Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. История изучения секции Platygalium рода Galium 12
1.1. Общая характеристика семейства Rubiaceae 12
1.2. Общая характеристика трибы Rubieae 13
1.3. Общая характеристика рода Galium 14
1.4. Общая характеристика секции Platygalium 16
1.5. Объем секции Platygalium 17
1.6. Фитогеография 19
1.7. Краткий обзор исследуемых видов 21
ГЛАВА 2. Материалы и методы 23
2.1. Территория исследований и изученные образцы 23
2.2. Изучение плодов 23
2.3. Изучение пыльцевых зерен 25
2.4. Анализ методами нумерической таксономии
2.4.1. Исследование морфологических признаков 26
2.4.2. Признаки вегетативных органов, цветков и плодов 27
2.4.3. Анализ морфологических данных 29
2.5. Молекулярно-генетический анализ 30
2.5.1. Выделение ДНК 30
2.5.2. Амплификация ДНК 31
2.5.3. Визуализация продуктов амплификации 31
2.5.4. Очистка ПНР - продукта, постановка сиквенсной реакции и секвенирование 32
2.5.5. Выравнивание последовательностей ДНК 33
2.5.6. Анализ молекулярных данных 33
ГЛАВА 3. Морфология плодов подмаренников {Galium L., Rubiaceae) секции Platygalium и ее значение для систематики 35
3.1. Введение 35
3.2. Результаты и обсуждение
3.2.1. Форма плодов 36
3.2.2. Размеры плодов 36
3.2.3. Характер опушения плодов 36
ГЛАВА 4. Пыльцевые зерна Galium секции Platygalium 42
4.1. Введение 42
4.2. Результаты исследований пыльцевых зерен и их обсуждение
4.2.1. Полярность и симметрия 43
4.2.2. Форма пыльцы 43
4.2.3. Размер пыльцы
4.3. Число хромосом и полиплоидия 45
4.4. Заключение 51
ГЛАВА 5. Анализ видов Galium секции Platygalium по морфологическим признакам 53
5.1. Результаты анализа 53
5.2. Обсуждение результатов фенетического анализа 62
ГЛАВА 6. Молекулярно-филогенетический анализ 71
6.1. Введение 71
6.2. Результаты и обсуждение
6.2.1. Филогенетический анализ 72
6.2.2. Анализ методом статистической парсимонии в программе TCS 74
6.2.3. Филогеографический анализа 76
6.3. Заключение 81
ГЛАВА 7. Ключ для определения и описания видов секции Platygalium рода Galium в Восточной Европе и Северной Азии 82
7.1. Ключ для определения видов 82
7.2. Описания видов 84
Выводы 92
Список литературы
- Общая характеристика рода Galium
- Признаки вегетативных органов, цветков и плодов
- Форма плодов
- Число хромосом и полиплоидия
Общая характеристика рода Galium
Из различных обзоров следует, что группа содержит по меньшей мере 70 видов. Все они обоеполые, имеют сухие плоды, которые могут быть голыми, покрытыми крючковидными или простыми волосками (Победимова, 1958; Ehrendorfer et al, 1976; Dempster, 1968, 1978, 1981, 1982; Ehrendorfer and Schdnbeckemesy, 1982; Yamazaki, 1993; Ehrendorfer et al., 2005).
В работах Boissier (1881) сообщается о 3 видах внутри группы Eugalium подгруппы Platygalia: G boreale L., G rubioides L. и G valantioides M. Bieb. (Табл. 1).
В обработке рода Победимовой во «Флоре СССР» (1958) сообщается об 11 видах секции Platygalia, которые делятся на 3 группы: Rubioidea, Borealia и Valantioidea (Табл. 1). Группа Rubioidea включает в себя следующие виды: G rubioides L., G articulatum L., G. physocarpum Ledeb (=G. volgense Pobed.) и G ussuriense Pobed.. Группа Borealia включает в себя G boreale L., G amblyophyllum Schrenk, G turkestanicum Pobed., G amurense Pobed., G septentrionale Roem. et Schult. и G mugodsharicum Pobed.. Группа Valantioidea включает G valantioides M. Bieb.
