапазона, в так называемом "терапевтическом окне прозрачности", которое может сравнительно глубоко (до нескольких десятков сантиметров) проникать в биоткань и одновременно является неинвазивным вследствие малой величины энергии оптического кванта и малой мощности (сравнимой с солнечным излучением) источника излучения. В данном диапазоне длин волн внутренняя микроструктура биологических объектов имеет отличающиеся на несколько порядков оптические коэффициенты рассеяния и поглощения, что является принципиальным фактором формирования контраста. Рассеяние излучения в биотканях обусловлено пространственным распределением показателя преломления и зависит от особенностей строения биоткани. В свою очередь, данное распределение определяет макроскопические оптические параметры: коэффициент рассеяния s, коэффициент поглощения a и фактор анизотропии g (средний косинус угла рассеяния). Изменяя распределение показателя преломления внутри биоткани можно управлять ее оптическими характеристиками. Такое управление может быть осуществлено с помощью компрессии, а также применения просветляющих [2] или контрастирующих агентов [3].
В этой работе акцент делается на мониторинг процессов при наблюдении методами ОКТ и его модификаций – оптической когерентной микроскопии (ОКМ), кросс-поляризационной ОКТ (КП ОКТ) [4], оптической диффузионной томографии ОДТ [5] и кросс-поляризационной отражательной спектроскопии (КПОС) [6].
ОКТ – метод построения изображений внутренней структуры рассеивающих объектов, основанный на низкокогерентной интерферометрии с широкополосными источниками излучения видимого или ближнего инфракрасного диапазона длин волн. Благодаря успехам в оптике рассеивающих сред, появлением фемтосекундных и фемтокоррелированных источников излучения, оптоволоконных элементов и достижениям в вычислительной технике удалось разработать и создать оптические когерентные томографы, позволяющие получать прижизненную информацию о внутренней структуре поверхностных биотканей, в том числе слизистых оболочек, с пространственным разрешением до 1 микрона на глубину до 2 мм.
ОДТ основана на получении информации с помощью сильно рассеянной, диффузной компоненты, способной проникать в биоткань на глубину до десяти сантиметров. ОДТ позволяет обнаружить, идентифицировать, определить параметры поглощающих и рассеивающих неоднородностей внутри биоткани на основе обработки сигнала от прошедшего через ткань лазерного излучения. Как и для любого трансмиссионного метода, задача сводится к реконструкции распределения поглощения и рассеяния по измеренному набору интегралов по траекториям. В отличие от рентгеновской просветной томографии, где можно считать трассы лучей прямыми, здесь этого сделать нельзя из-за сильного рассеяния.
КПОС основана на поляризационном зондировании покровных биотканей, состоящих из эпителия и стромы. Биоткань зондируется линейно поляризованным широкополостным излучением ближнего ИК диапазона. Прием обратно рассеянного излучения от биоткани осуществляется одновременно в двух взаимно ортогональных поляризациях. Использование поляризационного приема позволяет выделить информативную компоненту излучения, которой является слабое упругое рассеяние от эпителия, на фоне мощного диффузного фона, состоящего из излучения, претерпевшего рассеяние в подлежащей строме. Физический принцип выделения рассеяния от эпителия основан на существенном различии оптических свойств эпителия и подлежащей стромы.
Основное содержание диссертации связано с экспериментальными исследованиями возможностей использования новых методов оптической диагностики для изучения процессов при разнообразных воздействия на биологические объекты и создания методов контроля и лечения.
Целями настоящей диссертационной работы
являются:
Главными исследовательскими целями диссертации является создание методов динамического наблюдения процессов в биотканях с использованием устройств оптической томографии, создание и модернизация самих устройств. Основной прикладной целью – создание новых методов для исследования физических и биологических процессов в живых системах в биологии и способов диагностики и контроля лечения в клинической практике.
Работа была направлена на решение следующих задач:
Разработать методы измерения параметров биоткани для создания медицинской диагностики неопластических процессов с помощью оптической когерентной томографии, оптической диффузионной томографии, кросс-поляризационной отражательной спектроскопии.
Развить методы КП ОКТ и КПОС для исследования деполяризации света при рассеянии на коллагеновых волокнах и на клетках. Создать прототип кросс-поляризационного отражательного спектрометра на поляризационно-сохраняющем анизотропном волокне для мониторинга границы злокачественных новообразований.
