Содержание к диссертации
Введение
1. Скрининг противомикробной активности растений юга России 44
1.2. Сравнительные исследования противомикробной активности экстрактов растений и синтетических соединений - карбамидов и оксидазолов 55
1.3. Исследования противомикробной активности растительных экстрактов методом КОЕ 59
1.4. Исследование противомикробной активности эфирных компонентов растений 66
2. Изучение распространения и запасов некоторых лекарственных растений с противомикробными свойствами в астраханской области и юга России 77
2.1. Исследование запасов и распространения ценного растительного материала в природных объектах Астраханской области 77
2.2. Исследования продуктивности ценного лекарственного растительного сырья и стандартизация собранного материала 94
3. Подбор методов сушки, измельчения и сохранения ценного растительного сырья 99
3.1. Разработка методов и специальных условий воздушно-теневой сушки, технологий измельчения растительного материала 99
4. Подбор технологий экстрагирования различных сочетаний растительных веществ исследуемых растений 112
4.1. Исследование методов и средств экстрагирования ценного растительного материала для выделения биологически активных веществ и стандартизации фитомассы 112
5. Изучение химического состава и противомикробной активности микроорганизмов окружающей среды и человека 131
5.1. Изучение химического состава компонентов растительных жидких и масляных экстрактов 131
5.2. Изучение сравнительной биологической противомикробной активности растительных экстрактов и препаратов на их основе 153
6. Биотехнология выделения лектинсодержащих компонентов исследуемых растений и изучение их антибактериальной и иммунологической активности 157
6.1. Результаты исследований противомикробных свойств буферных экстрактов в отношении Staphylococcus aureus 174
6.2. Результаты исследований противомикробных свойств буферных экстрактов в отношении Esherichia coli 175
6.3. Сравнительная противомикробная активность буферных экстрактов некоторых растений семейства Asteraceae, семейства Fabaceae, семейства Тіїіасеає, семейства Salicaceae против Staphylococcus aureus 177
6.4. Обнаружение лектиноподобных веществ некоторых растений с использованием бактериальных углеводов 194
6.5. Результаты исследования иммунобиологических свойств 199
растительных экстрактов и лектинсвязывающих углеводов 199
7. Изучение сорбционных и адгезивных свойств экстрактов некоторых растений и возможности применения их в клинической практике 209
8. Изучение и разработка технологии улучшения санитарно-экологического состояния воды в связи с противомикробной активностью растений 221
8.1. Особенности эколого-географического положения Астраханской области 221
8.2. Экологическое состояние водоемов города Астрахани 221
8.3.Особенности участия водного фактора в распространении инфекции и
саморегулировании водоемов 222
8.4. Применение растений и растительных компонентов для санитарно экологической очистки водоемов 224
9. Исследования активности экстрагированных веществ растений и растительных препаратов против микобактерии 246
10. Создание и отработка технологии фитокомпонентов и фитопрепарата «экстракт солодки «глицирфит» и фиткомпозиции препарата «фитокапли «глицирфит» 258
11.Изучение активности бав растительных препаратов на экспериментальных животных (in vivo), зараженных лепрой (mycobacterium leprae) и туберкулезом (mycobacterium tuberculosis) 264
11.1.Влияние экстрактивных компонентов растений на морфологию клеток микобактерий M.tuberculosis 264
11.2.Применение растительных экстрактов и препаратов(іп vivo в эксперименте) в качестве противотуберкулезных и иммунотропных средств для лечения микобактериозов 271
11.3. Применение препаратов из растений для комплексной противолепрозной фитотерапии 277
12. Применение фитопрепарата экстракт солодки глицирфит в качестве фитобиотика 289
13. Применеие растений и их компонентов в создании и отработке технологии фитобальзама для регенерации кожи «инсофит» и фитонабора для очистки воды 296
13.1. Технология создания и состав серии лечебных косметических фитобальзамов «ИНСОФИТ» на основе липидных и экстракционных компонентов растений 297
13.2. Биотехнология создания набора для поэтапной очистки воды 304
Выводы 306
Библиография
- Исследования противомикробной активности растительных экстрактов методом КОЕ
- Разработка методов и специальных условий воздушно-теневой сушки, технологий измельчения растительного материала
- Изучение химического состава компонентов растительных жидких и масляных экстрактов
- Сравнительная противомикробная активность буферных экстрактов некоторых растений семейства Asteraceae, семейства Fabaceae, семейства Тіїіасеає, семейства Salicaceae против Staphylococcus aureus
Введение к работе
Актуальность проблемы. Одним их важнейших направлений современной биологической науки является использование биообъектов или их молекул в промышленном производстве полезных для человека и животных веществ, а так же в производстве лечебно-профилактических и диагностических препаратов из природных натуральных, в том числе растительных компонентов (Тихонов, 2008).
В последние десятилетия заметно возрос интерес к проблеме поддержания и восстановления микроэкологического статуса человека. Для этих целей все шире используют натуральные безопасные растительные фитопрепараты. Повышенное внимание к фитопрепаратам вызвано ростом контингента лиц, страдающих от применения химических антибиотиков и требующих коррекции состояния организма с помощью фитопрепаратов (Никитина, 2009; Виссарионов, 2008). Актуальность использования лекарственных растений неизмеримо возросла в последние десятилетия, что обусловлено множеством терапевтических неудач при использовании химических антибиотиков и терапевтических препаратов, по данным ВОЗ 2,5-5% госпитализированных составляют больные с лекарственными осложнениями (Нестерова, 2008; Виноградова, 1999).
Астраханская область обладает уникальным природно-ландшафтным положением и климатическими особенностями, определяющими особое экологическое состояние окружающей среды. Экологические особенности региона связаны с повышенным уровнем инсоляции, крайне низкой влажностью воздуха, засушливыми глинисто-песчанными почвенными ландшафтами Приволжских песков среди многочисленной сети рукавов, протоков, ильменей Волго-Ахтубинской поймы и дельты Волги в целом (Щучкина, 1996; Пилипенко, 1996, 2003; Бармин, 2001; Чуйков, 2000).