В работе Эрендорфера (Ehrendorfer, 1976) сообщается о 9 видах секции Platygalium из Европы, а именно G paradoxum Maxim., G rotundifolium L., G scabrum L., G baillonii Brandza., G broterianum Boiss. & Reut., G boreale L., G rubioides L., G fruticosum Willd. и . ephedroides Willk. (Табл. 1).
В обработке Эрендорфера во «Флоре Китая» (Ehrendorfer, 2011) секция Platygalium разделена на 24 вида, а именно: G salwinense Hand.-Mazz., G crassifolium W.C. Chen, G linearifolium Turcz., G hirtiflorum Req. ex DC, G glandulosum Hand.-Mazz., G forrestii Diels., G rupifragum Ehrend., G morii Hayata, G tarokoense Hayata, G minutissimum T. Shimizu, G nankotaizanum Ohwi (вкл. G maborasense Masam.), G serpylloides Royle ex Hook, f., G kinuta Nakai & H. Hara, G hupehense Pamp., G kunmingense Ehrend., G formosense Ohwi (как G kwanzanense Ohwij, G Elegans Wall, ex Roxb., G yunnanense H. Hara & C.Y. Wu, G kamtschaticum Steller ex Schult. & Schult. f., G chekiangense Ehrend. (как G nakaii Kudo ex Hara), G platygalium (Maxim.) Pobed., G maximoviczii (Komarov) Pobed., G boreale L. и G turkestanicum Pobed. Однако из 11 видов секции Platygalium, упомянутых во «Флоре СССР» (Победимова, 1958), только G turkestanicum Pobed. и G boreale L. полностью приняты во «Флоре Китая» (Ehrendorfer, 2011), a G ussuriense Pobed. и G rubioides L. считаются синонимами G boreale var. lanceolatum Nakai и G boreale var. rubioides (L.) Celak соответственно.
Во мировом чеклисте видов Rubiaceae (Govaerts R. et al, 2011) большинство видов, описанных Победимовой во «Флоре СССР» (Победимова, 1958), были сведены в синонимы к G boreale L. или G rubioides L. Таким образом, G articulatum Lam., G physocarpum Ledeb., G volgense Pobed. и G mugodsharicum Pobed. в настоящее время рассматриваются как синонимы G rubioides, a G ussuriense Pobed., G amurense Pobed. и G septentrionale Roem. et Schult. - как синонимы G boreale L..
Однако тщательные морфологические исследования показывают, что подобный «объединительский» подход далеко не всегда правомерен. Так, Балде (2013) провёл сравнительный анализ и доказал видовую обособленность G amurense Pobed.OT близкородственного вида G boreale L. на основе морфологических и хорологических данных. В частности, стебель у G amurense на большей части своей длины голый, с войлочно-бархатистым кольцом под мутовкой, тогда как у G boreale он щетинисто опушенный. Листья у G. amurense голые, широколанцетные или эллиптические, на верхушке острые, с 3-5 жилками, с небольшими черешками, а у G boreale опушенные, особенно по краям и жилками, линейно-ланцетные, на верхушке тупые, с 3 жилками, без черешков. Соцветие G amurense представлено широкой щитковидной метелкой, а у G boreale узкой, удлиненной, слегка сжатой метелкой. Лопасти венчика G amurense продолговатые, суженные в тупой кончик, у G boreale яйцевидные заостренные на кончике. Кроме того, эти виды различаются степенью срастания столбиков и способом прикрепления тычинок: у Galium amurense столбик разделен в нижней трети, реже от основания, а местом присоединения тычинок к венчику являются края лопастей, а у G boreale столбик обычно двураздельный в верхней трети, реже от середины; тычинки прикреплены к венчику в 1-2 мм от края лопастей. Завязи и мерикарпии G amurense густо опушены прямыми щетинковидными шипами, а у G boreale густыми крючковатым шипами.
Таким образом, в систематике секции Platygalium на территории северной Евразии остается еще очень много неясного, а трактовки этой группы разными авторами до сих пор несовместимыми друг с другом.
Признаки вегетативных органов, цветков и плодов
Очистка ПЦР - продукта осуществлялась соответственно следующему протоколу. В пробирку с ПЦР - продуктом добавляли по 50 мкл теплой смеси ацетата аммония с этанолом на каждые 10 мкл ПЦР смеси. Пробирки вортексировали и высаживали смесь при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем пробы центрифугировали в течение 30 минут при 13400 оборотах в минуту. После этого аккуратно удаляли супернатант и промывали осадок 250-500 мкл охлажденным 70% этанолом, с последующим центрифугированием в течение 30 минут при 13400 оборотах в минуту.