Развить метод проекционной ОДТ для определения компонентного состава биологических тканей.
Провести исследование возможности дифференциации слоев биоткани, отличающихся различной компрессией, в том числе для диагностики неопластических изменений.
Исследовать возможность дифференциации слоев биоткани, отличающихся различными диффузионными свойствами при использовании контрастирующих агентов – наноразмерных коллоидных частиц.
Показать возможность проведения органосохраняющих операций при определении границ злокачественной опухоли методом ОКТ.
Исследовать возможности методов ОКМ и ОКТ для мониторинга восстановления растительной ткани при различном водоснабжении.
С использованием ОКТ провести in situ наблюдение процессов модификации биоткани при воздействии излучения лазеров среднего ИК диапазона. Сравнить ИК лазерное и ВЧ воздействие на биоткани in vitro при мониторинге методом поляризационно-чувствительной оптической когерентной томографии.
Научная новизна диссертационной работы
Первые клинические ОКТ изображения нормальных и патологически измененных тканей в эндоскопии, гинекологии, отоларингологии, стоматологии показали различия в структуре их ОКТ образов. Создана методика проведения органосохраняющих операций гортани с определением границ злокачественной опухоли методом ОКТ и бескровной лазерной резекции на длинах волн 1.44 мкм и 1.32 мкм.
Для диагностики злокачественных опухолей разработан и создан новый эндоскопический прибор на основе метода кросс-поляризационной отражательной спектроскопии на оптическом волокне, сохраняющем поляризацию.
Впервые проведено систематическое исследование возможностей нового метода диагностики биологических сред – оптической когерентной томографии – для мониторинга взаимодействия лазерного излучения с биотканями. Впервые детально исследован процесс свеллинга биотканей под действием импульсно-периодического лазерного излучения с наблюдением динамики формирования вздутия.
Получены одни из первых ОКТ и ОКМ изображений семян и растительных тканей. Впервые создана методика определения засухоустойчивости растений при помощи мониторинга восстановления растительной ткани при различном водоснабжении при помощи метода ОКТ.
Практическая значимость работы
Высокая потребность в новых методиках и приборах оптической томографии объясняется широкой областью их применения. По результатам исследования разработаны и модифицированы установки для ОКТ, КП ОКТ, КПОС и ОДТ. В ходе исследования проведена оптимизация параметров лазерных установок, использующихся для воздействия на биоткани. На основе разработанных установок созданы методики для использования в биологии и практической медицине. Методики апробированы в модельных экспериментах, лабораторных животных, а также в клинических условиях.
Показаны варианты использования разработанных устройств и методик:
- в мониторинге жизнедеятельности растений;
- в диагностике функциональных и морфологических изменений живых объектов (в том числе и лабораторных животных) в экспериментальной биомедицине;
- в контроле различных видов воздействия на живые системы, в том числе в клинической практике;
- в диагностике патологических процессов (в том числе и неоплазии) в клинической практике.
На защиту выносятся основные положения:
1. Различие оптических свойств нормальных и патологически измененных покровных тканей позволяют разработать критерии интерпретации клинических изображений, полученных с использованием эндоскопической ОКТ установки.
2. Методика проведения органосохраняющий операции гортани при злокачественной опухоли может быть создана на основе метода диагностики границы методом ОКТ с точностью нескольких сотен микрон и бескровной лазерной резекцией на длинах волн 1.44 мкм и 1.32 мкм.
3. КП ОКТ позволяет дифференцировать здоровую, неопластическую слизистую и метаплазию на основе резкого различия в деполяризации света при рассеянии на коллагеновых волокнах и на клетках.
4. Метод кросс-поляризационной отражательной рефлектометрии позволяет в режиме реального времени, неинвазивно определять границы злокачественных образований.
5. Использование компрессии позволяет контрастировать ОКТ-изображения слоев биоткани с различными механическими свойствами. Компрессия с силой более 1 Н (при площади щупа 5 мм2) позволяет выделить особенности на ОКТ-изображениях, которые отличаются при воспалении и карциноме прямой кишки при диагностике в экспериментах ex vivo.
