Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии Вихлянцев, Иван Милентьевич

Введение к работе

До открытия тайтина мышечное сокращение рассматривалось с позиции взаимодействия двух типов нитей: толстых (миозиновых) и тонких (актиновых). Открытие тайтина (коннектина) (Wang et al., 1979; Maruyama et al., 1981) не только разрушило старые представления о двунитевой структуре саркомера, но и определило интерес многих исследователей к выяснению роли этого белка в поддержании структуры и функционировании саркомера и мышцы в целом. В настоящее время известно, что тайтин - гигантский эластичный белок в саркомерах поперечно-полосатых мышц позвоночных (Labeit, Kolmerer, 1995; Tskhovrebova, Trinick, 2010). Молекулярные массы известных изоформ тайтина (N2A, N2B и N2BA) составляют 3000000-3700000 Да (Freiburg et al., 2000; Guo et al., 2010). Молекулы тайтина, перекрывая расстояние от М-линии до Z-диска, формируют третью филаментную систему в миофибриллах и составляют по количеству ~15% от массы саркомерных белков (Tskhovrebova, Trinick, 2010). В А-зоне саркомера тайтин связан с миозиновыми нитями. В I-диске саркомера тайтин проходит свободно, соединяя концы миозиновых нитей с Z-мембраной (Granzier, Labeit, 2004). Исследования, проведенные за последние 20 лет, показали, что тайтин является одним из ключевых компонентов саркомера поперечно-полосатых мышц позвоночных, играющим важную роль в сборке толстых нитей, формировании высокоупорядоченной структуры саркомера, регуляции актин-миозинового взаимодействия и процессов внутриклеточной сигнализации (Granzier, Labeit, 2004; Lange et al., 2005; Linke, Kruger, 2010; LeWinter, Granzier, 2010; Gautel, 2011). Однако огромная молекулярная масса тайтина, а также способность этого белка легко деградировать во время препаративных процедур сильно затрудняют исследование его структурно-функциональных свойств, вследствие чего не все свойства тайтина в норме до конца изучены. Необходимо выяснение роли тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия и, в частности, вклада этого белка в Са²⁺-чувствительность развития силы. Остается нерешённым вопрос о связывании тайтина с актином в саркомере и функциональной значимости такого взаимодействия. Недостаточно широко исследован изоформный состав тайтина в мышцах животных и человека, и не открыты изоформы тайтина с м.м. более 3700 кДа, хотя ген тайтина может кодировать белок с м.м. 4200 кДа (38138 аминокислотных остатка) (Guo et al., 2010). Не совсем ясно, как на уровне половины саркомера функционируют изоформы тайтина, имеющие разную длину растяжимой I-области молекулы этого белка. Несомненно, что присутствие в саркомере разных изоформ тайтина имеет важное физиологическое значение для функционирования мышцы.