В силу сложившихся природно-экологических условий здесь успешно уживаются как пустынно-песчанные, так и тропические представители флоры. Таким образом, на территории Астраханской области создана уникальная природно-ландшафтная обстановка с неоценимым разнообразием видов и представителей флористического состава. Все эти природно-экологические особенности региона могут создавать условия для формирования у дикорастущей флоры повышенных концентраций биологически активных веществ, обладающих и противомикробной активностью (Муравьева, 2002; Пилипенко, 1996). Поэтому, актуальным является изучение биологического разнообразия растительности, особенно лекарственных видов и других, уникальных по свойствам и биологическим характеристикам дикорастущих растених Приволжского и Прикаспийского региона и биотехнология их использования для пищевой, косметической, фармацевтической промышленности (Абрамова, 1988; Бабоша, 2008; Казаринова, 2000; Корсун, 1998; Коштоян, 1981; Демченко, 2006; Вичканова, 1983, 2000; Виссарионов, 2008; Будаева, 2005; Баронец, 2001; Ягодка, 1991; Чиков, 1977; Муравье, 1976; Лахтин, 1988).
Эффективность растительных препаратов определяется совокупностью и биологической активностью многих лекарственных растений и свойств химических веществ, входящих в их состав (Бондаренко, 2003; Шендеров, 2005; Феклисова, 2007). Специалисты в области фитотерапии пытаются повысить биологическую активность растительных терапевтических средств за счет разработки комплексных препаратов на основе специально подобранных растительных композиций. Успешно применяются сочетания компонентов противомикробного или иного действия для комплексной химиотерапии, а также при добавлении фитокомпонентов в продукты лечебной косметологии, в качестве физиологически активных пищевых добавок и препаратов (Вичканова, 2007; Таха и др., 2009; Шакирова, 2007). Группа специалистов в области разработки противомикробных растительных препаратов считают, что актуальность создания оригинальных антимикробных средств нехимической «иной» природы с новыми растительными свойствами природных компонентов и другим механизмом действия не вызывают сомнений (Van Damme, 1988; Pan, 2002; Вичканова, 2009). В связи с этим в последние годы осуществляется новый виток приобщения косметологии, медицины и фармакологии к средствам растительного происхождения.
Цель работы. Обоснование ботанической и биотехнологической роли дикорастущих растений флоры Юга России как источника ценных фитокомпонентов с противомикробными, иммунопротективными, дерматопротективными и другими биорегуляторными свойствами.
Основные задачи работы.
Обосновать концепцию сравнительного анализа высокой противомикробной активности веществ растений природного комплекса Юга России, в том числе Северного Прикаспия и юго-востока Восточно-Европейской равнины, Прикаспийской низменности (Астраханской области).
Охарактеризовать особенности распространения и запасов некоторых отобранных наиболее перспективных дикорастущих лекарственных растений на территории Астраханской области.
Провести скрининг противомикробной активности дикорастущих растений Астраханского региона с целью отбора наиболее перспективных для биотехнологии получения из них фитопрепаратов.
Оценить особенности отбора и сохранения растительного лекарственного сырья, экстрагирования наиболее активных противомикробных биологически активных веществ, исследования химического состава и свойств фитокомпонентов отобранных растений. Разработать требования к сырью (включая вопросы его предварительной обработки).
Отработать оригинальные методики экстрагирования противомикробных компонентов растений. Обосновать теоретические и прикладные вопросы использования дикорастущих лекарственных растений региона в перспективных практических направлениях современной биотехнологии.
Осуществить комплексные исследования биотехнологии извлечения ценных фитокомпонентов и противомикробной активности растительного сырья с целью создания препаратов для профилактики некоторых инфекционных процессов.
Определить влияние растительных биокомпонентов на формирование и функционирование ряда микробных сообществ: сапрофитных, некоторых патогенных, условно-патогенных микроорганизмов в окружающей среде и в экспериментальных условиях (регулирование микробиоценоза кишечника, регулирование водной микрофлоры).
Обосновать биотехнологию выделения лектиновых белков из растений и осуществить исследование лектинсодержащих компонентов в растительных экстрактах с использованием синтетических лектинсвязывающих углеводных бактериальных гаптенов как одного из механизмов растительной защиты от патогенов.
Разработать из экспериментально выделенных фитокомпонентов, содержащих растительные (фитолектиновые) фракции, фитопрепараты для профилактики инфекционных процессов с противотуберкулезной, противолепрозной, противостафилококковой и другой степенью активности.
Обосновать биотехнологию получения ценных фитокомпонентов для получения натуральной биотехнологической продукции в качестве пищевых добавок, фитосредств для профилактики и комплексной фитотерапии, косметических лечебных фитопрепаратов, фитонаборов для очистки воды.
Провести испытание фитопрепаратов и фитонаборов с целью подтверждения их биоактивных свойств: антимикобактериальных, иммунопротективных, адгезивных, дерматопротективных, пребиотических и других свойств.
Основные положения, выносимые на защиту
-
Природно-экологические особенности региона способствуют формированию противомикробных компонентов в дикорастущих растениях. Обоснованы распространение и запасы некоторых лекарственных и дикорастущих растений с выраженными противомикробными и биорегуляторными свойствами в Астраханской области, входящей в природный комплекс Северного Прикаспия и Юга России (Юго-Востока европейской равнины в пределах Прикаспийской низменности).
-
Особенности локального распространения многих дикорастущих растений региона, высокие уровни ценных биологически активных веществ и результаты скрининга противомикробных свойств позволили провести обоснование отбора наиболее значимых растений региона для биотехнологии получения ценной фитопродукции.
-
Обнаруженные в растениях региона природные растительные белковые компоненты (фитолектины) обладают иммунобиологическими свойствами, неоценимыми в получении фитокомпонентов для иммунопрофилактики и противоинфекционной терапии.
-
По механизмам действия противотуберкулезной, противолепрозной и другой противомикробной активности in vitro и in vivo экстрагируемые компоненты Glycyrrhiza glabra (L.), Achillea micrantha M.B., Helichrisum arenarium (L.) Moench) являются наиболее ценными из изученных дикорастущих растений региона.
