Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 13
1.1. Структурная и пространственная организация коллагеновых волокон в соединительных тканях в норме и при патологических процессах 22
1.1.1. Состояние коллагеновых волокон в соединительных тканях в норме .
1.1.2. Состояние деградации коллагеновых волокон при патологических процессах
1.1.3. Состояние избыточного накопления коллагеновых волокон при патологических процессах
1.2. Двулучепреломление и деполяризация света коллагеновыми волокнами 29
1.3. Оптические методы оценки состояния коллагеновых волокон в тканях 35
1.3.1. Морфологическое исследование коллагеновых волокон с помощью поляризационной микроскопии 36
1.3.2. Генерация второй оптической гармоники как метод оценки коллагеновых волокон 41
1.3.3. Поляризационные варианты оптической когерентной томографии для оценки состояния коллагеновых волокон 46
Глава 2. Объекты и методы исследования 64
2.1. Объекты исследования 64
2.2. Кросс-поляризационный оптический когерентный томограф 69
2.3. Методики исследования 75
2.4. Количественная обработка изображений 81
Глава 3. Результаты и их обсуждение 84
3.1. Зависимость ОКТ-сигнала в ортогональной поляризации от состояния коллагеновых волокон 84
3.1.1. Исследование структуры КП ОКТ изображений сухожилия и рубцовой ткани 84
3.1.2. Изучение ОКТ-сигнала на ортогональных изображениях слизистых оболочек человека в норме 89
3.1.3. Изменение ОКТ-сигнала на ортогональных изображениях слизистой оболочки десны после лазерной коагуляции коллагеновых волокон 92
3.1.4. Изучение ОКТ-сигнала на ортогональных изображениях слизистых оболочек щеки и мочевого пузыря при патофизиологических процессах 96
3.2. Разработка способов количественной оценки КП ОКТ изображений 106
3.3. Количественные критерии прижизненного разделения состояния коллагеновых волокон при различных патофизиологических процессах в слизистых оболочках методом КП ОКТ 110
3.3.1. Слизистая оболочка щеки: количественная оценка КП ОКТ изображений разработанными способами 110
3.3.2. Слизистая оболочка мочевого пузыря: количественная оценка КП ОКТ изображений разработанными способами 113
Заключение 121
Выводы 123
Список цитированной литературы 124
Список сокращений
- Состояние избыточного накопления коллагеновых волокон при патологических процессах
- Генерация второй оптической гармоники как метод оценки коллагеновых волокон
- Кросс-поляризационный оптический когерентный томограф
- Изучение ОКТ-сигнала на ортогональных изображениях слизистых оболочек человека в норме
Введение к работе
Актуальность проблемы
Вопросам изучения структурной организации внеклеточного матрикса соединительной ткани и его перестройке при патологических процессах в последние годы уделяется пристальное внимание (Sellaro T.L., 1999; Игнатьева Н.Ю., 2011). Методами высокоразрешающей микроскопии доказано, что пространственная и структурная организация коллагеновых волокон, преобладающего компонента внеклеточного матрикса соединительной ткани, неизбежно повреждается в ходе различных патологических процессов – воспаления, неоплазии, а также при воздействии ряда внешних факторов: ионизирующего излучения при лучевой терапии, интенсивного лазерного излучения при проведении операций и лазерной коррекции (Fratzl P., 2008; Овчинникова О.А., 2008). Данные о характере и степени повреждений коллагеновой сети могут быть использованы в клинике для дифференциальной диагностики заболеваний, выявления ранних неопластических процессов, определения ответа соединительнотканной стромы на проводимое лечение, определения качества трансплантатов на основе коллагена (Шангина О.Р., 2007; Мальцев А.В., 2011).
С этой точки зрения востребованными являются минимально инвазивные, высокоразрешающие и доступные методы визуализации внутренней структуры тканей, в частности, оптическая когерентная томография (ОКТ), в настоящее время признанная мировым сообществом как инновационный метод прижизненной визуализации. Метод ОКТ обеспечивает формирование двух- и трехмерных изображений структуры тканей в режиме реального времени на глубинах до 1-2 мм с микронным разрешением (до единиц мкм). Технология основана на низкокогерентной интерферометрии в ближнем инфракрасном диапазоне длин волн (700-1300 нм). Получаемые изображения определяются распределением поля обратно рассеянной зондирующей волны и характеризуют эффективность рассеяния на оптических неоднородностях биоткани, обусловленных составом и строением ее слоев и отдельных структур (Huang D. et al., 1991; Popp J. et al., 2012).