6. Контрастирование структурных элементов ОКТ-изображений покровных тканей животных in vivo может быть основано на различии диффузионных свойств ткани для наночастиц c плазмонным резонансом на длине волны зондирующего излучения. Максимальный контраст между слоями (10 дБ, на глубине 500-700 мкм) при сравнении эффективности применения различных наночастиц в качестве контрастирующих агентов достигается при использовании золотых нанооболочек, обладающих плазмонным резонансом на частоте локации.
7. В широком диапазоне параметров ИК лазерного излучения, поглощаемого в биовеществе, в основном, водой, оптическая когерентная томография позволяет наблюдать динамику процессов фотоденатурации, свеллинга (разбухания) и абляции, а также измерять термически пораженную зону в результате лазерного воздействия. Метод ОКТ может быть успешно использован для диагностики процессов лазерной модификации биотканей в реальном времени.
8. При локации поглощающих и рассеивающих включений в биоткани оптический диффузионный томограф, основанный на регистрации сильно рассеянной (диффузной) компоненты излучения методом волн фотонной плотности, позволяет определять компонентный состав (окси - и дезоксигемоглобина) биоткани, и может быть применен для мониторинга лечения злокачественных опухолей молочной железы.
Апробация работы
Работы, представленные в диссертации, осуществлялись по программам Президиума РАН «Фундаментальные науки – медицине», «Фемтосекундная оптика и новые оптические материалы» и «Поддержка инноваций и разработок»; по госконтрактам Министерства промышленности и науки РФ (контракт № 2/1 от 24 декабря 1998 г. "Оптический томограф для построения изображений живых биотканей", контракт № 4/2000 от 15 сентября 2000 г. "Микроскоп для визуализации трехмерной структуры оптически непрозрачных объектов") и Министерства образования и науки РФ (контракт № 02.522.11.2002 «Разработка технологий оптической томографии и выпуск опытных партий приборов для диагностики биологических тканей»; контракт № 02.435.11.3004 "Разработка методов прижизненного мониторинга молекулярных процессов в живых организмах на основе принципов флуоресцентной томографии"; контракт № 40.018.1.1.1312 “Развитие новых методов оптической томографии для диагностики биологических структур”); по грантам РФФИ (№ 04-02-16748-а «Исследование процессов распространения и взаимодействия оптического излучения в сильнорассеивающих средах методами светодиффузионной томографии и оптоакустики», № 05-08-50276-а «Разработка опытного образца автоматизированного медицинского диагностического комплекса на основе метода оптической диффузионной томографии», № 07-02-01127- «Поляризационная оптическая спектроскопия»); по международным грантам ИНТАС (97-1430 «Towards controlled laser physics and engineering of proteoglycan based tissues») и СRDF (№ RB2-2389-NN02 “Development of methods for early diagnostics of neoplasia using optical coherence tomography).
Основные результаты, изложенные в диссертации, неоднократно докладывались на семинарах в Институте прикладной физики РАН, а также на следующих конференциях: Оптика лазеров' 93 (Ленинград), IX-th Conference on Laser Optics, (S.-Petersburg), the Workshop on Optical Technologies in Biophysics & Medicine (Saratov Fall Meeting 1998, 1999, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, на 6 международной конференции Лазерные Технологии ILLA' 98 (Шатура, Московская область), Фундаментальные и прикладные исследования в медицине (конференция РАЕ); 2003, Греция, Лутраки, I-II Троицкая конференция «Медицинская физика и инновации в медицине» (г. Троицк), международные; International Simposium on Intensive Laser Actions and their Applications IllA и Conference on Laser Application Engineering LAE-8 (Сан-Петербург-96); Exhibition presentation at 10 Conference on Laser Optics, St. Petersburg, 2000, CLEO' 96, 98, BiOS Europe'96 of Conference Photonics West (Вена), Fourth International Conference on Laser Ablation COLA' 97 (Monterey), BiOS of Conference Photonics West 94, 96, 97, 98, 99, 2000, 2001, 2002, 2003, 2004, 2005, 2006, 2008 (San-Jose), 17th International Cancer Congress, (Brasil), Annual Meeting of the Americal Society for Laser Medicine and Surgery (San-Diego) 98, 99, RGLS’2000, 21.09.00-26.09.00, Suzdal, 11th International Laser Physics Workshop. Bratislava, Slovac republic, 2002, of International Quantum Electronics Conference & Conference on Lasers, Applications, and Technologies. June 24-27, 2002, OSA Technical Digest, Marwood N. Ediger, ed. (Optical Society of America, Washington, D.C., 2002), IQEC/LAT 2002, Восьмая Российская гастроэнтерологическая неделя, Москва, 2002, OSA Biomedical Topical Meeting. Miami Beach, FL, USA. 14–17 апреля 2004, EUROGIN 2004 International Expert Meeting, . Российско-германский лазерный симпозиум (RGLS-2005). Нижний Новгород, Россия. 