-
Раскрыты механизмы противомикробной самозащиты дикорастущих растений с участием лектинсодержащих комплексов в условиях природной среды, что может явиться одним из факторов иммунитета растений.
-
Разработана технология получения и предложены способы использования ценных фитокомпонентов для дальнейших научно-теоретических исследований и применения их в биотехнологии создания противомикробных фитопрепаратов с биорегуляторными свойствами.
Научная новизна. Проведена оценка запасов ценного растительного сырья и распространения перспективных для биотехнологии дикорастущих растений региона с противомикробными и биорегуляторными свойствами.
Впервые разработана концепция сравнительного анализа антимикробной активности дикорастущих растений Юго-Востока европейской части России с целью создания технологии получения ценных фитопрепаратов с антибактериальной и иммунопротективной направленностью.
Предложены пути выделения ценных природных растительных белковых компонентов (лектинов) растений, показаны иммунобиологические свойства данных фитолектинов и возможности их использования в иммунопрофилактике и противоинфекционной терапии.
Впервые разработана оригинальная технология выделения и создан препарат из корня солодки голой с противотуберкулезной (патент № 2362577 от 18.05.2007, № госрегистрации 30.АЦ.02.009.У.000001.06.10 от 30.06.2010 г) и противолепрозной (патент № 241111 от 29.07.2009) активностью.
На базе уникального биотехнологического процесса разработана рецептура и технология получения новых поликомпонентных субстанций для лечебной косметики и получена серия фитобальзамов для регенерации кожи (патент №2369377 от 29.07.2008, ТУ 9197-006-38989935-08).
Совместно с НИИ по изучению лепры (Астрахань) разработаны рецептуры и методы клинического применения фитопрепаратов на основе корня солодки голой, соцветий тысячелистника мелкоцветкового и цмина песчаного для комплексного лечения лепры, ее профилактики и снижения риска заболевания лепрой (патент №241111 от 29.07.2009).
Получены результаты по усилению иммунопротективной активности перитонеальных макрофагов (их миелопероксидазной активности) при лечении микобактериозов (туберкулеза и лепры) фитопрепаратами.
Изучены и предложены новые варианты выделения растительных лектинов и их активность в отношении некоторых условно-патогенных и патогенных бактерий.
Представлены возможные пути применения растительных поликомпонентов и монофитопрепаратов для применения в практике восстановления кишечных микробиоценозов (фитобиотики) и лектинов для выведения углеводсодержащих токсинов и наркотических веществ и их метаболитов из организма больных.
Выделены биоактивные растительные субстанции из корня солодки голой для апробации и первичных испытаний в клиническом практике поликомпонентных фитопрепаратов при ряде вирусных инфекций и туберкулеза.
Разработаны оригинальные рецептуры новых, натуральных фитопрепаратов для разработки лечебной косметики, создания пищевых добавок, фитобиотиков, консервантов и регуляторов вкуса, фарм-фито-препаратов, для дополнительной фитотерапии при некоторых инфекционных процессах, препаратов для микробиологической очистки воды.
Теоретическая значимость работы. Обобщены теоретические направления изучения аспектов формирования биологически активных веществ противомикробного действия у растений в природе и агрокомплексах.
Проведен скрининговый анализ противомикробной активности ряда ценных растений изучаемого региона.
Разработаны научные основы применения стандартных фитокомпонентов для изучения механизмов их антибиотической и иммуннорегуляторной активности на молекулярном, клеточном и организменном уровне.
Изложены аспекты влияния биотических факторов на формирование сообществ патогенных, условно-патогенных микроорганизмов в окружающей среде.
Изложены теоретические проблемы изучения аспектов формирования биологически активных веществ с противомикробным действием у растений Юго-Восточного региона европейской части России. Изучены природно-экологические особенности формирования противомикробных компонентов в растениях и запасы в природном комплексе региона. Исследованы и предложены биотехнологические особенности выделения и извлечения из растений противомикробных компонентов различного состава. Представлены результаты исследования in vitro и in vivo противотуберкулезной, противолепрозной и другой противомикробной активности экстрагируемых компонентов некоторых растений.
В работе раскрываются научные основы применения стандартных фитокомпонентов для дальнейшего использования противомикробных фитопрепаратов в производстве пищевых, медицинских, ветеринарных и парфюмерно-косметических биопрепаратов. Охарактеризованы основные противомикробные, антимикобактериальные, иммунопротективные, гиппо- и антиаллергенные компоненты растений Астраханской области. Оценены запасы лекарственного сырья в Астраханском регионе, доступные и оригинальные способы экстрагирования. Определены ареалы распространения и места возможных сборов растений с ценными свойствами, что делает Астраханскую область вполне достойным регионом с лекарственным растительным потенциалом.
Практическая значимость работы. Изучены и представлены запасы растительного сырья некоторых лекарственных растений Астраханской области.
Определены наиболее значимые растения региона для биотехнологии создания оригинальных фитопрепаратов.
Исследованы и предложены биотехнологические особенности схем выделения и извлечения из растений противомикробных компонентов различного состава.
Исследованы и разработаны требования к сушке, сохранению и извлечению биологически активных компонентов с противомикробными, иммунопротективными, адаптогенными свойствами.
Представлены основные пути использования растений и их противомикробных веществ в биотехнологии создания физиологически активных компонентов для профилактики инфекционных процессов, в качестве консервирующих добавок к пище, добавок в косметической продукции, препаратов для санитарно-экологической очистки воды.
Выявлены механизмы накопления растениями высоких концентраций биологически активных веществ, в том числе антимикробных. Определены методы извлечения этих веществ оригинальными несложными способами, что позволило получить образцы фитопрепаратов с высоким антимикобактериальным, противостафилококковым и иммунопротективным эффектом.
Разработана научно обоснованная стратегия использования дикорастущих растений региона, выделения и изучения ценных растительных компонентов и разработки новых технологий получения оригинальных фитопрепаратов для оздоровления окружающей среды и организма человека.
