Введение к работе
Актуальность темы. Исследование молекулярного механизма мышечного сокращения является одной из классических и, по-прежнему, актуальных проблем биофизики. Мышца - уникальный орган, преобразующий химическую энергию гидролиза АТФ в механическую работу с недостижимым в искусственных двигателях КПД. Актин-миозиновый молекулярный мотор приводит в движение не только поперечно-полосатые и гладкие мышцы, но и обеспечивает многие другие виды клеточной подвижности. Высокоупорядоченная организация миозиновых моторов в скелетной мышце делает её чрезвычайно удобным объектом для изучения свойств этого мотора.
Современные представления о механизме мышечного сокращения были заложены в 50-60-е годы и в настоящее время уже не подвергаются сомнениям. Согласно теории скользящих нитей и мостиковой теории (Н.Е. Huxley, Hanson, 1954; A.F. Huxley, Niedergerke, 1954; A.F. Huxley, 1957; H.E. Huxley, 1969; A.F. Huxley, Simmons, 1971), в основе этого процесса лежит циклическое взаимодействие глобулярных фрагментов миозиновых молекул, или S1, или "поперечных мостиков", выступающих из толстых нитей, с мономерами актина, составляющими основу тонких нитей. Несмотря на значительный прогресс, достигнутый в последние годы, в частности, определение атомных структур мономера актина, актиновой нити и миозиновой головки (Holmes и др., 1990, 2004; Rayment и др., 1993; Houdusse и др., 1999, 2000, Oda и др., 2009), многие важные детали механизма работы этого молекулярного мотора остаются неизвестными. По-прежнему нет полной ясности в том, с какими именно конформационными изменениями в актин-миозиновом комплексе связано развитие силы или укорочения мышечных клеток и каким образом химическая энергия гидролиза АТФ преобразуется в механическую работу. Даже фундаментальные вопросы о том, какая доля миозиновых мостиков участвует в развитии активного силы в каждый момент времени и на какое расстояние миозиновая головка может переместить актиновую нить в результате гидролиза одной молекулы АТФ, являются предметом дискуссий (Kishino, Yanagida, 1988; Finer и др., 1994; Molloy и др., 1995; Simmons и др., 1996; A.F. Huxley, 2000; Kraft и др., 2002; Linari и др., 2007).
Трудности изучения актин-миозинового мотора в значительной степени связаны с тем, что современные методы биохимии, структурной и молекулярной биологии имеют дело с изолированными белковыми молекулами, не способными развивать активных усилий и совершать механическую работу. Поэтому особое значение приобретают структурные исследования миозиновых моторов в таких условиях, в которых их механическая функция сохраняется. Одним из методов таких исследований
является рентгеновская дифракция, с помощью которой можно изучать структуру изолированных мышечных клеток как интактных, так и с частично разрушенной мембраной. Развитие современных источников синхротронного излучения и быстродействующих двумерных детекторов рентгеновских фотонов высокого пространственного разрешения позволило существенно расширить возможности этого метода.
Интерпретация экспериментальных рентгенограмм затрудняется тем, что в двумерной дифракционной картине мышцы не содержится информации о фазе рассеянных рентгеновских лучей, что не позволяет непосредственно определить электронную плотность исследуемых объектов. Распространённый подход к решению таких задач состоит в разработке упрощённых моделей, описывающих лишь один или несколько рефлексов (например, Irving и др., 1992, 2000; Malinchik, Yu, 1995). Сколько-нибудь общих моделей, количественно описывающих всю двумерную картину рентгеновской дифракции сокращающейся мышцы, включая интерференционное расщепление миозиновых меридиональных рефлексов, в настоящее время нет. Представляется актуальным создание и содержательный параметрический анализ таких моделей, а также разработка на их основе новых методов количественного анализа рентгенограмм.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в исследовании структурных изменений в актин-миозиновом моторе, сопровождающих работу скелетной мышцы, с помощью малоугловой рентгеновской дифракции.
При этом были поставлены следующие задачи:
получить осевые рентгенограммы мышечных волокон лягушки и кролика и оценить по данным интерференционного расщепления миозиновых рефлексов осевое перемещение присоединённой миозиновой головки в ответ на увеличение температуры и растяжение волокон во время активного сокращения и в ригоре;
исследовать вклад регуляторных белков тонких нитей в двумерную дифракционную картину мышцы в различных физиологических состояниях;
построить математическую модель рентгенодифракционной картины скелетной мышцы в состоянии ригора и в ходе активного сокращения;
на основе сопоставления экспериментальных данных и результатов моделирования определить долю и конфигурацию миозиновых моторов, присоединённых к актину и участвующих в поддержании активного напряжения в мышце.
