Введение к работе
Актуальность проблемы. Родопсин (зрительный пигмент) - типичный представитель большого семейства трансмембранных рецепторов, сопряженных с G-белком (GPCR). Отличительная особенность родопсина как GPCR состоит в том, что его лигандом является хромофорная группа (остаток ретиналя), расположенная внутри молекулы родопсина и ковалентно связанная с белковой частью (апобелком опсином).
Хромофор как лиганд осуществляет в родопсине две физиологические функции. В темновом состоянии зрительного пигмента остаток 11-г/иоретиналя играет роль лиганда-антагониста, который «держит» рецептор в неактивном состоянии и, таким образом, препятствует ложному запуску процесса трансдукции. После поглощения кванта света и изомеризации хромофор превращается в мощный лиганд-агонист, переводящий родопсин в физиологически активированное состояние. Естественно, важнейшей физиологической функцией хромофора в молекуле родопсина является запуск процесса фототрансдукции. Запуск осуществляется фотохимической реакцией изомеризации остатка 11-г/ис-ретиналя в пояностью-транс форму.
Функции хромофора обусловлены его высокоспецифичным взаимодействием с белковым окружением. Нарушение этого взаимодействия может приводить к серьезным патологическим последствиям. Особенности взаимодействия остатка 11-г/иоретиналя как лиганда-антагониста с окружающими его аминокислотными остатками до конца не выяснены и остаются предметом исследования. Открытым остается вопрос о механизме проявления хромофором, «сидящим» в тесной белковой матрице, его уникальных фотохимических свойств, а именно скорости (менее чем 200 фемтосекунд) и квантового выхода (0.65) реакции фотоизомеризации (свободный 11-г/ис-ретиналь в растворе изомеризуется за время порядка 10 пикосекунд с квантовым выходом менее 0.2).
На последней стадии фотолиза родопсина (у позвоночных) происходит разрыв ковалентной связи опсина с полностью-тйі/аднс-ретиналем. В норме «отработанный» хромофор высвобождается из белковой части молекулы, восстанавливается до ретинола и быстро удаляется из фоторецепторной мембраны. При некоторых патологиях или при интенсивном действии света механизм удаления полностью-^ранс-ретиналя из фоторецепторной мембраны нарушается. В такой ситуации ретиналь легко взаимодействует с аминогруппами фосфолипидов (фосфатидилэтаноламина) и белка с образованием т.н. бис-ретиноидов, которые в дальнейшем аккумулируются в липофусциновых гранулах клеток ретинального пигментного эпителия. Образовавшиеся продукты, как и сам полностью-тйі/аднс-ретиналь, фотоактивны
и, как фотосенсибилизаторы они способны инициировать в клетке фотоокислительные деструктивные процессы. Кроме этого производные полностью-^/адноретиналя являются флуорофорами. Флуоресцентные свойства этих продуктов стали основой для создания нового неинвазивного метода диагностики дегенеративных заболеваний сетчатки и ретинального пигментного эпителия - метода аутофлуоресценции глазного дна. Одной из нерешенных проблем развития и усовершенствования этого перспективного метода диагностики является отсутствие статистически полной картины о составе флуорофоров липофусциновых гранул, динамике их накопления, фотоокисления и фото деградации в зависимости от возраста и патологии.
Таким образом, исследование механизмов фотохимической реакции изомеризации остатка ретиналя из \\-цис в пояностью-транс-фотрму; изучение особенностей взаимодействия остатка 11-г/иоретиналя с окружающими его аминокислотными остатками в хромофорном центре темнового родопсина; исследование флуоресцентных свойств побочных продуктов фотолиза родопсина (производных полностью-тйі/мнс-ретиналя) в зрительной клетке и клетке ретинального пигментного эпителия - актуальные задачи биофизики зрительной рецепции.
Цель и задачи работы. Целью настоящего исследования явилось выяснение молекулярных механизмов, обеспечивающих функции хромофора зрительного пигмента родопсина в норме и при патологии.