Отработаны оригинальные методики экстрагирования противомикробных фракций, созданы новые формы фитопрепаратов и фитобальзамов на основе компонентов противомикробных веществ, выделяемых их лекарственных растений Астраханского региона.
Подготовлены для выпуска коммерческие формы фитопрепаратов с антибактериальной активностью: фитокапли «ГЛИЦИРФИТ» и фитобальзамы для регенерации кожи «ИНСОФИТ».
Внедрение результатов работы в практику. Доказана эффективность разработанных фитокомпозиций путем проведенных клинических испытаний противотуберкулезной и противолепрозной активности препарата « Экстракт солодки «ГЛИЦИРФИТ" в НИИ по изучению лепры г. Астрахань и на кафедре туберкулеза Астраханской Государственной медицинской академии (АГМА) г. Астрахань.
Проведены испытания и получены отзывы косметического фитопрепарата «фитобальзам для регенерации кожи «ИНСОФИТ».
Предложен методический подход для создания фитокомпозиций в практике косметологии, фитотерапии и фитопрофилактики и пищевых добавок.
Данные результаты позволяют обосновать перспективность создания на основе дикорастущих растений с лекарственными свойствами новых лекарственных форм с антимикобактериальной и иммунопротективной активностью для больных лепрой и туберкулезом.
Созданы композиции фитолектиновых фракций экстрактов растений для применения в качестве фитобиотиков и адсорбентов углеводсодержащих наркотических метаболитов и токсинов.
По результатам комплексных опытно-промышленных исследований разработана и утверждена нормативная документация для организации производства препарата «Экстракт солодки «ГЛИЦИРФИТ» и серии фитобальзамов «ИНСОФИТ».
Разработаны и утверждены технологические условия (ТУ) и технический регламент на ряд биопрепаратов из растений с антимикробными свойствами, осуществлены госрегистрации, санитарные разрешения для производства.
Создано предприятие по научно-практическому изучению и применению растительных противомикробных компонентов и предприятие по сбору и созданию активных фармацевтических субстанций из корня солодки и других перспективных растений Астраханской области.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на российских и международных конференциях, симпозиумах, съездах и конгрессах: ежегодных научных всероссийских и международных конференциях Астраханского государственного университета (АГУ) (Астрахань, 1991-1999 2000-2010 гг.), ежегодных международных конференциях «Эколого-биологические проблемы Волжского региона и Северного Прикаспия» (Астрахань 2000-2010 гг); Всесоюзная конференция «Астраханский край: История и современность» (Астрахань, 1997); Всесоюзная научная конференция «Азотосодержащие гетероциклы, синтез, свойства, применения» (Астрахань, 2000); Международная научная конференция «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001); Всесоюзная конференция «Проблемы строительства, инженерного обеспечения и экологии городов» (Пенза, 2001); VII международная конференция «Математика. Компьютер. Образование» 31 января- 5 февраля (Пущино, 2001); Международная конференция «Фитопатогенные бактерии, фитонцидология. Аллелопатия» (Киев, 2005); Международная конференция «Аллелопатия. Фитонцидология» (Киев, 2006); Международная конференция «Биоресурсы биотехнологии, экологического безопасного развития регионов Юга России» (Сочи, 2007); 1-й международной конференции по изменениям среды Каспийского региона 24-25 августа (Балбосар, Иран, 2008); 15-м Российском национальном конгрессе «Человек и лекарство». (Москва, 2008); Международной научно-практической конференции, посвященной 60-летию института по изучению лепры и 85-летию противолепрозной службы России (Астрахань, 2008); Международном конгрессе по биотехнологии (Москва, 2008); Международной научно-практической конференции «Биотехнология. Вода и пищевые продукты 11-13 марта (Москва, 2008); Международной конференции с элементами научной школы для молодежи «Экокультура и фитобиотехнологии улучшения качества жизни на Каспии» 7-10 декабря (Астрахань, 2010); выставке Каспийского инновационного форума 8-9 февраля (Астрахань, АГУ, 2009); Каспийском инновационном форуме «Инновации для бизнеса» 22-23 апреля (Астрахань, АГТУ, 2010); на 5 съезде биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова 14-16 октября (Москва, 2008), в научно-практическом семинаре с международным участием «Настоящее и будущее биотехнологии в решении проблем экологии, медицины, сельского, лесного хозяйства и промышленности» 18-20 мая (Ульяновск, 2011) в Российско-японском центре (Москва, 2011), 4-м международном конгрессе европейских микробиологов в Женеве «4th Congressof European Microbiologists» (Швейцария) 26 – 30 июня (2011), VII международной научной практической конференции «Новината за напреднали наука – 2011» 04-06 сентября (София, 2011); VII научной конференции «Efektivni nastroje modernich Ved – 2011» 27апреля-05 мая (Прага, 2011).
Публикации. Опубликовано 140 печатных работ, в том числе по теме диссертации 90, из них 19 статей в ведущих рецензируемых журналах, рекомендованных ВАК РФ для опубликования результатов диссертационных работ, 6 в зарубежной печати, 4 патента, монография в соавторстве.
Объем и структура диссертации. Работа состоит из введения, материалов и методик, 13 глав собственных исследований, заключения, выводов, практических рекомендаций, списка литературы из 572 наименований, в том числе: 329 отечественных работ и 243 зарубежных. Диссертация изложена на 362 страницах основного текста, содержит 162 рисунка и 86 таблиц.
Исследования противомикробной активности растительных экстрактов методом КОЕ
Одной из проблем применения растений в народной медицине в быту и для здоровья человека является использование различных компонентов в сочетаниях, частей и целых растений для лечения различных заболеваний. С развитием медицинской и фармацевтической химии многие натуральные препараты со сложностями хранения и неустойчивым действием были заменены на синтетические и успешно применялись в традиционной медицине. Однако, через некоторое время специалисты стали обнаруживать массу побочных влияний химических препаратов на органы и ткани человека, вызывающих токсическое действие, аллергизацию организма, развитие новообразований, изменение физиологических функций (Лавренов и др., 2006).
