Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Белок-белковые комплексы в биолюминесцентных системах кишечнополостных 10
1.1. Основные характеристики белок-белковых взаимодействий 10
1.1.1. Структура и свойства белок-белковых контактов 10
1.1.2. Силы, определяющие белок-белковое взаимодействие 12
1.1.3. Распределение свойств области белок-белкового контакта 16
1.2. Метод ЯМР в определении пространственных структур белок-белковых комплексов 19
1.2.1. Гетероядерная одноквантовая корреляционная спектроскопия (HSQC) 20
1.2.2. Кросс-релаксация NOESY 22
1.2.3. Остаточное взаимодействие диполей 24
1.3. Метод молекулярного докинга в расчете пространственных структур комплексов биологических макромолекул 25
1.3.1. Общие закономерности докинга биологических макромолекул 25
1.3.2. Проблема белок-белкового докинга 29
1.4. Белок-белковые комплексы в биолюминесцентных системах кишеч нополостных 35
1.4.1. Фотопротеиновые системы 35
1.4.2. Белки системы Renilla 40
ГЛАВА 2. Материалы и методы 44
2.1. Молекулярная биология 44
2.2. Экспрессия и очистка белка 44
2.2.1. Выделение и очистка люциферазы из Renilla muelleri 44
2.2.2. Получение целентеразин-связывающего белка (СВР) из Renilla muelleri 46
2.2.3. Выделение и очистка фотопротеина клитина из Clytia gregaria 48
2.2.4. Выделение и очистка зеленого флуоресцентного белка (GFP) из Clytia gregaria 48
2.3. Спектральные измерения, определение биолюминесцентной активности и концентрации белка 49
2.4. ЯМР 51
2.4.1. Получение клитина и зеленого флуоресцентного белка (GFP), меченных изотопами 13С, l5N и 2Н 51
2.4.2. Спектроскопия ЯМР 52
2.4.3. Титрование и определение величины возмущения химического сдвига 52
2.5. Расчет пространственной структуры комплекса клитин-GFP 53
2.5.1. Определение условий сближения и стыковки белков в комплексе 53
2.5.2. Метод последовательных приближений 53
2.5.3. Оценка результатов расчета пространственных структур 54
2.6. Кристаллография 55
2.7. Программное обеспечение 55
2.8. Реактивы 56
ГЛАВА 3. Белок-белковые взаимодействия между люциферазой и целен теразин-связывающим белком из Renilla muelleri 57
3.1. Характеристика целентеразин-связывающего белка (СВР) 57
3.1.1. Спектры полгощения СВР 57
3.1.2. Флуоресценция СВР 58
3.2. Биолюминесценция люциферазы с целентеразином и целентеразин-связывающим белком (СВР) 60
3.3. Расчет пространственной структуры комплекса люцифераза-СВР 65
3.3.1. Пространственная структура комплекса люцифераза-СВР 65
3.3.2. Пространственная структура комплекса люцифераза-СВР-Са~+ 67
ГЛАВА 4. Образование белок-белкового комплекса межу клитином и зеленым флуоресцентным белком (GFP) из Clytia gregaria 71
4.1. Характеристика взаимодействия в системе клитин-GFP 71
4.1.1. Спектральные свойства клитина и GFP 71
4.1.2. Биолюминесценция клитина в присутствии GFP 73
4.1.3. Регистрация белок-белкового взаимодействия в системе кли-тин-GFP при помощи разных методов 76
4.2. Пространственная кристаллическая структура клитина из Clytia gregaria со связанным целентеразином 79
4.2.1. Кристаллизация 79
4.2.2. Общая структурная организация клитина 81
4.3. Пространственная кристаллическая структура зеленого флуоресцентного белка (GFP) из Clytia gregaria 84
4.4. Исследование Са2+-регулируемого фотопротеина клитина методом гетероядерного ЯМР 87
4.4.1. Отнесение резонансов в !H-15N HSQC спектре клитина 88
4.4.2. 'H-^NHSQC спектр Са2+-разряженного клитина, связанного с Са2+ 90
4.4.3. Определение методом ЯМР-титрования аминокислотных остатков клитина, «затронутых» взаимодействием с GFP 92
4.4.4. Поверхность взаимодействия клитина 97
4.5. Исследование GFP методом гетероядерного ЯМР 98
4.5.1. Отнесение резонансов в 'H-15N HSQC спектре GFP 9Е
4.5.2. Определение методом ЯМР-титрования аминокислотных остатков GFP, «затронутых» взаимодействием с клитином 102
4.5.3. Поверхность взаимодействия GFP 105
4.6. Пространственная структура комплекса клитин-GFP 109
4.7. Экспериментальное подтверждение структуры комплекса методом сайт-направленного мутагенеза 119
Заключение 122
Выводы 124
Литература 126
- Метод ЯМР в определении пространственных структур белок-белковых комплексов
- Выделение и очистка фотопротеина клитина из Clytia gregaria
- Биолюминесценция люциферазы с целентеразином и целентеразин-связывающим белком (СВР)
- Пространственная кристаллическая структура клитина из Clytia gregaria со связанным целентеразином
Введение к работе
Явление биолюминесценции широко распространено в природе. Фактически, биолюминесценция — это хемилюминесцентная реакция, в которой происходит окисление субстрата — люциферина, катализируемое специфическим ферментом люциферазой. Люциферины и люциферазы разных организмов являются соединениями различной структуры и поэтому это понятие скорее собирательное и функциональное, чем структурно-химическое.