В работе были поставлены следующие задачи:
-
Исследовать прямую и обратную реакции фотоизомеризации хромофора в родопсине (методы фемтосекундной лазерной спектроскопии и низкотемпературной спектрофотометрии).
-
Изучить особенности пространственной конфигурации остатка \\-цис-ретиналя и его взаимодействия с ближайшим белковым окружением в хромофорном центре родопсина в его темновом состоянии (метод молекулярного моделирования).
-
Определить спектральные свойства флуорофоров - продуктов превращения полностью-»2/?йгноретиналя (бис-ретиноидов), образовавшихся в результате нарушения зрительного (ретиноидного) цикла в фоторецепторных клетках и клетках ретинального пигментного эпителия. На этой основе предложить пути усовершенствования метода аутофлуоресценции глазного дна - современного неинвазивного метода диагностики старческих и дегенеративных заболеваний сетчатки глаза и ретинального пигментного эпителия.
Научная новизна работы. Методами фемтосекундной лазерной спектроскопии при комнатной температуре и спектрофотометрии при низких температурах подробно исследована динамика фотопревращения молекулы
родопсина. Впервые продемонстрирована сверхбыстрая обратная фотореакция родопсина в фемтосекундном диапазоне времени: его переход из темнового состояния (остаток ретиналя в 11 -г/иоизомерной форме) в первый фотоиндуцированный промежуточный продукт - фотородопсин (остаток ретиналя в транс-изомещой форме), и затем фотоиндуцированный переход обратно из фотородопсина в родопсин.
Методом молекулярной динамики описано хромофор-белковое взаимодействие в молекуле родопсина в его темновом состоянии, позволяющее представить механизм функционирования 11-г/иоретиналя как лиганда-антагониста. При этом применен новый подход - сравнительный анализ структуры родопсина в его темновом состоянии, апобелка опсина (без остатка 11-г/иоретиналя) и модели мутантной формы родопсина Е181К.
Впервые на модельных системах in vitro и in situ детально описаны флуоресцентные свойства конечных продуктов превращения пояностью-транс-ретиналя - неокисленных и фотоокисленных бис-ретиноидов (флуорофоров), образовавшихся в результате нарушения ретиноидного цикла, и проведена оценка возможного вклада этих флуорофоров и/или групп флуорофров в суммарный спектр аутофлуоресценции глазного дна. Подробное описание флуоресцентных свойств бис-ретиноидов (флуорофоров) - продуктов превращения полностью-тй/адноретиналя, является основой для разработки нового дифференциального подхода в диагностике патологических процессов в сетчатке и ретинальном пигментном эпителии - компонентного спектрального анализа картины аутофлуоресценции глазного дна.
Научно-практическая значимость работы. Подробное описание взаимодействия остатка 11-г/иоретиналя с ближайшим белковым окружением в родопсине как GPCR дает представление о механизме выполнения хромофором функции лиганда-антагониста, предотвращающего ложный запуск процесса транс дукции.
Результаты исследований фотообратимых реакций родопсина в фемтосекундном диапазоне времени позволяют рассматривать этот светочувствительный белок как прообраз сверхбыстрых молекулярных фотопереключателей для оптической обработки информации (патент РФ на изобретение № 2429773).
Описание флуоресцентных свойств бис-ретиноидов (флуорофоров) и дальнейшее усовершенствование на этой основе современного неинвазивного метода диагностики - аутофлуоресценции глазного дна, открывает перспективы проведения доклинической диагностики патологических процессов в сетчатке и ретинальном пигментном эпителии и прогнозирования развития этих заболеваний. В рамках проведенных исследований разработан
оригинальный способ получения монослоя клеток РПЭ из кадаверных глаз человека (патент РФ на изобретение № 2464783), создана фотохромная композиция для светофильтров защитно-профилактического действия (патент РФ на изобретение № 2466173).