Не изучена роль тайтина в мышцах при изменении условий внешней среды, включая экстремальные, в частности, при зимней спячке и микрогравитации. Интерес, проявляемый к изучению зимней спячки (гибернации) млекопитающих, определяется, прежде всего, способностью зимоспящих животных адаптироваться к неблагоприятным условиям среды за счёт снижения активности всех физиологических систем организма, включая мышечную, при сохранении контроля за согласованностью их действия (L. Wang, 1987). Поскольку при гибернации животные длительное время пребывают в обездвиженном состоянии, после чего за несколько часов способны перейти к нормальной двигательной активности без патологических последствий, есть основания ожидать, что в мышцах зимоспящих происходят обратимые адаптационные изменения, которые могут вносить вклад в смену физиологического состояния животного. Проведённые исследования показали, что изменения структурно-функциональных свойств миозина и связанных с ним белков (С-белка, Х-белка) вносят вклад в адаптацию поперечно-полосатых мышц зимоспящих животных к условиям гибернации (Morano et al., 1992; Лукоянова и др., 1997; Вихлянцев и др., 2002; Rourke et al., 2004; Зуйкова и др., 2005; Малышев и др., 2006). Исследования роли тайтина в адаптации мышц к условиям зимней спячки не проводились. Не изучен вклад тайтина в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома», который наблюдается у человека и животных в условиях моделируемой или реальной невесомости. Этот синдром проявляется в развитии атрофии скелетных позно-тонических мышц, сопровождающейся уменьшением объёма мышечных волокон, деструктивными изменениями миофибриллярного аппарата, снижением тонуса, выносливости и общей работоспособности мышц (Григорьев и др., 2004). На фоне описанных изменений выявлено снижение содержания N2A- изоформы тайтина в m. soleus крысы после 14-суточного пребывания в условиях моделируемой микрогравитации (Toursel et al., 2002), что сопровождалось изменением эластичных свойств мышцы. Однако исследования возможных изменений сократительных свойств мышцы вследствие уменьшения содержания тайтина не проводились. Известны данные, свидетельствующие об атрофии сердечной мышцы человека и животных в условиях реальной или моделируемой микрогравитации (Baranska et al., 1990; Goldstein et al., 1992; Perhonen et al., 2001). Однако какие при этом происходят изменения качественного и количественного состава тайтина в сердечной мышце, и каково функциональное значение этих изменений, остаётся неясным. Следует обратить внимание на отличительную особенность атрофических изменений в мышцах при гибернации и микрогравитации. В отличие от негативных последствий атрофии мышц в условиях микрогравитации, приводящих к длительному нарушению сократительных свойств мышц, атрофические изменения в мышцах в период зимней спячки легко обратимы при пробуждении животного и не влекут за собой патологических последствий (Lee, at al., 2008). Однако причина подобных различий неясна.

Тайтин играет важную роль не только в физиологии, но и в патофизиологии мышц. Исследования последних лет показали, что патогенез ряда мышечных заболеваний сопровождается изменениями в изоформном составе, содержании тайтина и экспрессии гена этого белка (LeWinter, Granzier, 2010; Ottenheijm, Granzier, 2010). Однако имеющиеся литературные данные противоречивы. В частности, выявлены противоположные изменения в содержании N2BA- и №В-изоформ тайтина при развитии дилатационной кардиомиопатии (ДКМП) у человека (Makarenko et al., 2004; Nagueh et al., 2004) и собаки (Wu et al., 2002; Jaber et al., 2008). В гипертрофированном сердце спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) выявлено уменьшение содержания N2BA-изоформы тайтина (Warren et al., 2003), тогда как при развитии гипертрофической кардиомиопатии (ГКМП) у человека не обнаружено изменений в содержании и изоформном составе этого белка (Hoskins et al., 2010). В скелетных мышцах человека при развитии миодистрофий одними авторами обнаружено уменьшение содержания тайтина (Matsumura et al., 1990; Cullen et al., 1992), тогда как другими исследователями подобных изменений в содержании этого белка не зарегистрировано (Horowits et al., 1990). Противоречивость имеющихся литературных данных не позволяет сделать чётких заключений о роли разных изоформ тайтина в патогенезе исследуемых заболеваний. Несомненно, что для лучшего понимая роли тайтина при патологии необходимо более детальное исследование структурно- функциональных свойств этого белка в норме и при адаптации. Поэтому сравнительное исследование структурно-функциональных свойств тайтина в норме и их изменений при адаптационных и патологических процессах является актуальной фундаментальной задачей и имеет важное прикладное значение.

Цель работы: исследование структурно-функциональных свойств тайтина сердечной и скелетных мышц животных и человека в норме и их изменений при адаптационных и патологических процессах.

Задачи исследования:

1. Провести электрофоретическое исследование тайтина сердечной и скелетных мышц человека и животных для выявления новых высокомолекулярных изоформ этого белка;

2. Изучить in vitro молекулярные параметры и агрегационные свойства тайтина сердечной и скелетных мышц кролика и суслика, его связывание с актиновыми и миозиновыми нитями и влияние на ферментативные и регуляторные свойства миозина;

3. Исследовать сезонные изменения изоформного состава тайтина и степени его фосфорилирования в сердечной и скелетных мышцах зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus;

4. Изучить вклад изменений изоформного состава тайтина в развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» в условиях моделируемой или реальной микрогравитации;

5. Оценить эффективность разных подходов, направленных на предотвращение или уменьшение развития «гипогравитационного мышечного синдрома»;

6. Изучить изменения изоформного состава тайтина в миокарде спонтанно- гипертензивных крыс (SHR) при развитии гипертрофии, в миокарде человека с конечной стадией развития ДКМП и в спинной мышце человека с синдромом «ригидного человека».