Среди светящихся организмов подавляющее большинство представлено морскими обитателями. К настоящему времени большинство охарактеризованных биолюминесцентных систем морских животных принадлежит к так называемому целентеразин-зависимому типу, где субстратом биолюминесцентной реакции является целентеразин. Классическими представителями целентера-зин-зависимых систем являются биолюминесцентные системы мягкого коралла Renilla и медузы Aequorea.
Главным компонентом биолюминесцентной системы Aequorea является Са -регулируемый фотопротеин акворин, который представляет собой комплекс, состоящий из белка и «преактивированного» кислородом целентеразина (2-гидропероксицелентераизна), прочно, но не ковалентно связанного с белком. Биолюминесценция инициируется добавлением ионов кальция и возникает при декарбоксилировании 2-гидропероксицелентеразина. В результате реакции образуется молекула целентерамида в возбужденном состоянии и СОг- Переход целентерамида из возбужденного в основное состояние сопровождается излучением кванта голубого света.
В биолюминесцентной системе Renilla функции фотопротеина как бы по-делены между двумя белками, один из которых (Са -зависимый целентеразин-связывающий белок, СВР) хранит субстрат и реагирует на ионы кальция, а другой (люцифераза) катализирует биолюминесцентную реакцию при участии кислорода. Фактически, «субстратом» люциферазы Renilla в биолюминесцентной реакции in vivo является СВР, содержащий одну молекулу прочно связанного целентеразина. Целентеразин становится доступным для реакции с люцифера-зой и 02 только после связывания с СВР ионов кальция.
Окисление целентеразина в активном центре люциферазы или фотопротеина сопровождается излучением кванта голубого цвета, тогда как природное свечение Aequorea и Renilla является зеленым. Это обусловлено наличием дополнительного белка системы, зеленого флуоресцентного белка (GFP), который выступает в роли акцептора энергии возбужденного состояния продукта, це-лентерамида, с последующим излучением кванта зеленого света флуоресценции. Для описания безызлучательного переноса энергии с возбужденного продукта на хромофор GFP использовали с некоторыми ограничениями предложенный Форстером механизм индуктивно-резонансного переноса энергии. Поскольку такой перенос энергии наблюдается в сильно разбавленных растворах донорного и акцепторного белков, было сделано заключение, что перенос происходит с образованием белок-белкового комплекса. Однако достоверно образование короткоживущего комплекса удалось показать только для люциферазы и GFP из Renilla, но не для фотопротеина и GFP из Aequorea.
В лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН были кло- нированы кДНК гены, кодирующие Са -регулируемый фотопротеин клитин и зеленый флуоресцентный белок (GFP) из светящейся медузы Clytia gregaria, а также Са -регулируемый целентеразин-связывающий белок и люцифераза из мягкого коралла Renilla muelleri, и в настоящее время проводится всестороннее исследование этих белков. В частности, для рекомбинантных белков из Clytia — фотопротеина клитина и GFP — удалось продемонстрировать безызлучательный перенос энергии in vitro при использовании микромолярных концентраций белка, что однозначно свидетельствует об образовании белок-белкового комплекса между клитином и GFP. Важно заметить, что это первый случай, когда формирование комплекса было косвенно показано для биолюминесцентной системы фотопротеинового типа. Однако в силу слабой природы взаимодействия клитина и GFP не удалось получить кристаллов комплекса, а следовательно, и определить его пространственную структуру. Пространственная структура ком-
7 плекса представляет фундаментальный интерес, поскольку в рамках этого комплекса происходит безызлучательный перенос энергии, который важен не только в биолюминесцентных реакциях, но и в процессах фотосинтеза и дыхания. Другое направление было связано с исследованием биолюминесцентной системы Renilla, в которой белок-белковое взаимодействие между люциферазой и GFP было продемонстрировано в работах американских ученых более 30 лет назад. Тогда же было высказано предположение, что все 3 белка системы Renilla - люцифераза, СВР и GFP - функционируют в комплексе, однако дальнейших исследований в этом направлении проведено не было.
Целью данной работы являлось определение пространственных структур белок-белковых комплексов между Са -регулируемым фотопротеином клити-ном и зелёным флуоресцентным белком (GFP), а также Са -регулируемым це-лентеразин-связывающим белком (СВР) и люциферазой, входящими в состав биолюминесцентных систем медузы Clytia gregaria и мягкого коралла Renilla muelleri, соответственно. Выполнение исследования требовало решения следующих задач:
Определить биохимические и спектральные свойства СВР и кинетику биолюминесцентной реакции люциферазы Renilla с СВР в качестве «субстрата», а также, предполагая вид поверхности взаимодействия белков, рассчитать пространственную структуру комплекса при помощи программы стыковки (докинга) HADDOCK2.0.
Получить 13С,15М-меченые клитин и GFP для исследования методом ЯМР, провести отнесение резонансов в JH- 5N HSQC спектрах клитина и GFP и на основе данных ЯМР-титрования определить аминокислотные остатки обоих белков, формирующие поверхность взаимодействия.
Используя данные об аминокислотных остатках поверхности взаимодействия, рассчитать пространственную структуру комплекса клитин-GFP в программе HADDOCK2.0, а также с помощью мутантов клитина, полученных олигонуклеотид-направленным мутагенезом, экспериментально подтвердить правильность рассчитанной структуры комплекса.
8 При решении поставленных задач получены результаты, которые выносятся на защиту:
Исходя из кинетических характеристик реакции люциферазы с СВР, спектральных свойств СВР, а также кристаллических структур люциферазы и СВР из Renilla mnelleri, рассчитана пространственная структуры комплекса люцифераза-СВР-Са" .
Методом ЯМР-титрования с использованием изотопно-меченых белков определены аминокислотные остатки поверхности взаимодействия клитина и GFP.
На основе данных о кристаллических структурах клитина и GFP и данных об аминокислотных остатках зоны контакта рассчитана пространственная структура комплекса клитин-GFP, правильность которой подтверждена экспериментально.
Все результаты, представленные в данной работе, получены впервые и имеют фундаментальный характер, так как добавляют новую информацию к пониманию устройства и функционирования биолюминесцентных систем кишечнополостных, а также роли белок-белковых взаимодействий в этих процессах. Комплекс клитин-GFP является хорошей модельной системой для исследования деталей молекулярного механизма индуктивно-резонансного переноса энергии в белковых структурах. Полученные результаты могут найти применение и в прикладных исследованиях. Так, использование СВР в качестве «субстрата» для люциферазы Renilla может повысить чувствительность биолюминесцентного анализа. В свою очередь, система клитин-GFP является новым перспективным кандидатом для использования в BRET системах, широко используемых для прижизненной визуализации белок-белковых взаимодействий в клетках и целых организмах. Данные о пространственной структуре комплекса клитин-GFP являются основой для возможной модификации аффинности белков в комплексе с целью повышения эффективности переноса энергии и, следовательно, чувствительности BRET анализа.
Работа выполнена при поддержке грантов РФФИ 08-04-92209-ГФЕН_а и 05-04-48271_а, а также программы Президиума РАН «Молекулярная и клеточная биология».