1–7 октября 2005 г., (ICONO/LAT 2005), Eurobios 2005, (LPHYS’05) St. Petersburg, the 10th Int. Congress on Oral Cancer, Crete, Greece 2005, European Cancer Conference of Oncology-13, Paris, France, October 2005, Китайско-российский семинар по биофотонике (BBO, Вухань, 2006). Международная школа Saratov Fall Meeting 1998-2009, «Отечественные противоопухолевые препараты» 2008-2009, Всероссийская конференция Нелинейная динамика в когнитивных исследованиях, Нижний Новгород 2009, Biophysics & bioelectrochemistry for medicine 2009, 6-10 May, Cisnadioara, Romania, (2009), ECBO 2009, Topical Problems of Biophotonics-2007, 2009 и другие.
За установку кросс-поляризационной отражательной спектроскопии получена золотая медаль на международной выставке «Инновация-2008» в Брюсселе.
За установку оптический диффузионный томограф получена золотая медаль по международной программе «Golden Galaxy» в 2009 г.
Структура и объем диссертации
Диссертация состоит из введения, шести глав, двух приложений и списка литературы. Общий объем, включая 187 страницы основного текста с 68 рисунками, 2 приложениями на 38 страницах и списка литературы из 232 наименований на 32 страницах, составляет 259 страниц.
Основное содержание диссертации опубликовано в 53 печатных работах, включая 22 статью в журналах, входящем в перечень ВАК, 20 статей в зарубежных журналах, входящих в международные системы цитирования 5 глав в книгах, 5 патентов и заявок на патенты и один препринт.
Развитие кросс-поляризационной оптической спектроскопии 4-1
Широко распостраненное в медицине пронятие неинвазивности связывают с получением информации без нарушения целостности покровных тканей и введения токсичных контрастных" агентов. Это не соответствует физическим понятиям воздействия на1 объект исследования и отклика на воздействие. С физической точки зрения полностью не воздействующих (неинвазивных) методов не бывает в силу самой природы активной локации и нужно говорить о степени воздействия. Сложноорганизованная структура биологических объектов, многокомпозитность химического состава и отклик организма на воздействие, которое может значительно изменить физические характеристики биоткани, еще недавно практически не позволяли изучать динамику изменений параметров биоткани. В тоже время измерять характеристики можно только методами, которые не нарушают относительное динамическое постоянство состава и свойств внутренней среды и устойчивость основных физиологических функций организма (гомеостаз), или же исследовать биоткань ex vivo. Следует отметить, что оптические характеристики в in vivo и ex vivo исследованиях часто кардинально отличаются. И поэтому после появления новых оптических технологий, таких как волоконная оптика и фемтосекундные лазеры, усилия ученых были: направлены на создание новых,. соответствующих этим требованиям, современных диагностических методов;
Методы оптической томографии позволяют минимизировать воздействие и: открыли1, принципиально новую возможность для? in. sity, мониторинга; большинства биологических процессов. Осуществляя мониторинг процесса? в: .реальном: времени; можно своевременно; корректировать его, вмешиваясь,, и управляя переходным состоянием,; т.е. судьбой биологического организма.
Созданные зашоследнее время; методы оптической диагностики можно разделить, на методы, позволяющие4 наблюдать микроструктуру ткани — оптическую! томографию и методы, регистрирующие биохимические1
Даннаяаработаакцентировалась на диагностике ишокациисструктурных изменений; в живых системах, но. и. функциональные особенности живых, систем оказалось необходимо.; учитывать. Для?, зондирования использовалось излучение ближнего инфракрасного, диапазона в так называемом "терапевтическом окне прозрачности", которое: может сравнительно глубоко (до нескольких десятков сантиметров) проникать в биоткань и одновременно; является, невоздействующимг вследствие; малош величины, энергии оптического-квантами малой; мощности;(сравнимой с солнечнымшзлучением) источника излучениям В данном? диапазоне длин: . волн внутренняя;» микроструктура;биологических объектов имеет отличающиеся на. несколько порядков оптические коэффициенты рассеяния;и. поглощения , что является принципиальным фактором формированияконтраста [6].