Основные положения, выносимые на защиту:

1. В поперечно-полосатых мышцах человека и животных наряду с известными N2A-, N2BA- и N2B-изоформами тайтина электрофоретическими методами обнаружено присутствие более высокомолекулярных изоформ этого белка.

6. 1. Способность тайтина связываться in vitro с актиновыми нитями и его

   2+

   активирующий эффект на Са -чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина указывают на участие тайтина в регуляции актин- миозинового взаимодействия в мышцах.

   6. 2. Изменения в изоформном составе тайтина в сердечной и скелетных мышцах сусликов Spermophilus undulatus при зимней спячке направлены на сохранение содержания более высокомолекулярных изоформ тайтина при уменьшении (в —1.3-1.5 раза) содержания известных изоформ этого белка. Адаптационное значение сохранения более высокомолекулярных изоформ тайтина заключается в поддержании саркомерной структуры и необходимого уровня сократительной активности мышц сусликов в разные периоды гибернации.

      3. Развитие «гипогравитационного мышечного синдрома» и патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы дилатационная кардиомиопатия, синдром «ригидного человека») в поперечно-полосатых мышцах человека и крысы сопровождается уменьшением (в —1.5-2.5 раза) содержания известных N2A-, N2BA- и №В-изоформ тайтина, а также уменьшением (в —2-5 раз) содержания или полным разрушением более высокомолекулярных изоформ этого белка.

      Научная новизна работы

      Разработан метод ДСН-электрофореза в крупнопористом горизонтальном геле и модифицированы известные методы ДСН-электрофореза в вертикальных гелях для исследования полиморфизма гигантского белка тайтина. С помощью этих методов получены новые данные, показывающие, что в поперечно-полосатых мышцах млекопитающих наряду с известными N2A-, N2BA- и №В-изоформами тайтина присутствуют более высокомолекулярные изоформы этого белка. Проведено сравнительное исследование вклада изменений изоформного состава тайтина в изменения структурно-функциональных свойств в мышцах млекопитающих при адаптации к экстремальным условиям среды (гибернация, микрогравитация) и при развитии патологических процессов (гипертрофия сердечной мышцы, дилатационная кардиомиопатия, синдром «ригидного человека»). В поперечнополосатых мышцах зимоспящих сусликов Spermophilus undulatus в период гибернации обнаружено уменьшение содержания известных изоформ тайтина при сохранении содержания новых, более высокомолекулярных изоформ этого белка. Обнаруженные изменения в содержании тайтина не сопровождались нарушением структурно-функциональных свойств мышц гибернирующих животных. Сделано заключение об адаптационном значении сохранения в мышцах гибернирующих сусликов более высокомолекулярных изоформ тайтина для поддержания упорядоченной структуры миофибриллярного аппарата и необходимого уровня сократительной активности мышц при спячке и пробуждении, что способствует выходу животного из состояния гибернации без патологических последствий. В мышцах человека и животных при развитии патологических процессов и в m. soleus человека и крысы при развитии «гипогравитационного мышечного синдрома» наряду с уменьшением содержания известных изоформ тайтина обнаружено разрушение более высокомолекулярных изоформ этого белка, что сопровождалось нарушением структурно-функциональных свойств мышц. Сделано заключение о том, что главную роль в поддержании структурно-функциональных характеристик мышц играют открытые нами более высокомолекулярные изоформы тайтина, а не N2A-, N2BA- и N2B-изоформы этого белка.