Материалы диссертационной работы докладывались на Международной Конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2004); Конференции молодых ученых КНЦ СО РАН (Красноярск, 2007); на Международном симпозиуме по Биолюминесценции и Хемилюминесценции (Шанхай, 2008); на семинарах лаборатории фотобиологии Института биофизики СО РАН и Национальной лаборатории биологических макромолекул Института биофизики Пекина (КНР).
Результаты исследований опубликованы в 1 статье в рецензируемом журнале и включены в международную базу данных PDB и BMRB.
Метод ЯМР в определении пространственных структур белок-белковых комплексов
К настоящему времени остается все меньше клеточных процессов, в которых не было бы показано участие белок-белковых взаимодействий. Стало общепринятым говорить о существовании сложнейшей внутриклеточной коммуникационной сети, включающей десятки тысяч белок-белковых взаимодействий, большинство из которых характеризуется слабой природой [Gavin et al., 2002; Но et al., 2002]. Незначительный прогресс в исследовании слабых белок-белковых взаимодействий прежде всего связан с методологическими трудностями по их обнаружению и характеризации, что особенно касается крайне слабых взаимодействий (KD 10"4 М), когда общее число молекул белок-белкового комплекса настолько мало, что не может быть зарегистрировано классическими методами как in vivo, так и in vitro. Метод ядерного магнитного резонанса (ЯМР) зарекомендовал себя как мощный инструмент в исследовании временных белок-белковых комплексов, начиная от их обнаружения и заканчивая определением пространственной структуры комплекса. Во многом успех белкового ЯМР последних 10-ти лет обязан усовершенствованиям конфигурации и рабочей частоты спектрометра, разработкам новых методов спектрометрии (TROSY [Gavin et al., 2002], RDC [Ho et al., 2002]), а также повышению компьютерных мощностей, позволяющих обрабатывать значительно большие массивы данных. Идея использования ЯМР для решения пространственных структур белковых комплексов достаточно изящна - сначала в ЯМР экспериментах (HSQC, NOESY, RDC) определяют аминокислотные остатки обоих белков, формирующих поверхность взаимодействия, которые затем переносят на пространственную структуру каждого из белков. В программе компьютерного моделирования производят расчет (поиск) структуры белок-белкового комплекса с наименьшим значением свободной энергии, используя входные данные о пространственных структурах отдельных белковых молекул и аминокислотах поверхности взаимодействия (включая пары взаимодействующих аминокислот). Такой расчет в отечественной литературе называют новым термином «докинг», от английского слова «docking» («стыковка»). Ниже приведен обзор основных методов ЯМР спектрометрии, применяемых при обнаружении и решении пространственной структуры белок-белкового комплекса.
Проблема докинга будет изложена в разделе 1.3. Метод белкового ЯМР основан на поглощении электромагнитной энергии переменного магнитного поля высокой частоты ядрами атомов с ненулевым спином ( Н, 13С, 15N и др.). Поглощение электромагнитной энергии определенной частоты называется резонансом. Самое важное свойство экспериментов по двойному резонансу состоит в установлении корреляции между происходящим с одной группой ядер с тем, что происходит с другой. Наличие корреляции позволяет установить взаимодействие между группами и обычно указывает на то, что они находятся в одной и той же молекуле и относительно близко друг к другу. В H-I5N HSQC экспериментах устанавливается корреляция частоты резонанса (химического сдвига) ядра 15N с частотой резонанса ядра ]Н в химической группе N-H [Вах et al., 1990]. Для молекулы белка, обогащенной изотопами 15N, H-15N HSQC эксперимент позволяет получить корреляцию 15N с Н амидной группы каждой аминокислоты. Данная корреляция графически отображается в виде кросс-пика, соответствующего амидной группе основной цепи каждой аминокислоты на двумерном Н- N HSQC спектре белка (рис. 4.12). Величина химического сдвига кросс-пика крайне чувствительна к локальному химическому окружению соответствующей амидной группы белка, в результате чего двумерный спектр H-bN HSQC белка уникален в своем распределении кросс-пиков, поскольку уникально и химическое окружение каждого остатка белка, и такой спектр является своего рода "отпечатком пальцев" белковой молекулы. Некоторые кросс-пики белка могут испытывать сильное перекрытие в спектре ввиду сходного химического окружения соответствующих аминокислотных остатков. Этот эффект усиливается при увеличении молекулярной массы белка, что является одним из ограничений применимости ЯМР к большим белковым молекулам и белковым ансамблям. Так как величина химического сдвига крайне чувствительна к локальным изменениям химического окружения, то небольшие вариации рН, температуры или взаимодействие с другими молекулами могут приводить к возмущениям кросс-пиков в двумерном H-15N HSQC спектре. В случае белок-белкового взаимодействия возмущение затрагивает кросс-пики тех остатков, которые либо находятся в непосредственной зоне контакта, либо испытывают конформа-ционные перестройки в результате комплексообразования.
