Содержание к диссертации
Введение
2. Биохимический полиморфизм в современных популяциях человека (обзор литературы)
2.1. Характеристика отдельных иммуно-биохимических маркеров. 20
2.2. Межпопуляционное и внутрипопуляционное генетическое разнообразие . 38
2.3 Анализ межпопуляционных различий методами многомерной статистики. 43
2.4 История формирования генофонда восточных славян и населения Белгородской области . 45
3. Материалы и методы 52-70
3.1 Описание объектов исследования. 52-53
3.2 Изученные популяции 53-57
3.3 Методы генотипирования генетико-биохимических маркеров 57
3.4 Методы математического анализа популяционно-генетических данных 67
4. Генетическая структура популяции белгородской области .
4.1 Изучение биохимического полиморфизма коренного русского и украинского населения Белгородской области. 71
4.2 Краткие итоги описания биохимического полиморфизма коренного русского и украинского населения Белгородской области.
4.3 Генетическая дифференциация коренного населения Белгородской области. 94
4.4 Анализ генной дифференциации русского населения 100-104
области на уровне сельсоветов с использованием методов математического моделирования.
4.5 Генетические расстояния и таксономический анализ русского населения Белгородской области на уровне сельсоветов . 104
4.6 Генетические расстояния и таксономический анализ коренного русского и украинского населения Белгородской области. 107
4.7 Генетические расстояния и таксономический анализ популяции Белгородской области с другими русскими популяциями. 109
4.8 Генетические расстояния и таксономический анализ популяции Белгородской области, некоторых русских популяций и популяций, относящихся к другим языковым семьям. 120
5. Структура генофонда коренного населения украины и Белоруссии
5.1 Изучение биохимического полиморфизма в популяциях украинцев и белорусов. 125
5.2 Генетические расстояния и таксономический анализ этногеографических групп Белгородской области, украинцев и белорусов. 138
Заключение 144-164
Выводы 165
Список литературы 166-186
Приложения 187-202
- Межпопуляционное и внутрипопуляционное генетическое разнообразие
- История формирования генофонда восточных славян и населения Белгородской области
- Методы математического анализа популяционно-генетических данных
- Генетические расстояния и таксономический анализ русского населения Белгородской области на уровне сельсоветов
Введение к работе
Актуальность проблемы.
Изучение генофонда населения, дифференциации и степени генетического сходства современных популяций является одной из ключевых задач популяционной генетики [2,22,29,67,97]. В мировой литературе накоплен обширный массив данных по распределению «классических» (т.е. иммуно-биохимических) маркеров среди всех народов ойкумены [11,12,13,137,140,144,145,152,158,164,169].
Интенсивно проводились популяционно-генетические исследования народов Северной Евразии. Внимание исследователей было сосредоточено на изучении генетического своеобразия народов Урала [50,51,100,129,130,134], Кавказа [24,65,68,69,126,127], Средней Азии [34,42,75,80,81,117], Сибири [55,56,85,111,112], Дальнего Востока [17,30,35,91,93,94,95113,114]. Изучены генофонды многих популяций, однако провести их корректный сравнительный анализ весьма затруднительно из-за отсутствия единой программы исследования. Каждый научный коллектив, занимающийся изучением полиморфизма классических маркеров, проводит исследование в популяциях по своему спектру маркеров. Лишь по 5-6 биохимическим и некоторым иммунологическим маркерам (ABO, RH, MN, LEW, KEL, HP, GCt TF, GLOl, PGM1, ACPI) может быть проведен сравнительный анализ генофондов большинства изученных популяций.
Русские - максимальный по численности народ нашей страны. Тем не менее, как отмечает Спицын В.А. [102], популяционно-генетические сведения о русском народе до сих пор остаются весьма фрагментарными, не систематизированными и разбросанными по различным литературным источникам. По мнению коллектива авторов «Генофонд и геногеография» из-за обширности ареала, сложности этнической истории, интенсивных изменений в структуре населения, миграции сельского населения в города и ряда других причин генофонд русского народа остается наименее исследованным и наиболее трудным для изучения. О многих его особенностях можно скорее дога дываться по свойствам генофондов окружающих народов, а не судить, опираясь на результаты прямого изучения, которое нельзя не признать неотложной задачей в генетике народонаселения нашей страны [27].
Из коренного русского населения, проживающего в пределах его «исконного» исторического ареала, по единому спектру 8-10 классических маркеров изучены лишь 10-11 популяций [7,8,9,77,99,102,131,132]. Генофонды других восточнославянских народов (украинцев, белорусов) изучены еще слабее. Согласно обширной сводке «Генофонд и геногеография народонаселения России и сопредельных стран» [27], популяции украинцев и белорусов исследованы главным образом лишь по пяти классическим маркерам (АВО, RH, HP, TF, GC).
До настоящего времени не изучены особенности структуры генофонда русских популяций, расположенных на границе с ареалами других восточных славян и сформировавшихся под влиянием не одного, а нескольких этносов. Моделью такой популяции может служить популяция Белгородской области, территориально расположенная на границе России и Украины.
Цель работы.
Изучение структуры генофонда коренного населения Белгородской области и определение его места в популяционнои системе восточнославянских народов по данным о полиморфизме классических генетических маркеров.