В связи с этим, в последние несколько десятилетий осуществляются новые поиски безопасных для организма экологичных натуральных (растительного, животного, бактериального или нанопроисхождения) препаратов. Вследствии ряда причин в медицине, биотехнологии, фармакологии, косметологии и разработке пищевых добавок возник новый виток использования растений в производстве средств растительного происхождения. Направленность разработчиков на использование многих растительных компонентов и их композиций в косметологии привела к развитию нового направления для лечения кожных проблем косметическими средствами с растительнми активными веществами, это новое направление получило название косметицевтика (космецевтика). Поэтому, в наше время важнейшей задачей науки и практики является изучение флоры с целью широкого использования в народном хозяйстве, пищевой промышленности, косметологии и медицине (Соколов и др., 1998).
Известно, что биологически активные вещества растительного происхождения обладают множеством полезных качеств, как для самого растения, так и для организма человека. В связи с этим, в последнее время очень широко распространяются перспективы применения препаратов натурального растительного происхождения в качестве биологически активных добавок и других препаратов в практике медицинской, пищевой, фармацевтической, косметологической промышленности. Для этого выделяются разнообразные химические вещества из разных растений. К лекарственным растениям, изучаемым в таких исследованиях, относятся и растения Астраханского региона, проявляющие в многочисленных исследованиях противомикробную активность за счет содержания в них некоторых химических биологически активных веществ. Поиск лекарственных средств из растительного сырья в последние годы особенно привлекает исследователей. Растительные препараты обладают рядом положительных свойств. Это и высокая эффективность при низкой токсичности, комплексное гармонизирующее влияние на организм, широкий спектр действия при относительной дешевизне (Сухенко, 2011).
В последние десятилетия прошлого столетия ознаменовались развитием инфекционных заболеваний в мире и крупными достижениями в области лечения заболеваний, вызываемых различными инфекционными агентам. К числу таких достижений относятся создание антибиотиков и синтетических химических средств, воздействующих на патогенный возбудитель. Однако постоянное и широкое применение антибиотиков и химических терапевтических средств приводит к ряду последствий и осложнений в организме после их применения. К таким осложнениям относятся возникновение аллергических реакций от применения большинства антибиотиков и, как следствие, аллергизация населения, особенно детей. Часто специалистами обнаруживается наличие серьезных побочных токсических влияний на системы и органы. Серьезные проблемы вызывает развитие лекарственной резистентности микроорганизмов к известным синтетическим антимикробным средствам, в связи с уменьшением нормального состава автомикрофлоры и увеличением спектра патогенной микрофлоры, возникшей из условно-патогенных микроорганизмов. Последствия после применения химических антибиотиков часто приводят к возникновению новых инфекционных процессов, дисбактериозов, бактерионосительства и выделения патогенного возбудителя в окружающую среду (Максютина, 1985). Поэтому разработка оригинальных антимикробных средств иной природы; с новыми свойствами и другим механизмом действия являются наиболее перспективным направлением. В связи с этим, в последнее время актуальным оказалось исследование лекарственных свойств многих растений дикорастущей флоры с противомикробными, иммуномодулирующими и иммуногенными свойствами, известные науке активные вещества с антибактериальным действием, и некоторые белковые соединения (лектины), которые являются аналогами антител животных и человека (Сухенко и др., 2009). Причины изменчивости химического состава лекарственных растений Образование и накопление в лекарственных растениях фармакологически активных веществ являются динамическим процессом, изменяющимся в онтогенезе растения, а также зависящим от многочисленных факторов внешней среды. В ходе онтогенеза растение проходит фазы вегетативного развития, цветения и плодоношения. Онтогенез, естественно, сопровождается характерными изменениями обмена веществ, причем изменения в обмене белков и углеводов, липидов (а также ферментов и их коферментов -витаминов) влекут за собой изменения и в динамике образования продуктов вторичного синтеза (алкалоиды, гликозиды, терпены, фенольные соединения и др.). К признакам онтогенетического характера нужно отнести, прежде всего, специфичность качественного образования определенных групп фармакологически активных веществ в систематических подразделениях растений (виды, роды, семейства, классы). Общеизвестно, что имеются группы растений, в которых накапливаются преимущественно эфирные масла, в других алкалоиды и т. п.. Образование одного и того же химического вещества в родственных растениях возможно лишь в силу того, что у филогенетически близких видов существуют одни и те же ферменты, вызывающие образование сходных веществ, иначе говоря, сходность в протекающем процессе обмена веществ. Другой онтогенетической особенностью является неравномерность распределения и локализации биологически активных веществ по органам и тканям растения, например, алкалоиды в хинном дереве накапливаются в коре, а в древесине их почти нет, в наперстянке сердечные гликозиды накапливаются преимущественно в листьях, а эфирное масло у зонтичных локализуется в плодах и др.. Более того, качественный состав фармакологически активных веществ может быть различным у одного и того же растения. Так, например, в подземных органах солодки образуется глицирризиновая кислота, а в надземных частях ее нет или мало, там содержатся другие тритерпеновые соединения (Муравьева и др., 2002).
Таким образом, наблюдается родовое накопление биохимических, а так же и физиологических признаков, которые передаются растениям одного вида или рода и является помимо морфологического сходства, основой родственных связей в родовой или более крупной систематической единице. Известны виды лекарственных растений, не отличающиеся по морфологическим признакам, но резко отличаются по качественныму составу суммы действующих веществ (например, суммы алкалоидов), их называют хеморасы, признаки которых передаются по наследству (Блинова и др., 1990).
Отмечено, что растущие рядом особи одного и того же вида могут значительно отличаться по количеству образующихся в них действующих веществ. Это свойство является наследственным, и потомство этих особей будет также отличаться высоким (или низким) содержанием действующих веществ даже в случае переноса их в другие климатические зоны.
Динамика образования действующих веществ также подчиняется онтогенетическим закономерностям. На выход действующих веществ влияют возраст растений, времена и месяцы года, а для эфирно-масличных растений -даже различные часы дня. На содержание действующих веществ существеннейшее влияние оказывает фаза развития растения. От фазы развития растения зависит не только количественный, но и качественный состав действующих веществ, например эфирное масло кориандра, состав которого в период молочной спелости плодов отличается от состава в период их полной зрелости, или количество ментола (свободного и связанного) в эфирном масле перечной мяты непрерывно увеличивается в период ее цветения.