Первый случай характерен для слабых белок-белковых взаимодействий, при которых наблюдается незначительное изменение конформации белковой молекулы и умеренное возмущение химических сдвигов. Это делает H-15N HSQC спектроскопию чрезвычайно удобным методом для определения поверхности взаимодействия белка с лигандным белком даже для короткоживущих комплексов с KD 10"2 М [Hall et al., 2001]. Белок-белковое взаимодействие сильной природы приводит к значительным возмущениям химических сдвигов и изменениям в структуре белка, и поэтому поверхность контакта не может быть корректно определена без дополнительных экспериментов [Takahashi et al., 2000]. Проводя титрование 15№меченого белка немеченым лигандным белком и наоборот, можно устано вить аминокислотные остатки обоих белков, формирующих поверхность взаимодействия. Данный метод называется «картированием поверхности взаимодействия на основе возмущения химических сдвигов». Как правило, для установления точной структуры белок-белкового комплекса наряду с картированием по химическому сдвигу прибегают к другим ЯМР методикам, таким как кросс-релаксация (NOESY) и остаточное взаимодействие диполей (RDC). Однако известны работы, в которых адекватные структуры белок-белковых комплексов были рассчитаны только на основе картирования по химическому сдвигу, что стало возможным благодаря усовершенствованиям алгоритмов программ молекулярного докинга [Arnesano et al., 2004; Diaz-Moreno et al., 2005; Dominiquez et al., 2004; Aiunkumar et al., 2005]. Рассчитанные структуры были подтверждены биохимическими методами.
Выделение и очистка фотопротеина клитина из Clytia gregaria
Трансформированные клетки Е. coli (штамм XL 1-Blue) культивировали в LB-среде с 100 мкг/мл ампициллина при 37С до индукции ИПТГ (0,4 мМ), после чего выращивали при 16С в течение 20 ч. После дополнительной инкубации при 4С в течение суток клетки приобретали ярко зеленый цвет, что свидетельствовало об эффективном «созревании» хромофора GFP. Клетки разрушали с помощью ультразвукового дезинтегратора в фосфатном буфере и центрифугировали (20000 g, 30 мин). Супернатант наносили на колонку с металл-хелатным сорбентом Ni-NTA, уравновешенную фосфатным буфером. Сорбция GFP обеспечивалась за счет генетически пришитого к N-концу белка полигис-тидинового фрагмента (Hisag) из 10 гистидинов. Белок элюировали ступенчатым градиентом имидазола (50 - 500 мМ) в фосфатном буфере; ярко зеленые фракции, содержащие GFP, объединяли, концентрировали и переводили в 2 мМ ЭДТА, 20 мМ СаС12, 25 мМ Трис-HCl рН 7,5 на колонке Dextran Desalting (PIERCE, США). Полигистидиновый фрагмент удаляли с помощью фермента энтерокиназы (Novagen) при комнатной температуре в течение ночи. Энтеро-киназу отделяли гель-фильтрацией на колонке Superdex 75, уравновешенной 2 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl рН 7,0. В результате был получен GFP высокой степени чистоты (рис. 2.4). Для кристаллизации в комплексе с клитином белок концентрировали до 25 мг/мл. Выход белка составлял 20 - 25 мг с 1 г сырой биомассы клеток.