Методы оптической томографии можно разделить на использующие баллистические фотоны и диффузионные фотоны. Первые; из них (конфокальная микроскопия (КМ) [7], оптическая когерентная томография; (ОКТ) [8,9] многофотонная флуоресцентная; микроскопия,. (МФМ) [10], когерентной оптической проекционной; томографии (КОПТ) [11]) используют различные приемы селекции при детектировании слабо рассеянных фотонов на фоне засветки от сильно рассеянного света и могут давать изображения с разрешением 1-10 микрон на небольших глубинах в диапазоне 0.1-1 мм. Вторые (оптическая диффузионная томография (ОДТ) [12,13], флуоресцентная диффузионая томография ФДТ [14,15,16] опто акустическая томография (ОА) [17,18]), наоборот, используют только сильно рассеянную компоненту света и позволяют с разрешением в несколько миллиметров наблюдать оптические неоднородности на глубине до десяти сантиметров. Областями приложений" являются мониторинг состояния слизистых оболочек внутренних органов, маммография, оптическая томография мозга, наблюдение тканей глаза. Достаточно специфичен метод кросс-поляризационной оптической спектроскопии, который позволяет на основе поляризационного стробирования отделить спектр, рассеянный на эпителии от мощной засветки связанной с рассеянием от стромы [19]. В тоже время существуют методы, которые используют и баллистические И диффузные фотоны, например, спекл-корреляционный метод зондирования случайно-неоднородных динамических сред (спекл-коррелометрия» полного поля) [20,21] .
В этой диссертационной работе акцент делается на создание методов диагностики и мониторинга процессов в биотканях с использованием ОКТ, и его модификаций КП ОКТ и ОКМ, а также ОДТ и КПОС.
Методика маркирования границ опухоли
В ОКМ объединены факторы геометрической (конфокальной) и временной (когерентной), селекции информативного сигнала. В установке:для оптической когерентной микроскопии . (ОКМ) используется широкополостный источник, в первых работах фемтосекундныш лазер; и добавлена система динамического фокуса:,:как уконфокального/микроскопа; . Более высокое пространственное разрешение ОКМ- по« сравнению с ОКТ позволяет рассчитывать на , получение» более детальной; информации о внутренней; структуре биообъектов. ОКМ? позволяет выявить, и; в. ряде случаев; четко идентифицировать» элементы морфологической структуры; объектов; которые не удается) идентифицировать при помощи;. ОКТК На данный! момент [56]/ разрешение данного метода» достигло Г-Змкм;, при области перестройки.400 мкм.
Нами І использована экспериментальная» установка; для» оптической-когерентной- микроскопии (ОКМ), с разрешающей способностью» 5-7 мкм, созданная- в нашем отделе: Внешний вид установки и параметры подробно изложены; на www.bioimaging.ru. В; установке для; оптической: когерентной микроскопии- реализация широкой- полосы зондирующего излучения: достигается; путем: мультиплексирования суперлюминесцентных диодов, и добавлена система; динамического фокуса.; позволяющая; ввести, геометрическую селекцию;сигнала:
При этом- не требуется; применять фиксаторы или приготавливать тонкие срезы исследуемой-биоткани.,, что является одним из существенных. преимуществ данного; метода.
Однако приемная система ОКМ, созданного в ИПФ имеет диаметр около 60 мм и она контактная. Поэтому прицеливание на объект затруднено и необходимо жестко фиксировать объект исследования.
Методика проведения, экспериментов заключалась в следующем. В ОКМ исследованиях в качестве иммерсионной: среды применялась вода. Объект помещался на увлажненный предметный столик микроскопа так,. чтобы исследуемый участок его поверхности находился над зоной so сканирования, и фиксировался при помощи предметного стекла. ОКТ и ОКМ образы были получены с одного и того же участка ткани растения, который отмечался специальным маркером. Получение образов тканей осуществлялось in situ. ОКТ и ОКМ исследования проводились таким же образом, как описано в работе [57, 58].