Затем осадок высушивали в термостате при температуре 37-50С и растворяли в 20 мкл стерильной деионизированной воды. Качество очищенного ПЦР-продукта определяли с помощью электрофореза в 1% агарозном геле с окрашиванием бромидом этидия.
Постановка сиквенсной реакции осуществлялась с помощью набора реактивов ABI PRISM BigDye Terminator v. 3.1. Предподготовка: в стрипы вносили по 1 мкл прямого прайм ера с концентрацией 3,2 пмоль и 1-3 мкл очищенного ПЦР-продукта. Смесь выпаривали в амплификаторе MJ Research РТС-220 DNA Engine Dyad (Biorad Ltd., США) при температуре 55С. В каждую пробирку вносили по 10 мкл реакционной смеси, содержащей 1 мкл Dye-mix, 1,5 мкл буфера и 7,5 мкл стерильной деионизированной воды.
Условия ПЦР: предварительная денатурация -96С -2 мин; 30 циклов: денатурация 96С -20 с, 50С -10 с, 60С - 4 мин, 72С - 0 мин.
После амплификации в каждую пробирку вносили по 26,5 мкл теплой смеси, содержащей ацетат аммония и этанол. Смесь высаживали в течение 30 минут и затем центрифугировали в течение 30 минут при 13400 оборотах в минуту. После удаления супернатанта в пробирки вносили по 200 мкл холодного 70% этанола, стрипы встряхивали и центрифугировали в течении 30 минут при 13400 оборотах в минуту. Затем этанол удаляли, остатки этанола выпаривали при температуре 55 С в амплификаторе.
Определение нуклеотидных последовательностей ДНК проводилось с использованием ген-специфических праймеров и набора реактивов «Big Dye Terminator Cycle Sequencing Kit» V. 3.1 (Applied Biosystems, США) по методике производителя с последующим анализом продуктов реакции на автоматическом секвенаторе ДНК ABI PRISM 3730 Applied Biosystems на базе ЦКП «Геном» (Институт Молекулярной Биологии РАН им. В. А. Энгельгардта), в ПКЗАО «Синтол» (Москва) и кабинета молекулярных методов анализа ИПЭЭ РАН.
Полученное выравнивание последовательностей хлоропластного спейсера trnLrnF было проанализировано методами максимальной экономии в программе NONA (Goloboff, 1999) с использованием оболочки Winclada (Nixon, 1999-2002) с использованием параметров по умолчанию и методом статистической парсимонии (Templeton, 1992) в программе TCS v. 1.21 (Clement et al. 2000). Первый из методов позволяет строить филогенетические деревья, представляющие данные в виде дихотомически ветвящихся графов. Второй метод является одним из методов построения генеалогических сетей, представляющих данные в виде генеалогии гаплотипов, в которой сами гаплотипы могут располагаться не только на концах ветвей, но и во внутренних узлах сети, гомоплазии отображаются в виде замкнутых петель. Анализ географического распространения гаплотипов хлоропластного участка trnLrnF проводили путем картирования их на географическую карту.
Признаки плодов имеют важное значение для установления общих, частных и межвидовых различий внутри рода подмаренник. Плод в роде Galium сухой двусемянный невскрывающийся, из двух сросшихся мерикарпиев, в каждом мерикарпии имеется только одно семя. .
Для изучения плодов были использованы гербарные образцы, хранящиеся в Гербариях Главного Ботанического сада Российской Академии наук (ГБС РАН) и Ботанического института им. В. Л. Комарова РАН (LE). Все образцы были определены в соответствии с использованием ключей и описаний, приведённых во «Флоре СССР» (Победимова, 1958).
Для изучения были отобраны только зрелые плоды. Сухие плоды вымачивали в кипящей воде в течение 2-4 минут, чтобы компенсировать потерю веса при пересыхании, и рассматривали в световой стереомикроскоп; для каждого таксона было отобрано по 10-15 плодов, чтобы покрыть весь диапазон изменчивости. Калибровка измерений была проведена с помощью оптического микрометра.