ОКТ имеет большие преимущества как метод визуализации, позволяющий формировать изображения слизистых оболочек внутренних органов с помощью эндоскопических зондов на глубину до 1-1,5 мм (Гладкова Н.Д. и др., 2007; Brezinski M.E. et al., 2013). Многими исследовательскими группами показана эффективность использования поляризованного света для изучения состояния коллагеновых волокон
фиброзных тканей с высоким содержанием коллагена, что реализовано в технологии поляризационно-чувствительной ОКТ (ПЧ ОКТ). Так, методом ПЧ ОКТ детектируют нарушения нормального состояния (структурной и пространственной организации) коллагеновых волокон сухожилий (Rashidifard C. et al., 2012), связок (Martin S.D. et al., 2003), межпозвоночных дисков (Beaudette K. et al., 2012), суставных хрящей (Adams S.B. et al., 2006), дермы (Pierce M.C. et al., 2004), тканей глаза, костной и зубной тканях (Chen Y. et al., 2005). В ПЧ ОКТ в дополнение к традиционному ОКТ-изображению строится карта фазовой задержки (de Boer J.F. et al., 1997; Nadkarni S.K. et al., 2007), скорость изменения которой с глубиной характеризует ориентацию, степень структурной организации коллагена на волоконном и тканевом уровнях (Liu B. et al., 2006).
Кросс-поляризационная ОКТ (КП ОКТ) – модификация ПЧ ОКТ, формирующая одновременно два изображения путем раздельной регистрации рассеянного излучения в двух каналах, параллельном и перпендикулярном поляризации зондирующего излучения (изображения в исходной и ортогональной поляризациях, соответственно). В отличие от ПЧ ОКТ, где акцент делается на поиске двулучепреломляющих свойств исследуемой ткани, проявляющихся в виде паттернов на картах фазовой задержки, КП ОКТ визуализирует случайную когерентную деполяризацию излучения, как за счёт двулучепреломления, так и за счет рассеяния в исследуемой биоткани (Schmitt J.M. et al., 1998). В данной работе термин «деполяризация» означает изменение состояния исходной поляризации распространяющегося в среде излучения в результате его взаимодействия со средой. Для появления сигнала в ортогональном канале важно, чтобы деполяризованное излучение сохранило когерентность, что обеспечит интерференцию с опорной волной.
Метод КП ОКТ приборно реализован нижегородской научной группой ОКТ, он развивается и получает широкое клиническое применение в эндоскопии (Feldchtein F. et al., 1998; Гладкова Н.Д. и др., 2007). Исследованию состояния коллагеновых волокон слизистых оболочек поляризационными вариантами ОКТ посвящено небольшое число работ (Klein A.M. et al., 2006; Kim K.H. et al., 2010). Систематические исследования патологии слизистых оболочек методом КП ОКТ на протяжении последних 10 лет проводит нижегородская группа ученых (Kuranov R.V. et al., 2002; Gelikonov V.M. et al., 2006). В последних клинических исследованиях показана целесообразность и необходимость внедрения метода КП ОКТ в медицинскую практику в диагностических целях. Установлено, что ОКТ-изображения в ортогональной поляризации позволяют дифференцировать патологические состояния слизистых оболочек со схожей визуальной
(эндоскопической) картиной (Кузнецова И.А., 2013; Стрельцова О.С., 2013). С этой точки зрения весьма актуальна разработка способов оценки КП ОКТ изображений для определения количественных критериев разделения патологических состояний слизистых оболочек по деполяризующим свойствам коллагеновых волокон соединительнотканной стромы органов. Параллельные морфологические исследования состояния коллагеновых волокон в строме слизистых оболочек важны для раскрытия механизмов деполяризации поляризованного зондирующего излучения в биоткани и формирования ОКТ-сигнала в ортогональном изображении.
Цель и задачи исследования
Цель данной работы состояла в определении количественных характеристик когерентной деполяризации света для разработки критериев прижизненного разделения состояния (пространственной и структурной организации) коллагеновых волокон при различных патофизиологических процессах в слизистых оболочках.