В Нижнем Новгороде в клинических условиях методом ОКТ было обследовано более 3000 пациентов с различными видами патологии. В результате проведенных исследований было установлено, что морфологические структуры и слои ткани имеют различные оптические характеристики, что обусловлено их пространственной организацией. На томограммах здоровые ткани визуализируются в виде нескольких слоев с четкими границами. На первом этапе все исследования проводимые нашей лабораторией на ОКТ установках, создаваемых в ИПФ РАН сопровождались сравнением с традиционным гистологическим исследованием. Гисто-томографический анализ заключался в сравнении полученных ОКТ изображений с гистологическими данными изучаемого участка биоткани. Верификация ОКТ томограмм проводилась путем сопоставления с гистологическими исследованиями [37]. Основной проблемой являлась прицельная вырезка препарата. При работе с ex vivo образцами использовались иглы для точного определения и ориентации участка ткани, подлежащего гистологической верификации. При работе in vivo точное место исследования описывали в виде условной зоны (например, часы условного циферблата). При взятии биоптата ориентировались на след в виде углубления, оставляемый зондом при получении изображения.
Для морфологической верификации материал, фиксированный в 10% нейтральном формалине, проводили по спиртам восходящей крепости и двум порциям хлороформа, а затем заливали в парафин, учитывая правильную ориентировку ткани, так, чтобы последующая линия среза проходила перпендикулярно поверхности слизистой оболочки. Приготовленные срезы толщиной 6 микрон, полученные с помощью санного микротома, после депарафинизации окрашивали гематоксилином и эозином. Препараты просматривались с помощью бинокулярного микросюотта с увеличением бООх (объектив - 40, окуляр - 15). С помощью микросккізпа фирмы «LEICA» с цифровой видеоприставкой, совмещённого с персої згальньїм компьютером, получены видеоизображения гистологических npenajr :aTOB, соответствующие по своим горизонтальным размерам стандартной т т« лограмме (увеличение 75х). Далее сопоставлялись ОКТ изображе зг ил и видеообразы гистологических препаратов, и проводилось их визз альное сравнение для определения морфологических аналогов оптических ср еноменов.
Соответствие размеров гистологических и огх х"ических изображений необходимо для проведения морфометрии. Морфзхзметрия предполагала измерение размеров изучаемых элементов, а также глубину их залегания относительно поверхности. Эти данные позволили определить аспектные отношения элементов изображения, что имеет важное значение для интерпретации томограмм.
Интерпретация оптических изображений, noJFi3 xieHHbIX с помощью ОКТ, является очень серьезной и непростой задачей.
В тоже время метод ОКТ и специфи с: покровных тканей предполагает наличие элементов симметрии в ОКТ изображении: а) Диаграммы направленности излучателя и пр з:емника в методе ОКТ соосны, ориентированы по нормали к границе среды їг полезный ОКТ-сигнал в основном сформирован в результате однократног" о обратного рассеяния баллистической компоненты зондирующего излуче:юіЕіЯ, позволяет сделать вывод - сигнал на изображении является убываюи гпл по вертикали. При этом глубина визуализации в покровных тканях достигг а.ет 2 мм; б) Морфология большинства покровных тканеїЗ: предполагает наличие горизонтально ориентированных слоев.
Результаты экспериментов с модельными средами и биотканями
Диагностика биологических объектов и тканей является актуальной задачей, имеющей огромное прикладное значение для» современной медицины [131-132]. Подавляющее большинство злокачественных опухолей имеет эпителиальное происхождение. На ранних стадиях заболевания предопухолевые изменения возникают на базальной мембране, которая отделяет эпителий от стромы. Поэтому, одним из наиболее важных требований к методам ранней диагностики является требование достоверно обнаруживать злокачественные изменения на относительно, небольшом пространственном масштабе - толщине эпителия и начальных слоях стромы. Ранняя диагностика онкологических заболеваний призвана увеличить долю ранних стадий в структуре вновь обнаруженных случаев и, следовательно, существенно1 повысить долю пациентов с благоприятным прогнозом на излечение, что позволит со временем значительно уменьшить смертность, ассоциированную со злокачественными новообразованиями.