Спектр химической изменчивости еще больше изменяется у лекарственных растений под влиянием факторов внешней среды. Многие авторы выделяют фактор питания лекарственных растений и значения почвы как источника питательных веществ и как физической среды с определенным механическим составом, прогреваемостью, с определенной наличностью воды, газов и микрофлоры, а самое главное по наблюдениям многих авторов,растения являясь живыми организмами реагируют на изменения внешней среды (на экологию воздуха, почвы, на окружающий микробный состав, в том числе патогенных микроорганизмов, синтезом и выделением специфических защитных химических веществ. Например, инсектицидная далматская ромашка (Pyrethram cinerariifolium Trev.) на родине в Далмации успешно растет на солнечных склонах с каменистой почвой. Большинство ксерофитных ароматических растений предпочитает сухие каменистые почвы, например, чабрец, лаванда и др. Нитратолюбивые растения, такие как крапива (Urtica dioica L.), пастушья сумка (Capsella bursa pastoris Medic.) и др. растут на удобренных почвах. На солонцах и солонцеватых почвах большие массивы
Разработка методов и специальных условий воздушно-теневой сушки, технологий измельчения растительного материала
В работе была использована методика равновесного определения экстрактивных веществ в сырье. По этой методике 2,0 г сырья измельчали в микроизмельчителе до порошка, помещали в колбу на 250 мл, заливали до наступления равновесия (4-5 ч). Время наступления равновесия определяли экспериментально. Отфильтровывали часть вытяжки, из фильтрата отбирали 25 мл вытяжки, помещали в бюкс, выпаривали и затем высушивали при температуре 100С, затем охлаждали в эксикаторе и взвешивали. Проводили расчет определения сухого остатка. масса сухого остатка, а — навеска сырья. Рисунок 4.1.3. Вычисление массы сухого остатка Воспользовавшись рекомендациями Пономарева, что плотность экстрактов сырья находится в прямой зависимости от их концентрации, дополнительно определяли содержания экстрактивных веществ по интенсивности окраски экстрактов.
Определяли доброкачественность сырья и препаратов природных растительных соединений по формуле доброкачественность сырья А представляет собой отношение содержания действующих веществ а к количеству экстрактивных веществ Ъ. Рисунок 4.1.4. Вычисление доброкачественности сырья
Для отработки технологии извлечения часть измельченного растительного сырья помещали после взвешивания в склянки с темным стеклом в определенных соотношениях. Затем заливали специальным веществом для исследования сохранности сырья и экстрагирования биологически активных веществ (БАВ) каждого растения и закрывали склянки плотно. Склянки ставили в темное место на 10 дней при постоянном каждодневном перемешивании. Сырье и экстрактант смешивали в соотношении 1 часть растительного сырья + 5 частей растворителя (стабилизатора-экстратанта). После 10-ти дневной экспозиции растительное сырье отжимали в специальном прессе, взвешивали и рассчитывали % впитывания экстрактанта в сырье (гигроскопичность) и сохранность массы сырья.
Исследуемыми жидкостями для сохранения БАВ растений были выбраны вещества маслянистой, спиртовой и буферной консистенции. Такими жидкостями были выбраны масла с различной вязкостью (вазелиновое масло, оливковое масло); глицерин (10%) - органический трехатомный спирт -компонент основных мембранных липидов; этиловый спирт (70% и 40%) -основной растворитель и фиксатор; диметилсульфоксид (10%) (ДМСО) -органический растворитель; кальциево-калиево-натриевый фосфатный буфер -наиболее физиологичный минеральный компонент клеточного сока с ph 6,8; а так же применялось экстрагирование дистиллированной водой при комнатной температуре или кипячении и при помощи водяного пара (Хаззаа с соавт., 2003.).
Измельченное растительное сырье травы и соцветий взвешивали, затем смешивали с жидкостями и, после 10 дней экспозиции и отжима на прессе, взвешивали и рассчитывали % впитывания экстрактанта в сырье и сохранность массы сырья.
Одним из способов экстракции была водная экстракция высушенного растительного сырья цмина песчаного и тысячелистника мелкоцветкового. Для приготовления экстракта брали 3 грамма сырья цмина песчаного, заливали 200 мл холодной дистиллированной воды, нагревали до температуры 90С и настаивали в течении 45 минут на водяной бане, после этого экстракт процеживали через марлю. Таким же образом готовили экстракт тысячелистника мелкоцветкового (Сухенко и др., 2007).
Следующим видом экстракции была экстракция водяным паром. Для этого цветки тысячелистника и бессмертника, высушенные и измельченные, помещали в сосуд из термостойкого стекла, наливали небольшое количество воды, нагревали до кипения (100 С), затем эту кашицу наносили на сеточку, которую помещали над нагревательным прибором с емкостью с водой. Частицы пара из кипящей воды поднимались и проходили через сеточку с кашицей лекарственного сырья и далее оседали на стеклянном колпаке, которым было накрыто это приспособление. Экстрагируемые этим способом вещества под колпаком оказывали действие на микрофлору воздуха, осевшую на питательную среду МЛА в чашке Петри, которую предварительно оставляли открытой в помещении для оседания на среду МПА микрофлоры воздуха этого помещения. Чашку Петри со средой МПА накрывали крышкой и ставили под колпак, в котором проводили паровую экстракцию биологически активных веществ тысячелистника и цмина для оценки противомикробной активности исследуемых компонентов.