Исходя из поставленной цели, были сформулированы следующие основные задачи:
1. Провести анализ зависимости характера ОКТ-изображения в ортогональной
поляризации от состояния коллагеновых волокон слизистых оболочек при
патологических процессах, подтвержденных гистологическими исследованиями.
-
Определить характеристики когерентной деполяризации света ОКТ-изображения, чувствительные к изменению состояния коллагеновых волокон слизистых оболочек разных органов и на их основе разработать способ количественной оценки КП ОКТ изображения.
-
Применить найденные характеристики когерентной деполяризации света ОКТ-изображения в качестве критериев степени дезорганизации/организации коллагеновых волокон при клинически значимых патологических процессах для диагностических целей.
Научная новизна результатов
Впервые проведены параллельные сопоставления КП ОКТ изображений, оценивающие состояние соединительнотканной стромы слизистых оболочек человека в условиях in vivo и изображений этих же объектов, полученные различными видами оптической микроскопии в условиях in vitro, показавшие, что средняя яркость
коллагеновых волокон на гистологических препаратах слизистых оболочек, оцененная методом поляризационной микроскопии, хорошо коррелирует с ОКТ-сигналом на КП ОКТ изображениях в ортогональной поляризации (r=0.72, p=0.0001).
Впервые проведена автоматическая количественная оценка состояния коллагеновых волокон стромы слизистых оболочек при патологических процессах с помощью прижизненного метода кросс-поляризационной ОКТ. Для этой цели разработан критерий – интегральный фактор деполяризации (ИФД), представляющий отношение информативных сигналов когерентной деполяризации излучения и обратного когерентного рассеяния от биоткани, показавший высокую чувствительность к изменению состояния коллагеновых волокон.
Впервые продемонстрирована высокая диагностическая точность ИФД для прижизненного разграничения патологических процессов. Показано, что диагностическая точность ИФД выше по сравнению с такими показателями как относительная яркость ОКТ-сигнала (ЯР), относительное среднеквадратичное отклонение яркости ОКТ-сигнала (СКО).
Практическая значимость работы. Результаты работы могут найти широкое практическое применение для решения целого ряда клинических задач с использованием метода КП ОКТ и независимой оценкой изображений, а именно, использование количественной оценки КП ОКТ изображений для оперативной диагностики заболеваний, для наблюдения за состоянием коллагеновых волокон тканей при развитии патологии; мониторинге естественных и индуцированных лечением регенеративных процессов, в оценке степени фиброза, а также для изучения структуры коллагеновых матриц при создании скаффолдов, гелей, имплантатов, изучении их биосовместимости и биодеградируемости; при конструировании биоактивных инженерных каркасов, обладающих поляризационными свойствами. Основные выводы и результаты работы могут быть использованы в учебном процессе при разработке соответствующих спецкурсов.
Научная новизна и практическая значимость исследования подтверждены патентами и заявкой на патент:
1. Способ прогнозирования степени тяжести реакции слизистой оболочки полости рта и глотки в процессе лучевой или химиолучевой терапии злокачественных новообразований орофарингеальной области. Патент РФ № 2320271. (приоритет от
27.06.2006, опубл. 27.03.2008, бюл. № 9). Масленникова А.В., Балалаева И.В., Гладкова Н.Д., Высельцева Ю.В., Фомина Ю.В., Терентьева А.Б., Баландина (Киселева) Е.Б., Лазарева Е.А., Ермолаева А.М.
2. Способ диагностики побочных эффектов лучевой терапии со стороны мочевого
пузыря. Патент РФ № 2393768, (приоритет от 26.11.2008, опубл. 10.07.2010, бюл. №
19). Стрельцова О.С., Тарарова Е.А., Масленникова А.В., Загайнова Е.В., Гладкова
Н.Д., Карабут М.М., Киселева Е.Б., Крупин В.Н.
-
Способ диагностики патологии шейки матки. Патент РФ № 2463958, (приоритет от 13.05.2011, опубл. 20.10.2012, бюл. № 29). Кузнецова И.А., Шахова Н.М., Качалина Т.С., Гладкова Н.Д., Киселева Е.Б., Карабут М.М.