В настоящий момент «золотым стандартом» диагностики злокачественных новообразований в мировой медицинской практике является метод гистологической верификации биопсийного материала. Этот метод, из-за инвазивности, может иметь негативные последствия для пациента: от дискомфорта до серьезных осложнений. Кроме того, анализ полученного материала занимает продолжительное время. В связи с этим в настоящее время активно развиваются методы диагностики, которые характеризуются неинвазивностью и реальным временем получения информации. Развитие патологических процессов сопровождается структурными изменениями. ОКТ позволяет детектировать морфологические нарушения ткани при разных патологиях. Например, неопластические процессы характеризуются наиболее выраженной структурной реорганизацией ткани, ОКТ образы злокачественных опухолей бесструктурны Таким образом эндоскопическое ОКТ дает возможность проводить диагностику злокачественных образований. Однако не только неопластические изменения делают ткань бесструктурной, ОКТ образы воспаления, метаплазии, папилломы, неэпитализированного рубца сходны и снижают специфичность стандартного ОКТ метода по диагностике злокачественных новообразований.
Получение информации нового вида может существенно повысить диагностическую ценность ОКТ. Мы стали исследовать поляризационные свойства поверхностных биотканей. В начале 2000 годов уже существовали установки поляризационно чувствительной ОКТ (ПЧ ОКТ) и в основном использовались для определения двулучепреломления биосред [79-83,85]. Эффекты двулучеплеломления присутствуют только в некоторых биотканях, в частности ногти, хряши, роговица глаза, в тоже время явление деполяризации излучения при рассеянии на анизотропных микронеоднородностях присутсвует во всех поверхностных биотканях. Биоткань зондируется линейно поляризованным широкополосным излучением ближнего ИК диапазона. Прием рассеянного от биоткани излучения осуществляется одновременно в двух поляризациях зондирующего излучения, — исходной и ортогональной. Использование кросс - поляризационного приема позволяет напрямую, без вычислений, определить как компоненты биоткани деполяризуют излучение. Физический принцип, на котором основано выделение рассеяния от эпителия, использует существенную разницу в оптических свойствах эпителия и подлежащей стромы. Несмотря на то, что в эпителии присутствует широкий диапазон рассеивателеи с размерами от долей длины волны зондирующего излучения (органеллы, элементы текстуры ядер и т.д.) до нескольких длин» волн (ядра, клетки), вариация показателя преломления клеточных структур не превышает нескольких процентов от некоего среднего показателя преломления эпителия. С высокой степенью точности можно считать, что эпителий г рассеивает зондирующее излучение преимущественно вперед без изменения поляризации [134,18]. Далее зондирующее излучение, сохранившее свою изначальную линейную поляризацию, попадает в подлежащую строму, которая, по сути, представляет собой» сложную плотную трехмерную сетку из волокон коллагена. Элементарным рассеивателем в строме является двумерная структура — волокно1 из коллагена, что существенно отличает строму от эпителия. По мере распространения в строме, зондирующее излучение претерпевает многократное рассеяние и быстро деполяризуется. Фактором, обуславливающим быструю деполяризацию в строме, является микродеполяризация на волокнах коллагена. Излучение, рассеянное от стромы, полностью теряет оригинальную поляризацию и дает одинаковый вклад в прямой и ортогональный каналы. Различные по природе патологические процессы характеризуются как различным содержанием коллагеновых волокон, так и их пространственной организацией: Следовательно, сравнительное изучение свойств биотканей рассеивать назад в ортогональной поляризации может быть положено в основу метода ранней диагностики неоплазии. В данной главе мы рассмотрим два метода которые используются для диагностики злокачественных новообразований используя описанный выше физический принцип КП ОКТ и КПОС.
Результаты исследования компрессии на ex-vivo препаратах
Целью работы было исследование влияния компрессии на оптические характеристики биоткани для создания методики измерений при помощи ОКТ. Необходимо было оценить эффективность механической компрессии для точной дифференциации хронического воспаления и карциномы на ОКТ изображениях и определить порог воздействия, позволяющего обнаружить различия.
Показано, что неконтролируемая компрессия и реакция организма на нее является негативным фактором при ОКТ визуализации различных процессов.