Образцы были изучены также с использованием сканирующего электронного микроскопа LEO 1430 VP.
Сканирующая электронная микроскопия плодов и семян эффективный метод изучения и представления данных о морфологических особенностях поверхности семени (Heywood, 1969). (Abdelkhalik 2002, 2008) в своих работах предлагает метод SEM для исследования строения плодов и семян видов Brassicaceae и рода Galium как важный элемент таксономических исследований. Среди признаков опушения плодов для различения Galium amurense и Galium boreale важны отличия в строении волосков: у первого вида они длинные прямые, у второго длинные и на
Форма плодов
Растения 45-100 см высотой. Стебель голый, с кольцом густых коротких волосков только в узлах стебля ниже листьев. Листья с коротким черешком, широко ланцетные до эллиптических, 40-60 х 10-15 мм, с отношением длины к ширине 4-5:1, шероховатые только по краю листа; более или менее закругленные к верхушке, жилки 3. Соцветие широко овальное, раскидистое, составляет 1/10 -1/5 длины стебля; парциальные соцветия как терминальные, так и располагающиеся в пазухах верхних листьев. Цветоносы голые; цветоножки 1-3 мм, при созревании плодов удлиняющиеся до 4 мм. Венчик белый, 2,4 мм в диаметре, голый. Мерикарпии полушаровидные, 1-2 мм, голые. Пыльцевые зерна с полярной остью (Р) 17,46 - 18,62 щп, экваториальным диаметром (Е) 17,88 - 19,07 щп, Р/Е = 0,974. 2п = 4х. (по измерениям пыльцевых зерен). Цв. май-август, пл. июнь-октябрь. Распространение: Дальн. Восток: Уссур., сев. Китай. 5- Galium amurense Pobed. in V.L.Komarov, Fl. URSS 23: 716 (1958). Тип в Санкт-Петербурге (LE!), Описан с р. Бурей (дер. Бахарева)
Растения 25-80 см высотой. Стебель обычно голый, реже коротко опушенный, с более длинными щетинистыми волосками близ узлов. Листья на очень коротком черешке, продолговато ланцетные, (28-)30-50 х (6-)10-20(-25) мм, с отношением длины к ширине 2,5-3:1, постепенно заостренные к верхушке, голые; край с тонкими расставленными щетинками по краю, жилки 3 или 5. Соцветие представлено широкой щитковидной метелкой, составляет 1/8-1/6 длины стебля; парциальные соцветия как терминальные, так и располагающиеся в пазухах верхних листьев. Цветоносы опушенные, реже голые; цветоножки 2-3 мм, при созревании плодов удлиняющиеся до 4 мм. Венчик белый, 5-6 мм в диаметре, голый. Мерикарпии полушаровидные, 1-2 мм, густо покрытые длинными прямыми волосками. Пыльцевые зерна с полярной остью (Р) 15,79 - 21,26 щп, экваториальным диаметром (Е) 16,88 -21,44 щп, Р/Е = 1,021. 2п = 2х, 4х, 8х (по измерениям пыльцевых зерен). Цв. май-июнь, пл. июнь-июль. Распространение: Дальн. Восток, Камч., сев. Китай. 6- Galium amblyophyllum Schrenk in F.E.L.von Fischer & C.A.von Meyer, Enum. PI. Nov. 1:56(1841). Тип в Санкт-Петербурге (LE!), описан из Прибалхашья. Растения 10-50 см высотой. Стебель коротко опушенный, по ребрам шероховатый, с более длинными щетинистыми волосками близ узлов. Листья сидячие, узко линейные, 10-20 х (0,5-)1-2 мм, с отношением длины к ширине 5-10(-20):1, на верхушке тупые, с сильно отвороченными краями, жилка 1, шероховатая по жилке снизу. Соцветие верхушечное, метельчатое, узко продолговатое, составляет 1/6-1/5 длины стебля; парциальные соцветия как терминальные, так и пазушные. Цветоносы опушенные; цветоножки 0,5-2 мм, при созревании плодов удлиняющиеся до 3 мм. Венчик белый, 3-4 мм в диаметре, опушенный. Мерикарпии полушаровидные, 1-2 мм, густо покрыты короткими прямыми волосками. Цв. май-июнь, пл. июнь-июль. Распространение: Зап. Сибирь; Ср. Азия 7- Galium turkestanicum Pobed. in V.L.Komarov, Fl. URSS 23: 717 (1958). Тип в Санкт-Петербурге (LE!), описан из Джунгарского Алатау.