-
Способ оценки функционального состояния коллагенсодержащей ткани. Заявка на изобретение № 2013135571, приоритет от 29.07.2013. Киселева Е.Б., Гладкова Н.Д., Сергеева Е.А., Кириллин М.Ю., Губарькова Е.В., Карабут М.М., Балалаева И.В., Стрельцова О.С., Робакидзе Н.С., Масленникова А.В, Кочуева М.В.
Состояние избыточного накопления коллагеновых волокон при патологических процессах
С оптической точки зрения соединительные ткани являются неоднородными поглощающими средами с ярко выраженными рассеивающими свойствами. В общем случае, рассеяние излучения в биотканях обусловлено пространственным распределением показателя преломления и зависит от особенностей строения биоткани. Такие параметры, как размер частиц, их форма, плотность упаковки, свойства окружающего рассеивающую частицу базового вещества, играют важную роль в распространении света в биотканях и тем или иным способом отражаются на характеристиках рассеянного биотканью излучения, в том числе, если это излучение изначально поляризовано [41].
Использование поляризованного излучения для визуализации соединительных тканей, главным структурным компонентом внеклеточного матрикса которых является фибриллярный коллаген, позволяет не только улучшить качество оптических изображений, что важно при диагностических исследованиях, но и исследовать физические свойства компонентов биотканей (например, коллагеновых волокон) [49, 59, 129, 153]. Такие знания, в свою очередь, позволяют судить о структурном и функциональном состоянии органа, что также представляет несомненный интерес в клинике.
Оптическая анизотропия коллагеновых волокон (КВ) обусловливает возможность их визуализации не только методами ex vivo, например, методом поляризационной микроскопии, но и in vivo – поляризационными вариантами оптической когерентной томографии (ОКТ). Поскольку работа посвящена исследованию и оценке состояния КВ по их поляризационным свойствам, обзор литературы начинается с рассмотрения структуры коллагенового волокна, формируемой коллагеновыми волокнами архитектоники в изучаемых тканях. Будет рассмотрено также изменение состояния КВ при патологических процессах, что необходимо для выявления ключевых параметров, оказывающих влияние на формирование изображений с использованием поляризованного зондирующего излучения.
Состояние коллагеновых волокон в соединительных тканях в норме Под состоянием коллагеновых волокон (КВ) в данной работе понимается их определенная пространственная и структурная организация в ткани, которую можно описать морфологически как совокупность следующих параметров: целостность КВ, плотность их расположения, ориентация и толщина. Эти параметры, в свою очередь, определяются как составом самого КВ, так и функцией ткани (испытываемой нагрузкой), задающей определенную архитектонику коллагенового остова [30, 66, 113, 151].
Коллагеновое волокно (КВ) – четвертый, волоконный уровень организации белка коллагена, который, за счет разнообразия первичной структуры и комбинаций разных типов коллагена, определяет внутреннюю структуру волокна [1]. Общие схемы образования коллагенового волокна представлены на рисунке 1.
Выделяют 5 уровней организации коллагена [1, 30], в основе которых лежат последовательные этапы его синтеза и созревания: Молекулярный: 3 полипептидных левых -спирали, закономерно свёрнутые путем самосборки в тройную правую спираль со строго определенной конформацией. Основа полипептидной цепи коллагена -повторяющийся блок: Gly-X-Y, где Gly – это глицин, а X и Y – это различные аминокислоты, но чаще всего пролин (Pro) и гидроксипролин (Hyp). Наличие в каждом третьем положении маленькой аминокислоты глицина позволяет цепям сблизиться и плотно прилегать друг к другу. Диаметр молекулы коллагена 1,5 нм, длина 300 нм (рис. 1).
а б Реакции гидроксилирования пролина и лизина способствуют стабилизации цепей в молекуле тропоколлагена за счет образования водородных связей между ними (рис. 2). Введение ОН-группы в радикалы пролина и лизина катализируют соответствующие гидроксилазы, которые содержат в активном центре железо в виде Fe2+. В реакции участвуют О2 и -кетоглутарат, для поддержания железа в восстановленной форме необходимо присутствие витамина С. 2. Надмолекулярный: микрофибрилла, в которой молекулы тропоколлагена расположены параллельно, но, в силу электростатических и гидрофобно-гидрофильных взаимодействий между боковыми группами аминокислотных остатков с продольным сдвигом по отношению друг к другу на 63-67 нм (так называемый D-период, равный ,44 длины макромолекулы). Между концом одной молекулы и началом другой образуется зазор в 40 нм, остальная часть дает зону перекрывания (рис. 1б). Диаметр 5 нм.