      Получены другие важные фундаментальные результаты, расширяющие наши представления о роли тайтина в мышцах. Обнаружена способность тайтина поперечно-полосатых мышц связываться in vitro с актиновыми нитями, а также активирующий эффект тайтина на Са²⁺-чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина. Полученные результаты указывают на участие тайтина в регуляции актин-миозинового взаимодействия в мышцах. Обнаружено увеличение степени фосфорилирования тайтина, выделенного из

      скелетных мышц спящих сусликов, что приводит к снижению активирующего

      2+

      влияния этого белка на актин-активируемую АТФазную активность и Са - чувствительность миозина in vitro. Сделано предположение о вкладе фосфорилирования тайтина в ингибирование сократительной активности скелетных мышц сусликов в период гибернации. Эти данные также свидетельствуют о важной роли тайтина в регуляции мышечного сокращения. В предсердиях и желудочках сердца сусликов в период осенней подготовки животных к спячке, а также на протяжении всего гибернационного сезона выявлено двукратное увеличение доли длинных (более эластичных) изоформ тайтина. Адаптационное значение выявленных изменений заключается в повышении эластичности сердечной мышцы сусликов с целью усиления сократительного ответа миокарда для выброса более густой крови из камер сердца в период спячки и при пробуждении животного. Выявлено снижение (в ~5 раз) экспрессии гена тайтина в миокарде зимоспящих сусликов на всех фазах гибернационного цикла (спячка, пробуждение, межбаутная активность, вход в спячку), что можно рассматривать как адаптацию, направленную на минимизацию энергетических затрат в период гибернации. При развитии гипертрофии сердечной мышцы у спонтанно-гипертензивных крыс (SHR) обнаружено увеличение экспрессии гена тайтина в миокарде 15-недельных крыс и снижение экспрессии гена этого белка в миокарде 26-недельных крыс. Полученные результаты расширяют наши представления о молекулярных механизмах развития патологических изменений в гипертрофированной сердечной мышце.

      Научная и практическая значимость работы

      Полученные данные вносят вклад в формирование современных представлений о структурно-функциональных свойствах тайтина в мышце в норме, при адаптации и патологии. Разработанные электрофоретические методы, позволяющие выявлять более высокомолекулярные интактные изоформы тайтина, открывают новые возможности для дальнейших исследований вклада этих форм тайтина в функционирование мышцы в норме и при развитии адаптационных и патологических процессов. Изучение адаптационных изменений изоформного состава тайтина в мышцах зимоспящих сусликов помогло понять причины нарушений структурно- функциональных свойств в мышцах человека и животных при развитии патологических процессов. Полученные результаты имеют большое практическое значение, поскольку тестирование изменений качественного и количественного состава тайтина в мышцах может быть использовано в медицинской практике с целью диагностики развития патологических процессов и оценки эффективности подходов к их коррекции. Результаты исследований по связыванию тайтина с актином и влиянию тайтина на Са²+- чувствительность актин-активируемой АТФазы миозина важны для лучшего понимания механизма актин-миозинового взаимодействия в мышце в норме и могут быть полезны для выяснения причин нарушения сократительных свойств мышцы при развитии патологии. Данные об изменении экспрессии гена тайтина в миокарде спонтанно-гипертензивных крыс линии SHR могут быть использованы в диагностике развития гипертрофии сердечной мышцы. Результаты работы используются при чтении курса лекций по биофизике и биохимии мышечного сокращения и биологической подвижности студентам и слушателям на биологических факультетах МГУ и ПущГУ.