Концентрацию белка определяли с помощью набора «DC protein assay» (Bio-Rad). Бычий сывороточный альбумин был использован как стандарт для построения калибровочной кривой. В дальнейшем использовали коэффициенты молярной экстинкции клитина (є28о = 65200) и GFP (є485 = 64000) для определения концентрации белков. Спектры поглощения белков определяли с помощью спектрофотометра «UV1KON 943» (Kontron Instruments, Италия). Оптимальные условия для биолюминесценции люциферазы (буферная система, рН, концентрация соли) и общее количество излученного света определяли на люминометре БЛМ 8802 (СКТБ «Наука»). Определение кинетических параметров свечения люциферазы с целенте-разином и СВР было выполнено с помощью планшетного люминометра Lu-minoscan Ascent (Thermo Electron Corporation). В лунку непрозрачного планшета вносили по 50 мкл раствора целентеразина разной концентрации (0,046 - 190 мкМ) в 1 мМ ЭДТА, 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl рН 7,5. Реакцию инициировали впрыскиванием 50 мкл раствора люциферазы в том же буфере. Аналогично, в лунки, содержащие 50 мкл раствора СВР разной концентрации (0,0066 -216 мкМ) в 1 мМ ЭДТА, 50 мМ СаС12, 100 мМ NaCl, 50 мМ Трис-HCl рН 7,5, впрыскивали 50 мкл раствора люциферазы. Конечная концентрация люциферазы в обоих вариантах составляла 3,8 нМ. Спектры биолюминесценции люциферазы и флуоресценции СВР были измерены на спектрофлуориметре AMINCO (Thermo Scientific, США). Спектры биолюминесценции люциферазы (0,15 мкМ) определяли в буфере, содержащем ОД мМ ЭДТА, 1 мМ Трис-HCl рН 7.0. Биолюминесценцию инициировали впрыском целентеразина (3,3 мкМ) или СВР (3,3 мкМ) в растворе 5 мМ СаС12 в том же буфере. Спектры флуоресценции для СВР с кальцием были записаны в буфере 5 мМ СаС12, 20 мМ Трис-HCl рН 7,0. Спектры биолюминесценции клитина и клитина в комплексе с GEP, а также кинетика люминесцентного сигнала были измерены с помощью планшетного спектрофлуориметра Varioskan (Thermo Scientific, США). В лунку непрозрачного планшета вносили 150 мкл раствора клитина (1 мкМ) и GFP разной концентрации (0 - 4,24 мкМ) в 20 мМ Трис-HCl рН 7,0 с 2 мМ ЭДТА и 10 мМ NaCl. Биолюминесценцию инициировали впрыскиванием 7 мкл раствора 40 мМ СаС12 в том же буфере. Все спектры были корректированы на чувствительность ФЭУ к различным длинам волн с помощью программного обеспечения прибора, а также с учетом кинетики спада биолюминесцентного сигнала.
Все спектральные и люминесцентные измерения выполнены при комнатной температуре. Приведенные значения представляют собой среднее из 3 независимых измерений. Для получения клитина и GFP, меченных изотопами 15N и 13C,L5N, трансформированные клетки выращивали в минимальной среде М9, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, а также 15NH4C1 или 15NH4C1 и 13С-глюкозу, соответственно. Экспрессию, выделение и очистку 15N- и 13С,ь Т-меченого клитина проводили по схеме, описанной в разделе 2.2.3 для фотопротеина дикого типа. Выход высокоочищенного белка сіл среды обычно составлял 26 мг для bN-меченого клитина и 20 мг для 13С,151Ч-меченого клитина. Для получения 15N-, 13C,15N- и 2Н,13С,15М-меченого GFP трансформированные клетки выращивали при 37С в LB-среде с 100 мкг/мл ампициллина и при достижении оптической плотности OD6oo 0,6 - 0,8 центрифугировали (3000 g, 20 мин). Супернатант отбрасывали, а клетки осторожно ресуспендировали в М9-среде и выращивали еще 2 ч при 20С до индукции ИПТГ (0,4 мМ). После индукции клетки культивировали в течение 38 ч при 20 С. Для получения Н, С, N-меченого GFP среду М9 готовили на тяжелой воде D2O (чистота 95%), а клетки дополнительно выращивали 38 ч при 25С и инкубировали в течение двух суток при 4С. Клетки, выращенные на М9-среде, обогащенной изотопами, к моменту окончания культивирования всегда были зеленого цвета. Выделение и очистку 15N- и 13С, -меченого GFP проводили по схеме, описанной в разделе 2.2.4 для белка дикого типа. "Н, С, N-меченый GFP дополнительно подвергали обратимой денатурации в растворе 6 М гуанидин-НС1, содержащем 2 мМ ЭДТА, 150 мМ NaCl, 20 мМ Трис-HCl рН 7,0, в течение 10
Биолюминесценция люциферазы с целентеразином и целентеразин-связывающим белком (СВР)
Биолюминесцентная реакция люциферазы in vitro может быть инициирована как добавлением целентеразина, так и впрыском раствора Са в смесь люциферазы и СВР (схема рис. 3.3), в результате чего высвечивается квант голубого света. Для удобства изложения целентеразин и СВР рассматриваются как два разных «субстрата» фермента люциферазы, хотя химическим субстратом люциферазы в обоих видах реакции является именно молекула целентеразина. На рис. 3.3 показана зависимость максимума биолюминесцентного сигнала люциферазы от концентрации целентеразина или СВР. Обе зависимости выходят на плато при концентрациях субстратов 50 мкМ (СВР) и 30 мкМ (целентеразин). На всем протяжении зависимости кроме участка плато интенсивность свечения люциферазы с СВР в несколько раз выше, чем с целентеразином. Кинетика биолюминесцентного сигнала люциферазы показана на рис. 3.5 при концентрациях СВР и целентеразина, соответствующим средним точкам зависимости на рис. 3.3.