3. Фибриллярный: фибрилла, образующаяся при спонтанной агрегации микрофибрилл в латеральном и аксиальном направлении. Диаметр 20-100 нм. Стабилизация фибрилл обеспечивается поперечными связями между остатками лизина и аллизина - продукта окисления лизина в молекулах тропоколлагена. Модификацию радикалов лизина катализирует медьсодержащий фермент лизилоксидаза, который находится в межклеточном матриксе (рис. 3).
Генерация второй оптической гармоники как метод оценки коллагеновых волокон
Мы будем рассматривать два эффекта изменения поляризации света в биотканях: явления двулучепреломления и случайной деполяризации. Для КВ наиболее изучено и подробно описано в литературе свойство двулучепреломления [15, 60, 79, 75, 76, 86, 105, 164]. Работы, посвященные изучению деполяризации излучения (изменения исходного состояния поляризации) КВ единичны [133, 179].
Двулучепреломление - разделение световой волны в веществе (со свойствами кристалла) на две ортогонально поляризованных компоненты (обыкновенный и необыкновенный), распространяющимися с разными скоростями [27, 36, 38]. Величина двулучепреломления (разница скоростей поляризационных компонент) является характеристикой вещества и может быть определена по измеренной на выходе из вещества оптической разности хода между обыкновенным и необыкновенным лучами. Двулучепреломление присуще таким высокоорганизованным структурам как: коллаген, кристаллы холестерина, комплексы актина и миозина, волокна миелина и гидроксиапатит кальция (содержится в эмали и дентине зубов).
Двулучепреломление тканей обусловлено главным образом линейной анизотропией волокнистых структур, характерных для соединительных тканей. Для таких структур усредненный показатель преломления при ориентации электрического поля волны вдоль направления волокон больше, чем поперек волокон, а моделью является набор параллельных цилиндров, образующих двулучепреломляющую среду с оптической осью, параллельной оси цилиндров. Это так называемое двулучепреломление формы [42].
Для упорядоченных линейных структур (коллагеновых фибрилл в волокне или самих волокон коллагена в высокоупорядоченных соединительных тканях) рост фазовой задержки можно характеризовать разностью эффективных показателей преломления для света, поляризованного вдоль и поперек длинной оси линейной структуры (nое). Влияние двулучепреломления ткани на распространение линейно поляризованного света зависит от угла между направлением поляризации падающего света и оптической осью вещества ткани. Фазовая задержка oe между ортогонально поляризованными компонентами пропорциональна расстоянию d, пройденному в двулучепреломляющей среде [78]:
Среда из параллельных цилиндров является положительной одноосной двулучепреломляющей средой (nое = (ne - no) 0) с оптической осью, параллельной осям цилиндров. Поэтому луч, у которого электрический вектор направлен параллельно осям цилиндров, будет называться «необыкновенным», а луч, у которого электрический вектор перпендикулярен осям цилиндров, — «обыкновенным». Разность (ne - no) между показателями преломления необыкновенной и обыкновенной волн является мерой двулучепреломления среды. В рэлеевском пределе, когда диаметр цилиндра , двулучепреломление формы определяется соотношением [107]: где f1 — объемная доля цилиндров; f2 — объемная доля базового вещества, а n1, n2 — соответствующие показатели преломления. При заданной разности показателей преломления максимальное двулучепреломление ожидается для примерно равных объемных долей тонких цилиндров и базового материала. Для систем с большими диаметрами цилиндров ( ) двулучепреломление стремится к нулю.
Двулучепреломление формы используется в микроскопии биообъектов как средство изучения структуры ткани [65, 203]. Известные из литературы значения двулучепреломления для сухожилий, мышечной ткани, коронарной артерии, миокарда, склеры, хряща и кожи имеют пое 10 3 [5, 35, 78, 79, 86, 105, 146]. Измеренные вариации показателя преломления для быстрой и медленной осей роговицы кролика показывают, что ее двулучепреломление меняется в пределах от 0 в вершинной точке роговицы до 5,5-10 4 в основании, где она присоединяется к склере [51]. Преобладающая ориентация КВ приводит к двулучепреломлению и дихроизму [117].