Растения 20-60 см высотой. Стебель обычно голый, реже коротко опушенный, с более длинными щетинистыми волосками близ узлов. Листья на очень коротком черешке, линейные до узко ланцетных, 27-50 х (3-)5-10 мм, с отношением длины к ширине 5-6:1, слабо суженные к притуплённой верхушке, шероховатые только по краю, жилка 1 или 3. Соцветие верхушечное, узко, сжатое, крупное, составляющее 1/4-1/2 длины стебля; парциальные соцветия как терминальные, так и располагающиеся в пазухах верхних листьев. Цветоносы голые; цветоножки 1-3 мм, голые, при созревании плодов удлиняющиеся до 4 мм. Венчик белый до бледно-желтого, 4-6 мм в диаметре, голый. Мерикарпии полушаровидные, 1-3 мм, покрыты длинными редкими крючковидными волосками. Цв. июль - август, пл. август - сентябрь. Распространение: Ср. Азия. 8- Galium septentrionale Roem. et Schult, Syst. Veg. 3: 253 (1818). Тип: в Берлине (BGBM). Описан из Северной Америки.
Растения 25-85 см высотой. Стебель обычно голый, реже коротко опушенный, с более длинными щетинистыми волосками близ узлов. Листья сидячие, продолговато-ланцетные, 5-7 х 0,5-1,3 cm, с отношением длины к ширине 5-7:1, длинно оттянуто заостренные и на верхушке часто притуплённые, голые или слабо опушенные до жестко опушенных; край шероховатый от вперед направленных зубчиков, жилки 3. Соцветие широкое, метельчатое, раскидистое, составляет 1/10-1/6 длины стебля; парциальные соцветия как терминальные, так и располагающиеся в пазухах верхних листьев. Цветоносы голые или коротко опушенные в узлах; цветоножки 0,5-2,5 мм, при созревании плодов удлиняющиеся до 3,5 мм. Венчик белый, 3-4 мм в диаметре, голый. Мерикарпии полушаровидные, 1-2 мм, опушенные умеренно густыми крючковидными волосками. Пыльцевые зерна с полярной остью (Р) 17,57 - 21,48 щп, экваториальным диаметром (Е) 18,64 - 21,37 щп, Р/Е = 1,008., 2п = 6х. Цв. май - июнь, пл. июль - август . Распространение: Сибирь, Дальний Восток, Центральная Азия, Северная Америка. 9- Galium valantioides M.Bieb., Fl. Taur.-Caucas. 1: 102 (1808). Тип: в Санкт-Петербурге (LE!), описан из Кисловодска.
Растения 10-40 см высотой. Стебель обычно голый. Листья сидячие, ромбически-Ланцетные, 20-50 х 5-15 мм, с отношением длины к ширине 3-4:1, острые, голые, по жилкам шероховатые на обеих сторонах лсита; край шероховатый от вперед направленных зубчиков, жилки 3. Соцветие верхушечное, щитковидное, составляет 1/10-1/7 длины стебля; парциальные соцветия как терминальные, так и располагающиеся в пазухах верхних листьев. Цветоносы голые или коротко опушенные в узлах; цветоножки 1-3 мм, при созревании плодов удлиняющиеся до 4 мм. Венчик белый, 2-4 мм в диаметре, голый. Мерикарпии полушаровидные, 1-2 мм, с бугорчатой поверхностью. Пыльцевые зерна с полярной остью (Р) 14,27-17,32 щп, экваториальным диаметром (Е) 12,77 - 15,64 щп, Р/Е = 1,076. 2п = 2х. Цв. май - июнь, пл. июль -август. Распространение: Кавказ.
Число хромосом и полиплоидия
Филогеографические паттерны, наблюдаемые в пределах комплекса G boreale G. rubioides были изучены путем рассмотрения частоты и географического распространения каждого гаплотипа, а также их встречаемости между разными видами и в пределах каждого вида. В сочетании с данными о генеалогических связях гаплотипов между собой эти данные позволяют определить возможные причины особенностей их географического распространения.