Сигналы записывали при одинаковых условиях (концентрации белков, рН, температура, буфер). Видно, что интенсивность биолюминесцентного сигнала с СВР в 3 раза выше, чем с целентеразином, а общее количество излученного света (площадь под кривой) - в 2 раза, что связано с более быстрым спадом кинетики свечения с СВР. При построении графика Лайнувера-Берга за скорость (V) люциферазной реакции с целентеразином или СВР принималось значение максимальной интенсивности биолюминесценции в относительных единицах. Из графика Лайнувера-Берга (рис. 3.4) были определены константа Михаэлиса и максимальная скорость люциферазной реакции с целентеразином (Кт(СЕ) = 10 мкМ и Гтах(сЕ) = 1080 отн.ед.) и СВР (Кт(Свр) = 26 мкМ и Vmax(CBP) = 6700 отн.ед.). Чтобы оценить эффективность люциферазы в реакции с разными «субстратами», рассчитывали количество оборотов фермента (k ;at = Vmax/[E], где [Е] — концентрация люциферазы) и константы скорости реакции (kcat/Km), делая допущение, что количество излученного света пропорционально количеству образовавшегося продукта, целентерамида. Поэтому определенные kcat и kcat/Km являются «кажущимися». Люцифераза совершает в 6 раз большее число оборотов в реакции с СВР (kcat = 568 с"1), чем с целентеразином (k = 3256 с"1). Константа скорости реакции (kcat/Кщ), которая характеризует общую эффективность работы фермента, составила 136 MKM V1 для СВР и 57 MKNT C"1 ДЛЯ целентеразина. Другими словами, люцифераза использует целентеразин, заключенный в составе СВР, в 2,5 раза эффективнее, чем свободный целентеразин. Это разница в эффективности работы фермента согласуется с различием в квантовом выходе биолюминесцентной реакции с СВР и целентеразином. Спектры биолюминесценции люциферазы с целентеразином и СВР практически идентичны, наблюдается незначительный сдвиг максимума биолюминесценции на 5 нм (рис. 3.6). Это говорит о том, что природа возбужденного продукта в обеих реакциях одинакова, а смещение максимума, очевидно, свидетельствует о разнице химического окружения целентерамида в возбужденном состоянии. Интересно, что даже в отсутствие ионов кальция наблюдается достаточно высокий уровень биолюминесценции смеси люциферазы и СВР. Из рис. 3.7 видно, что разница кальциевого и безкальциевого люминесцентных сигналов отличается всего на 1 порядок.
Поскольку СВР эффективно экранирует связанный целентеразин от окисления (раствор СВР может храниться годами), то высокий уровень безкальциевой люминесценции люциферазы с СВР можно объяснить образованием белок-белкового комплекса, в котором люцифераза «от-бирает» целентеразин у СВР даже в отсутствие Са . Каким образом этот эффект предотвращается в фотоцитах Renilla, остается непонятным, поскольку известно, что Renilla не производит фонового свечения и способна быстро отвечать на механическое раздражение вспышками света.