Поляризационно-чувствительная оптическая когерентная томография (ПЧ-ОКТ) позволяет измерять линейное двулучепреломление в рассеивающей ткани с высокой точностью. Были получены такие данные: пое=1,4-1(Г3 для мышечной ткани грызунов [78]; (4,2±0,3 1(Г3 для сухожилия поросенка в норме и (2,24±0,07 1(Г3 для термически обработанной ткани (90С, 20с), 1,5-10"3-3,5-10"3 для кожи свиньи и 3,0-10-3 для хряща быка [119]; и (3,7±0,4 10 3 для сухожилия быка [79].
Двулучепреломление связано со степенью организации, упорядоченностью КВ ткани (параллельность ориентации, плотность упаковки). Эти параметры КВ в коже и хряще не так однородны, как в сухожилии, поэтому распределение параметров двулучепреломления также варьирует [119].
Деполяризация - изменение состояния исходной поляризации распространяющегося в среде излучения в результате его взаимодействия со средой. В тканях, которые являются мутными средами, деполяризация наблюдается при рассеянии световой волны на локальных микромасштабных неоднородностях показателя преломления, что вызывает пространственно-нерегулярное изменение плоскости колебаний вектора напряженности электрического поля относительно исходной поляризации.
Одно из первых исследований степени деполяризации лазерного излучения при распространении в различных биотканях представлено в работе [191]. Измерялось отношение интенсивности компонентов прошедшего слой биоткани света, поляризованного параллельно плоскости поляризации падающего излучения (I) и перпендикулярно ей (I). Излучение считалось деполяризованным, когда I/I=2. В зависимости от толщины образца ткани и ее типа это отношение изменялось от 300 до 1. Длина пути света в ткани lp, на которой происходит деполяризация света (I/I=2), является характеристикой ткани. Оказалось, например, что значения lp сильно различаются для белого вещества мозга и ткани его корковой области и составляют 0,19 и 1,0 мм (476–514 нм) и 0,23 и 1,3 мм (633 нм) соответственно.
Эволюцию состояния поляризации в зависимости от глубины рассеяния анализируют при помощи формализма матриц Джонса [79, 75, 86] и Мюллера [74, 99, 110, 216]. Обстоятельный обзор Ghosh N. и Vitkin I. A. посвящен основным понятиям, связанным с поляризованным светом, формализму Стокса-Мюллера, методам измерения поляризации, моделированию распространения поляризованного света в мутных средах, приложению к визуализации тканей, обратному анализу результатов количественной поляриметрии, приложениям к количественной оценке ткани [99].
Морфологическая структура плотной соединительной ткани с точки зрения лазерной оптики может быть представлена в виде двухкомпонентно-аморфной и оптически анизотропной (коллагеновые волокна, мышечные пучки) матрицы, архитектоника которой описывается с помощью матрицы Мюллера [202, 201].
Известно [14], что структурные компоненты анизотропной составляющей биотканей подобны одноосным кристаллическим фрактальным доменам. Наиболее полно их оптические свойства можно описать матричным оператором вида [14, 50].
Кросс-поляризационный оптический когерентный томограф
Главным условием при проведении работы было точное совпадение зоны КП ОКТ сканирования и участка ткани, изучаемой методами микроскопии. Объектами КП ОКТ исследований являлись нормальные и патологически измененные слизистые оболочки (in vivo) и сухожилие (ex vivo), объектами микроскопического исследования были гистологические или криосрезы этих же участков тканей.
Объектами исследований для выявления зависимости ОКТ-сигнала в ортогональной поляризации от состояния КВ явились слизистые оболочки щеки и мочевого пузыря человека. После прижизненного эндоскопического КП ОКТ сканирования фрагменты слизистых оболочек забирались для проведения гистологических исследований. Нормальные ткани изучены на образцах post mortem. Данные о группах КП ОКТ изображений, сформированных после морфологической оценки, представлены в таблице 3.