Следующую экстракцию проводили в растворах 40% и 70% этилового спирта в дистиллированной воде. После приготовления соответствующего раствора этилового спирта, эти растворы применялись для экстракции биологически активных веществ цмина песчаного, тысячелистника мелкоцветкового, солодки голой. Так, экстракты раствором 40% этилового спирта проводили в соотношениях 1 : 5 и 1 : 10, где 20 г сырья заливали 100 мл раствора или 10 г сырья заливали 100 мл раствора. После чего, смесь тщательно перемешивали, погружали в темную склянку и оставляли на 7-10 дней в темном месте при постоянном помешивании, в некоторых опытах настаивание проводили в течении 2 недель. После окончания времени экстракции, процеживали жидкость с экстрагируемыми компонентами от растительного сырья (отжима). Растворенные растительные вещества (компоненты экстрактов) помещали во флаконы под ватными пробками и в термостате нагревали 3-5 кратно при температуре 100С и давлении 0,5 атм. для полного испарения остатков спирта.
Следующим видом экстракции была буферная экстракция. Для этого готовили специальный 0,01 М буферный раствор со стабильным значением рН =7,4. Этим буферным раствором заливали приготовленное и высушенное растительной сырье в соотношение 1 : 5 в темные склянки, смесь постоянно перемешивали при температуре 20С в течение 10 дней для экстракции биологически активных веществ. Целью этой экстракции было выделение белков, способных образовывать комплексы с солями кальция и магния (предположительно белков-лектинов). Через 10 дней экстракционная жидкость, содержащая экстрагируемые вещества отфильтровывалась от отжима, после чего подвергалась стерилизации. Для сохранности и стандартизации фитомассы подземной части солодки голой, измельченные корни и корневища были помещены в разные растворители (вещества) и после 10 дней оценено изменение массы измельченного сырья (табл.4.1.1).
Изучение химического состава компонентов растительных жидких и масляных экстрактов
В результате изучения экстрактов некоторых древесных растений Ailanthus altissima, Robinia pseudacacia, Sophora japonica, Salix alba L. в отношении микрофлоры воды было обнаружено подавление развития и размножения многих видов микроорганизмов во всех водоемах.
Результаты, изложенные выше объясняют избирательность выраженного ингибирующего воздействия различных экстрагируемых веществ, особенно Robinia pseudacacia и Sophora japonica. Наиболее стабильное противомикробное действие оказали биологически-активные вещества Ailanthus altissima. Однако, Salix alba L. содержит вещества со стабильным, несколько слабее выраженным бактерицидным эффектом. Раскрыты механизмы саморегулирования состояния водоемов и процессо оздоровления водной среды при участии противомикробных веществ многих исследуемых растений. Обнаружена возможность применения выделяемых биологически активных веществ растений для биотехнологии очищения водоемов и микробной очистки питьевой воды
При использовании экстрактов из соцветий цмина песчаного и тысячелистника мелкоцветкового, соцветий и семян солодки голой, водныхи буферных экстрактов соцветий цмина песчаного и тысячелистника мелкоцветкового, соцветий и семян солодки голойтак же доказан механизм подавления как патогенной, так и сапрофитирующей микрофлоры воды. Была разработана биотехнология доочистки водопроводной, технической воды и сточных вод от микрофлоры. Были созданы мини-наборы для ступенчатой очистки воды от стафилококков экстрактами тысячелистника или бессмертника, от микобактериальных загрязнений экстрактами солодки голой, для подавления обшего микробного числа (ОМЧ) экстрактами софоры японской, робинии псевдоакации или айланта высочайшего.
Исследования данного раздела относится к области медицины, а именно и фитотерапии и представляет собой лекарственное средство растительного происхождения, и может быть использовано в качестве профилактического средства противотуберкулезного действия в виде биологических добавок.
Фтизиатрия испытывает трудности, связанные с особенностями современного туберкулеза: резкое повышение практически всех показателей распространенности инфекции, высокий удельный вес активных и хронических деструктивных процессов с массивным бактериовыделением, недостаточная результативность специфической терапии, обусловленная нарастанием резистентности возбудителя к традиционным противотуберкулезным препаратам (Васильев, Гришко, 1996.).
В состав большинства противомикробных средств местного и организменного действия входят антисептики химического происхождения, которые являются для организма ксенобиотиками и обуславливают дополнительное напряжение его метаболизирующих и элиминирующих систем, и являются причиной развития побочных реакций, особенно у детей и больных хроническими заболеваниями.
В данной работе проводилось выделение растительных веществ для создания натурального растительного средства, обладающего значительным противотуберкулезным действием и не вызывающего побочных явлений при введении в организм.
Действие препарата достигается содержанием в растительных веществах известных биологически активных веществ - глицирризина, флавина, флавонолов, флавонов, флавоноидов, флавоновых глигозидов, терпенов, смол, терпеноидов, эфирных масел, дубильных веществ и др. Кроме того, экстрагируются компоненты растительных веществ, содержащих новые биологически активные вещества, обладающие специфическими ингибирующими антимикобактериальными свойствами (лектиноподобные белки растительного происхождения, связывающиеся с поверхностными углеводами антигенных детерминант клеток микобактерий туберкулеза (рамнозой и глюкозой) и инактивирующие их. (Сухенко, Назарова, Бовин. 2001, Сухенко, 2011).
Выделение противотуберкулезных веществ проводится из солодки голой {Glycyrrhiza glabra) и других растений Астраханского региона. Уникальность Астраханского региона заключается в наборе всех благоприятных факторов (высокая инсоляция, высокий уровень сезонных температур, низкая влажность, особенности ландшафта) для накопления дикорастущими растениями полного набора активных веществ в высоких концентрациях, что, несомненно, является определяющим фактором в создании оригинальных биопрепаратов со значительно более высокой антибактериальной активностью, по сравнению с известными свойствами подобных растений, а иногда и известных химических антибиотиков.
Согласно биохимическим результатам, прендставленным в данной работе и литературным данным (Муравьева и др., 1980) в водно-спиртовых экстрактах (40% раствор спирта) предлагаемых растительных препаратов выделялись следующие биологически активные вещества: в экстрактах корня, Glycyrrhiza glabra содержались: тритерпеновый сапонин - глицирризин, а также Са и К соли глицирризиновой кислоты с высоким процентным содержанием, агликон глицирретовой кислоты (сапогенин тритерпенового строения), желтый гликозид - ликвиритин (флавин), флавонолы (агликоновые и гликозидные соединения, халконы, флаваны), флавоноиды, дубильные вещества; в экстрактах наземной части Glycyrrhiza glabra выделялись кроме предыдущих флавоноиды (кверцетин, изокверцетин, темиферол, вещества.