Результаты работы вошли в лекционный курс «Молекулярная физиология зрительного пигмента родопсина», читаемый автором студентам 5-го курса биологического факультета МГУ им. М.В. Ломоносова и студентам 4-го курса Международного университета природы, общества и человека «Дубна», а также отражены в учебно-методическом пособии «Фотобиология и фотохимия первичных процессов зрения» для студентов биофизиков и студентов медицинских вузов.
Апробация работы. Материалы, вошедшие в диссертационную работу, докладывались на международных и всероссийских конференциях, в том числе на 1-ом Советско-японском симпозиуме «Рецепторы: структура и функции» (1989), Third congress of Eur. Soc. for Photobiol, Hungary (1989), XVII и XVIII Менделеевском съездах по общей и прикладной химии, Казань (2003, 2007), III Съезде биофизиков России, Воронеж (2004), Научно-практических конференциях «Федоровские чтения» (2007, 2011, 2012), The International conference: molecular and nanoscale systems for energy conversion, Moscow (2007), Конференциях ФЦП «Исследования и разработки по приоритетным направлениям развития научно-технологического комплекса России на 2007-2012 годы» (2007, 2008), V Съезде Российского фотобиологического общества, Пущино (2008), 1-5ш Japan-Russia international workshop MSSMBS "Molecular Simulation Studies in Material and Biological Sciences" Dubna-Moscow (2004, 2006, 2008, 2010, 2012), The International Conference of Defense Mechanisms of the Retina: New Perspectives. Yerevan (2008), 1-й Международной научной школе - Нано 2009, XV Симпозиуме по межмолекулярному взаимодействию и конформациям молекул, Петрозаводск (2010), Международной конференции IV Сисакяновские чтения «Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии», Алушта (2010), Научно-практической конференции офтальмологов «Филатовские чтения», Одесса (2011).
Грантовая поддержка работы. Диссертационная работа выполнена в соответствии с планами ИБХФ РАН и поддержана РФФИ (2003-2012), Программой фундаментальных исследований ОБН РАН «Механизмы физиологических функций: от молекулы до поведения» (2004-2011), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН № 27 «Основы фундаментальных исследований нанотехнологий и наноматериалов» (2009-2012), Программой фундаментальных исследований Президиума РАН «Фундаментальные науки - медицине» (2004-2012), Грантами президента
Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ Российской Федерации (2004-2012), Государственным контрактом № 02.740.11.0305 в рамках ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009-2013 годы (2009-2011).
Личный вклад автора. Основные результаты, изложенные в диссертации, получены при определяющем вкладе автора. Это относится к постановке задач, выбору способов их решения, постановке и проведению экспериментов, обработке и интерпретации полученных результатов. Кроме того, большая часть статей, опубликованных по теме работы в соавторстве, написана автором диссертации. Автор являлся научным руководителем 12-ти дипломных работ, защищенных в МФТИ (ГУ) (кафедры химической физики и биохимической физики), МГУ (биологический факультет, кафедра биофизики), МИТХТ (кафедра химии и технологии кино-, фотоматериалов), Международном университете природы, общества и человека «Дубна» (кафедра «Радиационная безопасность человека и окружающей среды»). Автор также являлся консультантом 3-х кандидатских диссертаций, защищенных в ИБХФ РАН и ГУ МНТК «Микрохирургии глаза» им. академика С.Н. Федорова.
Публикации. Основной фактический материал и выводы диссертации опубликованы в 36 статьях, из них 28 статей в журналах, включенных в перечень ВАК, 1 учебно-методическом пособии и 31 тезисе конференций. Практические разработки оформлены 3 патентами.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, 4 глав, включающих обзор литературы, изложение и обсуждение полученных результатов, выводов, списка цитируемой литературы и приложений с описанием методологических подходов к решению поставленных задач и нормативных документов. В диссертации 438 страниц, 130 рисунков и 13 таблиц. Библиография включает 377 источников.