Слизистая оболочка щеки. КП ОКТ сканирование выполнялось одновременно с визуальным осмотром и биопсией патологичных зон. В качестве группы контроля обследована слизистая оболочка щеки слева и справа у 10 здоровых добровольцев без заболеваний слизистой оболочки полости рта и воспалительных заболеваний кишечника (группа 1, норма). Для морфологического изучения данной группы брали образцы слизистой оболочки щеки человека post mortem в тех местах, где у группы здоровых волонтеров проводилось КП ОКТ сканирование. Патологические изменения слизистой оболочки щеки изучены у 33 пациентов в возрасте от 18 до 64 лет, включая 2-х пациентов с красным плоским лишаем (КПЛ) слизистой оболочки полости рта и 2-х пациентов с хроническим афтозным стоматитом (АС) (группа 2), 12 пациентов с язвенным колитом (ЯК) (группа 3) и 17 пациентов с Болезнью Крона (БК) (группа 4). Пациенты имели хроническое рецидивирующее течение и длительный анамнез заболеваний. Средняя длительность болезней во всех группах была сопоставимой (7±1,5 года). Клиническая манифестация заболеваний на слизистой оболочке полости рта в виде эрозий и язв на внутренней поверхности щек была выражена у больных КПЛ и АС, в то время как у больных БК и ЯК в момент исследования клинические признаки стоматита отсутствовали, хотя в анамнезе такие проявления имелись. Для верификации диагноза язвенного колита и болезни Крона врачами-гастроэнтерологами были проведены комплексные общеклинические, эндоскопические (в т.ч. илеоколоноскопия с осмотром терминального отдела подвздошной кишки и множественной биопсией), лабораторные и морфологические исследования.
Основанием для окончательного диагноза в каждой зоне интереса служили данные гистологического анализа с окраской препаратов гематоксилином и эозином (ГЭ) и пикросириусом красным (ПСК), с которыми соотносились данные КП ОКТ. Исследование криосрезов при микроскопии в режиме генерации второй гармоники (ГВГ) проводилось для дополнительной верификации данных КП ОКТ в зоне интереса.
Слизистая оболочка мочевого пузыря. В работу включены 73 пациента, в числе которых были 5 здоровых добровольцев (группа 1), 10 больных с острым первичным циститом или резким обострением хронического цистита (группа 2), 10 больных с хроническим циститом длительностью 5-15 лет в фазе ремиссии (группа 3), 18 больных с послеоперационным рубцом без признаков воспаления и без подозрения на рецидив рака на рубце (группа 4), 30 больных с первичным или рецидивирующим уротелиальным раком, у которых обнаружены локальные неэкзофитные («плоские») патологические очаги, в том числе на рубце (группы 5, 6, 7). Плоской подозрительной зоной считалась измененная зона слизистой мочевого пузыря со следующими локальными цистоскопическими признаками: воспаленная, подозрительная на новообразование, гиперемированная, рыхлая, изъязвленная слизистая, с папиллярным или полиповидным образованием (мелковорсинчатый рост), с похожей на булыжники поверхностью или с патологическим изменением в виде белой бляшки. Экзофитные образования не включены в статистическое исследование. Средний возраст пациентов составил 45,8±2,6 лет. Показанием к цистоскопическому, гистологическому и КП ОКТ исследованиям у всех больных было наблюдение по поводу хронических циститов и подозрение на рак мочевого пузыря.
Все области интереса подвергались комплексному изучению. Выполнялись одновременно: цистоскопия, КП ОКТ исследование и биопсия всех подозрительных зон. Основой для окончательного диагноза в каждой зоне интереса и контрольных зонах служили данные гистологического анализа с окраской препаратов ГЭ, с которыми в дальнейшем соотносились данные других оптических диагностик: КП ОКТ, поляризационной микроскопии с окраской ПСК и многофотонной микроскопии в режиме ГВГ. Проведенное морфологическое изучение гистологических срезов позволило сформировать группы микроскопических, а затем и соответствующих им КП ОКТ изображений, основываясь на состоянии КВ (оценено по окраске ПСК) и преобладающем патологическом процессе (оценено по окраске ГЭ) (табл. 3).