В тоже время положительным фактором является различная эластичность слоев биоткани, которая ведет к тому, что, слои обладающие близкими оптическими свойствами в недеформированном состоянии по разному меняют свои оптические свойства при компрессии, что ведет к повышению контраста на томографических изображениях. Особенностью предлагаемого метода является» возможность повышения контраста областей с различными механическими свойствами, благодаря, соответствующим изменениямшри компрессии их оптических свойств [149].
Следующим фактором является»то, что высокая степень эластичности некоторых биотканей позволяет повысить глубину визуализации. Известно, что неопластические изменения меняют эластичность биоткани [150]. Таким образом, контролируемая компрессия позволяет выделить дополнительные признаки на ОКТ изображениях для дифференциальной диагностики патологических состояний.
Для получения сравнимых результатов, в различных сериях- опытов необходимо контролировать степень деформации» биоткани. Для этого мы использовали» щуп оптического когерентного томографа, снабженный измерителем величины прижима к исследуемому объекту. В применении к методу ОКТ разработаны 3 основных метода контроля степени; механической деформации биоткани [151,152].
В первом методе в качестве измерителя прижима щупа! оптического когерентного томографа используется сжимаемый материал, прозрачный для, излучения, наносимый на поверхность щупа оптического когерентного томографа, обращенную к исследуемому объекту. Применение сжимаемого материала в качестве измерителя прижима щупа оптического когерентного томографа наиболее удобно и просто в использовании. Но, так как в качестве сжимаемого материала чаще используется органическое вещество, срок службы такого измерителя ограничен годом.
Во втором методе в качестве измерителя прижима щупа оптического когерентного томографа используется і динамометр. Наиболее целесообразно использование динамометра для измерения величины прижима в мягких тканях, где требуется наибольшая сила (35 — 350 Па) прижима.
В третьем методе в качестве измерителя прижима щупа оптического когерентного томографа используется ультразвуковой динамометр. Его рационально использовать для стабилизации давлений малой величины (7-700 Па), например, при воспалительных процессах в тканях.
Мягкие биологические ткани отличаются эластичностью, следовательно, даже небольшое давление может привести к сильному сжатию объекта, что в свою очередь не может не отразиться на характере получаемой информации.
Нами проводилось исследование слизистых желудочно-кишечного тракта. Эффект замечен на тканях прямой кишки, пищевода, слизистой мочевого пузыря. В качестве примера, в данной работе, мы приводим исследование слизистой оболочки прямой кишки. Это обусловлено рядом причин: слизистая оболочка прямой кишки имеет упорядоченную і слоистую структуру, цилиндрический эпителий расположен на неровной базальной мембране и образует крипты, подэпителиальный слой неоднороден и представлен рыхлыми структурами. В нормальном состоянии слизистая прямой кишки представляет собой трехслойную структуру. Сверху располагается железистая слизистая, затем следуют подслизистая основа и мышечный слой. Все слои сильно отличаются по степени эластичности и по-разному сжимаются, что приводит к изменению рассеяния от этих слоев.
Резецированный участок прямой кишки помещался на подложку. Вертикально над ним располагался щуп оптического когерентного томографа в специальной насадке, измеряющей силу воздействия на образец со стороны щупа. Щуп прижимался к поверхности. Получалось ОКТ-изображение объекта, после чего изменялась сила компрессии, и измерения повторялись. Давление изменялось в пределах от 0.5 до 2.5 Н на площадь поперечного сечения зонда (5.7 мм").
Для оценки величины изменения рассеивающих и поглощающих свойств слоев при компрессии использовалось понятие контраста ОКТ-изображений, вычисление которого производилось следующим образом. На томограмме выделялся однородный по поперечной координате участок (Рис 4.5а). Значение сигнала внутри этого участка усреднялось по поперечной координате и для него строились зависимости интенсивности ОКТ-изображения от глубины (Рис 4.56). Затем определялись значения интенсивности исследуемых слоев на ОКТ-изображении в децибелах, и находилась их разность, что соответствует отношению этих интенсивностей, выраженному в децибелах.
Определение контраста между слоями на ОКТ-изображениях. На ОКТ-изображении биоткани выделяется однородный по поперечной координате участок (а); значение сигнала внутри этого участка усредняется по поперечной координате (б); затем определяется значения интенсивности исследуемых слоев в децибелах (показаны жирными горизонтальными линиями); их разность является контрастом.