Антимикобактериальную активность изучали на музейных культивируемых штаммах микобактерий туберкулеза Mycobacterium tuberculosis H37R.V и Mycobacterium lufu по методу серийных разведений сначала на жидкой среде Школьникова, затем на твердой среде Левенштейна - Иенсена. Микобактерий сначала культивировали в жидкой среде в присутствии компонентов препаратов из солодки голой, цмина песчаного, тысячелистника мелкоцветкового и без них, затем производили пересев на твердую среду для наблюдения за ростом микобактерий с активными веществами растений и без них.
Сравнительная противомикробная активность буферных экстрактов некоторых растений семейства Asteraceae, семейства Fabaceae, семейства Тіїіасеає, семейства Salicaceae против Staphylococcus aureus
Изучение противолепрозной активности препаратов из отобранных растений и экстракта солодки «ГЛИЦИРФИТ» проводилось в сравнении с традиционными противолепрозными средствами антибиотического свойства.
Исследования были проведены для решения вопроса противомикобактериальной активности экстрагируемых растительных компонентов и возможности использования бактерицидных свойств солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.), бессмертника песчаного (Helichrysum arenarium (L.) moench) и тысячелистника мелкоцветкового (Achillea micrantha M.B.) в препарате «фитокапли «ГЛИЦИРФИТ» для лечения экспериментальной лепры в комплекспе с основными противолепрозными средствами.
Учитывая особенности накопления лекарственных веществ растениями дикорастущей флоры Астраханской области, изучение возможности применения лекарственных растений, в том числе препарата «экстракт солодки «ГЛИЦИРФИТ» из корня солодки голой (Glycyrrhiza glabra) в качестве дополнительного средства в противоинфекционной терапии остается актуальным.
Предпочтение в использовании именно биологически активных веществ растений связано с их высокой активностью по отношению к патогенным микробам и меньшей степенью резистентности их к веществам, содержащимся в растениях.
По нашему мнению и литературным данным (Казаринова, 1971; Максимов, 1992) вещества, входящие в состав растений, принципиально более родственны живому организму по своей природе, нежели синтетические препараты. Как следствие, при их применении сравнительно редкие случаи индивидуальной непереносимости и проявление нежелательных патологических эффектов возникающих во время лечения проявлений в виде дисфункции нервной системы, желез внутренней секреции, печени, желудочно-кишечного тракта, нарушения нормального кроветворения и т.д.
Было показано, что клетки микобактерий под воздействием биологически активных веществ растений подвергаются изменениям. Обнаружено, что клетки Mycobacterium leprae под влиянием экстрактов из соцветий бессмертника песчаного (Helichrysum arenarium (L.) Moench), тысячелистника мелкоцветкового (Achillea micrantha M.B.) и корня солодки голой (Glycyrrhiza glabra L.), подвергаются фрагментации, а основные структурные компоненты этих клеток (клеточная стенка, плазматическая мембрана, цитоплазма, рибосомы, включения) разрушаются. Помимо того, что данные вещества экстрактов действует непосредственно на клетки микобактерий, они могут действовать и опосредованно через фагоцитарную активность иммунных клеток, стимулируя тем самым клеточный иммунитет (Назарова, Сухенко, Маслов, 2008).
В данном разделе проведены исследования терапевтической эффективности фитосборов из соцветий бессмертника песчаного (К arenarium), тысячелистника мелкоцветкового (A.micrantha) и корня солодки голой (G. glabra) в сравнении и комбинации с диаминодифенилсульфоном (ДЦС) или рифампицином (РФП) для лечения лепры в эксперименте.
В данных экспериментах использовались 400 мышей линии СВА, обоего пола весом 25-30 г, сопоставимых по массе и условиям содержания. Животных заражали интраплантарно (модель лепры Шепарда (Шепард , 1968) взвесью возбудителя лепры {Mycobacterium leprae), выделенных от больного лепрой лепроматозного типа и пассированных трехкратно на экспериментальных животных. Доза инфекта составила 104 микробных тел на мышь. В каждой из двух серий экспериментов все животные были разделены на четыре группы и заражены одним штаммом М. leprae. Первая группа мышей первой серии через 3 месяца после заражения получала фитосбор через зонд в желудок ежедневно по 0,5 мл/кг веса мыши.
Мыши второй группы через 3 месяца после заражения получали фитосбор в той же дозировке и ДЦС в дозе 100 мг/кг комбикорма. Мыши третьей группы получали только ДЦС. Четвертая группа зараженных мышей в качестве плацебо получала через зонд в желудок дистиллированную воду.
Во второй серии экспериментов первая группа животных, спустя 3 мес. после заражения, получала через зонд в пищевод ежедневно фитосбор в той же дозе. Мыши второй группы получали ежедневно фитосбор и РФП в дозе 25 мг/ кг массы тела, вводимый через зонд в желудок 1 раз в неделю. Мыши третьей группы получали только РФП. Четвертая группа животных в качестве плацебо получала через зонд дистиллированную воду. Через 3, 6 и 9 мес. с начала лечения у мышей брали кровь и воспалительный инфильтрат (объем выборки (п)=\0). Подсчитывали количество M.leprae в подушечках лап мышей (Shepard., 1968, Меньшиков, 1987). Определяли активность миелопероксидазы нейтрофильных гранулоцитов крови, уровень гемоглобина, количество эритроцитов, лейкоцитов и лейкоцитарную формулу унифицированными методами.
Всех животных содержали при естественном освещении в стандартных условиях вивария. Все манипуляции осуществлялись согласно правилам GLP
Контролем служили зараженные M.leprae мыши, получающие основной противолепрозный препарат - диаминодифенилсульфон (ДЦС) и мыши не получающие лечения. Испытания препаратов проводили согласно руководству ВОЗ (Лабораторные исследования, 1987).