Изучение ОКТ-сигнала на ортогональных изображениях слизистых оболочек человека в норме
При распространении поляризованного света в такой среде на анизотропном коллагеновом волокне может произойти изменение исходной плоскости поляризации на 90, что регистрируется методом КП ОКТ как сигнал в ортогональной поляризации. Изображения слизистой оболочки щеки в ортогональной поляризации имеют высокий неоднородный ОКТ-сигнал (рис. 31а), что может быть объяснено морфологически: извилистые и скрученные коллагеновые волокна слизистой оболочки щеки образуют рыхлую сеть, сильно переплетаясь друг с другом (рис. 31б, г).
Изображения слизистой оболочки мочевого пузыря в ортогональной поляризации имеют высокий неоднородный «слоистый» ОКТ-сигнал (наблюдаются горизонтальные «слои») (рис. 32а). Мы считаем, что структура изображения связана с условиями прижизненного КП ОКТ исследования, которое проводится на сильно растянутом мочевом пузыре, а также гистологическими особенностями: организацией КВ в рыхлые слои, где волокна относительно друг друга располагаются под разными, но небольшими углами (рис. 32б, г).
Таким образом, на КП ОКТ изображениях нормальных слизистых оболочек ОКТ-сигнал в ортогональной поляризации отражает случайную деполяризацию зондирующего излучения КВ в состоянии нормы. Сигнал яркий, неоднородный, без какой-либо определенной структуры (щека, рис. 31а), либо имеет структуру тонких горизонтальных слоев (мочевой пузырь, рис. 32а). Сигнал отражает случайную деполяризацию зондирующего излучения коллагеновыми волокнами и регистрируется с помощью КП ОКТ при условии изменения исходной плоскости поляризации на 90 и сохранении когерентности излучения после обратного рассеяния.
3.1.3. Изменение ОКТ-сигнала на ортогональных изображениях слизистой оболочки десны после лазерной коагуляции коллагеновых волокон
Для демонстрации изменения (исчезновения) деполяризующих свойств КВ при изменении их нормального состояния (нарушении структурной организации) проведен следующий эксперимент. Мощным лазерным воздействием на слизистую оболочку десны кроликов вызывали коагуляцию тканей на глубину около 1,3 мм. Рабочая длина волны диодного лазера составляла 980 нм, мощность излучения до 20 Вт, длительность воздействия 150 мс. Деполяризующую способность КВ нормальной, а затем модифицированной локальным лазерным воздействием слизистой оболочки десны регистрировали прижизненно методом КП ОКТ с последующим изучением ткани ex vivo методами многофотонной, светлопольной и темнопольной поляризационной микроскопии.
КП ОКТ исследование слизистой оболочки неповрежденной десны in vivo: в ортогональной поляризации наблюдался равномерный сигнал средней интенсивности (рис. 34а, слева и справа от колонки), что свидетельствовало о структурной целостности КВ и наличии у них деполяризующих свойств.
При микроскопическом исследовании неповрежденной соединительнотканной стромы десны установлено: ГВГ-изображения и гистологические препараты, окрашенные ПСК и оцененные в поляризованном свете, демонстрируют наличие рыхло, хоатично, но равномерно расположенных КВ (рис. 34б, в, слева и справа от колонки).
Сравнивая участки неповрежденной и поврежденной стромы на КП ОКТ изображениях в ортогональной поляризации (рис. 34а, место колонки), установлено, что сигнал в месте лазерного воздействия снижен на 10,2 дБ (больше чем в 3 раза) (n=12), что доказывало высокую чувствительность КП ОКТ прибора к изменению состояния КВ. А-сканы, построенные с поврежденного и неповрежденного участков стромы ортогонального изображения, также наглядно подтверждают значительное снижение сигнала (рис. 34г).
После лазерного повреждения ткани десны в светлопольной микроскопии в месте воздействия (колонке) под разрушенным многослойным плоским эпителием наблюдалась коагуляция КВ, их разрежение и дезориентация на всю глубину колонки. На гистологических препаратах, окрашенных ПСК в поляризованном свете, в месте действия лазера не наблюдалось красного окрашивания коагулированных КВ, в то время как в соседних участках КВ имели ярко красный цвет и были расположены равномерно (рис. 34в).
Методом многофотонной микроскопии в режиме ГВГ в месте лазерного повреждения наблюдалось локальное исчезновение сигнала, причиной чего является нарушенная структура КВ (рис. 34б) по сравнению с их состоянием в норме (рис. 34б).