Положения, выносимые на защиту
1. Получены дифракционные рентгенограммы волокон скелетных мышц в
различных физиологических состояниях. Предложена модель для
количественного анализа структурных изменений в актин-миозиновом
моторе во время мышечного сокращения по данным рентгено-
дифракционных экспериментов. В результате анализа рентгенограмм
определены фундаментальные характеристики молекулярного мотора мышц:
доля миозиновых головок, присоединённых к актиновым нитям во время активного изометрического сокращения, составляет 40%;
сила, развиваемая одной миозиновой головкой, составляет около 6 пН.
-
Разработан метод измерения осевых перемещений миозиновых головок в мышце, основанный на анализе интерференционной структуры миозиновых рефлексов на рентгенограмме волокон скелетных мышц и проведены эксперименты по исследованию изменений тонкой структуры этих рефлексов в ответ на различные воздействия. Получены оценки изменения осевого положения центра масс миозиновых головок при растяжении волокон в состоянии ригора.
-
Показано, что предложенная нами новая структурно-кинетическая модель актин-миозинового взаимодействия в мышцах, в которой различным стадиям цикла гидролиза АТФ поставлены в соответствие структурные состояния S1 и его комплексов с актином, хорошо описывает изменения интенсивности основных рентгеновских рефлексов в изометрически сокращающихся мышечных волокнах.
Научная новизна
Впервые получены осевые рентгенограммы одиночной мышечной клетки высокого пространственного разрешения, из которых методом рентгеновской интерферометрии получены количественные оценки осевых перемещений присоединённой к актину миозиновой головки в активном сокращении и в ригоре с точностью до 0,1-0,2 нм.
Впервые построена математическая модель интерференционного расщепления миозинового меридионального рентгеновского рефлекса МЗ в активном сокращении и в состоянии ригора.
Впервые систематически исследован вклад регуляторных белков тонких нитей в двумерную дифракционную картину мышцы в различных физиологических состояниях.
Впервые построены математические модели всей двумерной рентгенодифракционной картины скелетной мышцы в состоянии ригора и в активном сокращении.
Впервые получены количественные оценки числа стереоспецифически присоединённых к актину миозиновых головок в активном сокращении
по данным измерения внемеридиональной интенсивности актиновых слоевых линий и прямого моделирования.
Научная и практическая ценность. Работа посвящена изучению природы фундаментального явления - молекулярного механизма актин-миозинового взаимодействия, который лежит в основе не только сокращения мышц, но и многих других видов биологической подвижности. В результате проведённых исследований выяснены некоторые важные детали работы этого механизма и разработаны новые экспериментальные и теоретические методы, которые могут быть применены и в прикладных исследованиях сокращения скелетных и сердечных мышц. К ним относятся использованные в работе экспериментальные подходы, позволяющие одновременно исследовать механическое поведение мышечных клеток и получать их высококачественные дифракционные рентгенограммы с минимальным потерями из-за рассеяния фотонов окружающим раствором. Разработанные в работе математические модели могут быть использованы для рентгенодифракционных исследований особенностей работы актин-миозинового мотора в скелетных и сердечной мышцах в норме и при патологиях.
Публикации. По теме диссертации автором опубликованы 73 печатных работы, в том числе 19 статей, из них 18 в журналах, входящих в Перечень периодических изданий, рекомендованных ВАК Минобразования и науки, и 54 тезиса докладов в материалах съездов, конгрессов, симпозиумов, Всероссийских, международных и региональных конференций.
Апробация работы. Основные результаты были доложены на Всероссийских рабочих совещаниях по биомеханике (Москва - Санкт-Петербург, 1999-2011); на II, III и IV Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые методы исследования" (Пущино, 2001, 2004, 2007, 2010); V, VI, VIII, IX, X Всеросийской конференциях по биомеханике (Нижний Новгород, 2000, 2002, 2006, 2008; Саратов, 2010), XX и XXI съездах физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007; Калуга, 2010), на XXIV, XXVIII, XXX, XXXII и XXXIII Европейских мышечных конференциях (Флоренция, Италия, 1995; Йорк, Великобритания, 1999; Павия, Италия, 2001; Монпелье, Франция, 2003; о. Эльба, Италия, 2004); на Международных рабочих совещаниях по мышечному сокращению и биологической подвижности (Альпбах, Австрия, 2001, 2004, 2007, 2010); VI Международной конференции по проблемам динамики взаимодействия деформируемых сред (Горис, Армения, 2008), Всемирных конгрессах по биомеханике (Мюнхен, 2006; Сингапур, 2010), а также на других научных конференциях и семинарах.
Структура диссертации. Диссерация изложена на 256 страницах, включая 67 рисунков и 7 таблиц. Диссертация состоит из 8 глав, первая из которых представляет собой обзор литературы. Список цитируемых источников содержит 284 наименования.