Пространственная кристаллическая структура клитина из Clytia gregaria со связанным целентеразином
Для первоначального поиска условий кристаллизации клитин концентрировали до 15 мг/мл в буфере 2 мМ ЭДТА, 20 мМ Трис-HCl рН 7,0. Кристаллизацию проводили методом «сидячей капли». Желтые палочковидные кристаллы (0,1 х 0,1 х 0,5 мм) были выращены в течение менее одной недели с момента начала кристаллизации при температуре 16С из раствора 0,2 М дигидрофосфа-та натрия, 20% ПЭГ 3350, рН 8,8. Кристаллографическая статистика обработки дифракционных данных и построения модели клитина приведена в таблице 4.1. Пространственная модель клитина со связанным целентеразином была размещена в базе данных белков под идентификационным кодом ЗКРХ. Пространственная структура клитина высоко гомологична структуре фотопротеина обелина из Obelia longissima [Liu et al., 2000]. Среднеквадратичное отклонение (RMSD) атомов основной цепи клитина и обелина составляет 0,54 А (рис. 4.8). Пространственная структура клитина, также как и у обелина, представляет собой компактную белковую глобулу (диаметр около 45 А), образованную двумя «чашеобразными» доменами, каждый из которых состоит из 4 а-спиралей, обозначенных как А — D в N-концевом домене и Е — Н в С-концевом домене. Домены контактируют друг с другом посредством водородных связей между а-спиралями. Так, например, амидная группа Lys48 (а-спираль В) образует водородную связь с карбонильной группой Serl45 (а-спираль F), а карбоксильная группа Aspl02 (а-спираль D) образует водородную связь с карбонильной группой Неї 14 (а-спираль Е). Это, по-видимому, может способствовать кооперативному характеру изменений в белке в ответ на связывание ионов кальция. Элементарный повторяющийся мотив структуры клитина представляет собой «а-спираль — поворот — а-спираль» (НТН) мотив, который является ха-рактерным структурным мотивом Са -связывающих белков «EF-hand» типа.
Тем не менее, только три из четырех таких мотивов (I, III, IV) имеют канониче-скую аминокислотную последовательность для связывания Са" . В «EF-hand» петле I имеется избыток электронной плотности, указывающий на наличие в этом месте координированного иона металла. N-конец клитина на участке Thr2 — А1а9 не структурирован, поэтому для него отсутствуют данные электронной плотности. Молекула субстрата, 2-гидропероксицелентеразина, расположена во внутренней полости белка (объем 600 А3), которая имеет ярко выраженный гидрофобный характер и сформирована аминокислотными остатками практически всех а-спиралей: His25, Met28 и Leu32 (а-спираль А); Пе45, А1а49 и Пе53 (а-спираль В); Phe75 (а-спираль С); Phe91 и Тгр95 (а-спираль D); Неї 14, Тгр117, Glyll8, Vall21 и Phel22 (а-спираль Е); Тгр138, Туг141 и lie 147 (а-спираль F); Met 174, His 178 и Trpl82 (а-спираль H); Тугі 93 (С-конец). В полости найдены две молекулы воды: одна образует водородные связи с атомом кислорода ОН-группы Туг141 и азотом His67, другая - водородные связи с Неї 14, Thrl75 и атом 017 10-(и-гидрокси)-бензильного кольца 2-гидроперокси-целентеразина. В целом, целентеразин-связывающая полость клитина абсолютно гомологична таковой обелина, незначительно варьируют лишь расстояния между отдельными функциональными группами.
Практически все аминокислотные остатки, формирующие субстрат-связывающую полость клитина, являются консервативными среди фотопротеинов. Боковые цепи Тгр95 и Тгр182 образуют «сэндвич-структуру» с 6-(п-гидрокси)-фенильным кольцом. Триптофаны 117 и 138 размещаются вблизи 2-(и-гидрокси)-бензильной группы субстрата и также формируют «сэндвич-структуру». Эти четыре остатка триптофана как бы фиксируют молекулу 2-гидропероксицелентеразина во внутренней полости. Кроме того, атом кислоро да 025 6-(и-гидрокси)-фенильной группы и NH-группа индольного кольца Тгр95 формируют водородную связь. Имеются только четыре гидрофильных остатка (His25, Tyrl41, His 178 и Туг 193), боковые цепи которых направлены внутрь субстрат-связывающей полости. Hisl78 формирует водородную связь с ОН-группой Туг193 и находится на расстоянии 3,2 А от атома 018 2-гидропероксицелентеразина (рис. 4.9).