Анализ морфологических признаков отсеквенированных образов методом невзвешенного попарного среднего (UPGAMA) дал результаты, представленные на Рис. 23. Анализ включал Galium boreale из Восточной Европы, Сибири и Дальнего Востока, а также G rubioides и G articulatum. Анализ выявил их группировку в два кластера, I и П. Кластер I, прелставляющий G boreale, подразделяется далее на два подкластера (а и Ь), из которых первый представляет G boreale из Восточной Европы, а второй -G boreale из Сибири и Российского Дальнего Востока. Второй основной кластер (II) образован образцами G rubioides n G articulatum.
Такая топология указывает на совпадение результатов молекулярно-генетического анализа (Рис. 18-20) с результатами морфологического анализа (9 и 11), несмотря на то, что признаки европейских и азиатских популяций G boreale (гаплотипы А на рис. 22 и В на рис. 21-22 соотвественно) в значительной мере перекрываются (см. Табл. 6 на стр. 85). Европейская часть
Генеалогия хлоропластных (регион trnLrnF) гаплотипов комплекса G boreale G. rubioides, полученная методом статистической парсимонии. Цветом показано распространение гаплотипов в трех географических регионах. Рис. 21. Распространение гаплотипов на изученной территории. Google Maps Engine ЕЇТЗ
Фенограмма изученных образцов видов секции Platygalium, полученная при обработке матрицы морфологических признаков Установленные нами особенности географического распространения гаплотипов trnLrnF у видов Galium секции Platygalium на территории северной Евразии позволяют предположить, что более широко распространенный гаплотип А является более древним и маркирует широкое доледниковое распространение этой группы. Ограниченное Сибирью и Дальним Востоком распространение гаплотипа Е может указывать на разрыв ареала в ледниковое время в области Западной Сибири. Сходная картина наблюдается в распространении гаплотипов Clausia aprica (Franzke et al. 2004). С другой стороны, если рассматривать только G. boreale, хорошо заметно высокое гаплотипическое разнообразие этого вида на юге Сибири и Дальнего Востока, по сравнению с севером Азии и Восточной Европой. Это может указывать на послеледниковое расширение ареала этого вида на север. Однако вторичного контакта между сибирско-дальневосточными и восточноевропейскими популяциями, по-видимому, не произошло, на что указывают взаимоисключающие наборы гаплотипов, распространенных в этих частях ареала, за исключение реликтового гаплотипа А.
Выявленные в анализе 16 гаплотипов хлоропластного региона trnLrnF распространены по всей Евразии, но один из них (А) встречается преимущественно в Восточной Европе и представлен у большинства изученных видов. С другой стороны, гаплотип Е встречается только на территории Сибири и Дальнего Востока и представлен только у G boreale и G platygalium. Кластерный анализ морфологических данных методом UPGMA (см. главу 5) показывает результат, в значительной мере конгруэнтный молекулярным данным, выделяя в самостоятельный кластер сибирско-дальневосточную группу образцов G boreale.
Растения 20-70 см высотой. Стебель обычно голый, реже коротко опушенный, с более длинными щетинистыми волосками близ узлов. Листья сидячие, линейно-ланцетные до ланцетных, (15-)20-35(-60) х (2-)3-5 мм, с отношением длины к ширине 7-10:1, острые, голые или слабо опушенные до жестко опушенных; край шероховатый от вперед направленных зубчиков, жилки 3. Соцветие верхушечное, удлиненное или широко-метельчатое, составляет 1/10-1/6 длины стебля; парциальные соцветия как терминальные, так и располагающиеся в пазухах верхних листьев. Цветоносы голые или коротко опушенные в узлах; цветоножки 0,5-2 мм, при созревании плодов удлиняющиеся до 3,5 мм. Венчик белый до бледно-желтого, колесовидный, 3-4 мм в диаметре, голый. Мерикарпии полушаровидные, 1-2 мм, густо опушенные крючковидными волосками 0,3-0,5 мм дл. Пыльцевые зерна с полярной остью (Р) 16,68-18,83 щп, экваториальным диаметром (Е) 15,76-18,80 щп, Р/Е = 1,059. 2п = 2х, 4х, 6х. Цв. май-август, пл. июнь-октябрь. Распространение: Европа (часто на севере, редко в Средиземноморье), северная Азия.