      Апробация работы

      Результаты исследований и основные положения работы были представлены и обсуждены на многих российских и международных конференциях, в частности, на: 29-ой, 31-37-ой Европейских мышечных конференциях (Berlin, Germany, 2000; Lunteren, Netherlands, 2002; Montpellier, France, 2003; Isola d'Elba, Italy, 2004; Hostobagy, Hungary, 2005; Heidelberg, Germany, 2006; Stockholm, Sweden, 2007; Keble College, Oxford, England, 2008); Международных симпозиумах "Biological motility" (Пущино, 2001, 2004; 2006; 2008; 2010); Международных симпозиумах по термофизиологии (Минск, Беларусь, 2000, 2002); Всероссийских конференциях с международным участием «Гипоксия: механизмы, адаптация, коррекция» (Москва, 2002, 2008); Всероссийских школах-конференциях по физиологии мышц и мышечной деятельности (Москва, 2003, 2005, 2010); 24-27-ом Международных гравитационных физиологических съездах (Santa-Monica, USA, 2003, Moscow, Russia, 2004, Cologne, Germany, 2005; Angers, France, 2008); Конференциях молодых ученых, посвященных дню космонавтики (Москва, 2004, 2005, 2008); Пущинских конференциях молодых ученых «Биология - наука 21-го века» (Пущино, 2001-2006, 2009, 2010); Международной конференции «Стресс и висцеральные системы» (Минск, Беларусь, 2005); XII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов - 2005» (Москва, 2005); I и II Съездах физиологов СНГ (Сочи, 2005; Кишинев, Молдова, 2008); 15-ой Международной конференции "Human in Space" (Graz, Austria, 2005); 15-ом Международном биофизическом конгрессе (Montpellier, France, 2005); Международной конференции «Медико-биологические аспекты действия физических факторов» (Минск, Беларусь, 2006); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2007); Международном Междисциплинарном симпозиуме «От Экспериментальной Биологии к Превентивной и Интегративной Медицине (EXB+PIM'07) (Судак, Украина, 2007); Joint British-Russian young scientists workshop "Muscles: structure, function and regulation" (Yekaterinburg, Russia, 2007); 4-ом и 5-ом Международном Междисциплинарном конгрессе «Нейронаука для медицины и психологии» (Судак, Украина, 2008, 2009); 7-ом Европейском биофизическом конгрессе (Genova, Italy, 2009); 30-ом и 34-ом FEBS конгрессах (Budapest, Hungary, 2005; Prague, Czech Republic, 2009); Конференции молодых научных сотрудников ИТЭБ РАН «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2009); Международной научно-практической конференции «Человек и животные» (Астрахань, 2010); XVIII, XX, XXI Съездах физиологов России (Казань, 2001; Москва, 2007; Калуга, 2010).

      Публикации. По материалам диссертации опубликовано 92 печатных работы, в том числе 29 статей в рецензируемых отечественных и зарубежных изданиях.

      Структура и объем диссертации

      Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 235 страницах, содержит 42 рисунка и 28 таблиц. Список цитируемой литературы включает 449 источников.

      Похожие диссертации на Полиморфизм тайтина поперечно-полосатых мышц в норме, при адаптации и патологии

      

      Влияние дозированной физической нагрузки на процессы адаптации и дизадаптации сердечно-сосудистой системы у детей в норме и при патологииГорбунова Инна Анатольевна

      Функциональный резерв сердечно-сосудистой системы при адаптации и патологии человека на Крайнем Севере и в АнтарктидеДавиденко, Владимир Иванович

      

      Эколого-морфологические особенности патологии и адаптации органов и тканей рыб при воздействии токсикантов Крючков Виктор Николаевич

      

      Системные механизмы адаптации при патологии внутренних органов, сочетающейся с дисбалансом микроэлементовВоробьева Ольга Владимировна

      Методы адаптации систем диагностики патологии по ЭКГ-сигналам на основе алгоритмов распознаванияНгуен Тхань Тунг

      Физиологические механизмы психологической адаптации при психосоматической патологииКосенков, Николай Иванович

      

      Особенности самоотношения женщин, родивших здоровых детей или детей с патологией, в период послеродовой адаптацииГерманова Елена Валерьевна

      

      Особенности гастродуоденальной патологии и течения периода адаптации у детей к условиям дошкольного учрежденияАвдеева Наталья Васильевна

      

      Роль особенностей периода ранней адаптации новорожденных от матерей с патологией органов мочевой системы в заболеваемости и смертности детейАминов Хусейн Джумаевич

      

      Клинические и гемостазиологические особенности адаптации новорожденных у матерей с кардиоваскулярной патологиейАнастасевич Людмила Александровна