Задачи исследования.
Дать характеристику генофонда коренного русского и украинского населения Белгородской области по данным о распределении частот 33 аллелей 12 локусов классических (иммуно-биохимических) маркеров.
Оценить степень генетической дифференциации коренного населения Белгородской области как в целом, так и ее этнотерриториальных групп на разных популяционных уровнях (сельсоветы, районы).
Оценить место генофонда белгородской популяции в системе русского генофонда.
Изучить генетическую структуру популяций коренного населения Украины и Белоруссии по данным о распределении классических маркеров.
Рассмотреть место генофонда белгородской популяции в системе всех восточнославянских генофондов (русские, украинцы, белорусы).
Научная новизна.
Впервые (на модели населения Белгородской области) изучена структура генофонда популяции, располагающейся на стыке двух крупнейших восточнославянских народов. Получены данные о распределении 33 аллелей 12 иммуно-биохимических генных локусов среди коренного русского и украинского населения Белгородской области. Показана значимая этнотеррито-риальная вариабельность частот изученных аллелей. Оценен уровень генетической дифференциации коренного населения области. Выявлена генетическая эквидистантность на различных уровнях организации популяции (сельсовет, район).
Методами кластерного анализа, многомерного шкалирования, факторного анализа установлено четкое соответствие генетической дифференциации 10 локальных популяций (сельсоветов) их географическому положению и административной принадлежности.
Определено положение генофонда белгородской популяции в структуре русского генофонда.
Впервые изучена генетическая структура четырех основных региональных групп: коренного населения Украины (западные и центральные украинцы) и Белоруссии (северные и полесские белорусы) по единому большому спектру биохимических маркеров, полностью соответствующему анализу генофонда Белгородской области.
Установлено, что население Белгородской области генетически наиболее близко к популяциям украинцев, образуя общий «южный кластер». Популяции белорусов, формируя самостоятельный «северный кластер» восточных славян, являются генетически далекими как от населения Белгородской области, так и от коренного населения Украины.
Научно-практическая значимость работы.
Изучена генетическая структура коренного русского и украинского населения Белгородской области по единому большому спектру иммуно-биохимических маркеров. Выявлены особенности биохимического полиморфизма как среди русского, так и среди украинского населения области.
Проведена оценка генетической дифференциации коренного населения Белгородской области. Доказано наличие четкой подразделенности между коренным русским населением двух районов области. Выявлено значимое влияние на ее формирование географических расстояний между сельсоветами этих районов.
Исследован генетико-биохимический полиморфизм коренного населения Украины и Белоруссии и проведен их сравнительный анализ. На основе полученных данных установлено положение генофонда белгородской популяции в системе русского, украинского и белорусского генофондов.
Полученные данные послужат основой для генетического и эколого-генетического мониторинга населения Белгородской области и восточных славян в целом.
Положения, выносимые на защиту.
Генофонд коренного русского и украинского населения Белгородской области, изученный по данным о частотах 33 аллелей 12 иммуно-биохимических локусов, имеет четко выраженные европеоидные особенности.
Генетическая дифференциация белгородской популяции характеризуется генетической эквидистантностью разных уровней организации популяции (Gsf=0.6l sO.67).
Популяции сельских советов двух районов генетически различаются друг от друга в соответствии с географическими расстояниями между ними и их административной принадлежностью.
Генофонды коренного населения Украины и Белоруссии отличаются своеобразием по значительному спектру биохимических маркеров.
5. Генофонд белгородской популяции характеризуется определенным положением в системе русского, украинского и белорусского генофондов. Русское и украинское население Белгородской области наиболее генетически близко к русским популяциям Курской и Московской областей. Население Красненского района - в соответствии с историческими связями - сохранило генетическое сходство с населением Рязанской области. Белгородская популяция образует общий «южный кластер» с коренным населением Украины. Популяции белорусов, формируя самостоятельную северную ветвь восточных славян, оказались генетически далеки как от населения Белгородской области, так и от коренного населения Украины.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены и обсуждены на: Международном форуме по проблемам науки, техники и образования (Москва, 2001 г.), Второй российской научно-практической конференции «Актуальные проблемы экологии, экспериментальной и клинической медицины» (Орел, 2001 г.), Годичной научной конференции сотрудников Белгородского госуниверситета (Белгород, 2001, 2002, 2003, 2004 гг.), Итоговой научной сессии молодых ученых Курского госмедуниверситета (Курск, 2001, 2002, 2004 гг.), 3-ем международном конгрессе по интегратив-ной антропологии (Белгород, 2002 г), Международной конференции «Антропология на пороге III тысячелетия» (Москва, 2002 г.), Региональной научно-практической конференции «Устойчивое развитие: региональные экологические проблемы и стратегия защиты окружающей среды» (Старый Оскол, 2004 г.), Третьем съезде ВОГиС «Генетика в XXI веке: современное состояние и перспективы развития» (Москва, 2004 г.), Третьих Антропологических чтениях памяти акад. В.П. Алексеева «Экология и демография человека в прошлом и настоящем» (Москва, 2004 г.), Пятом съезде Российского общества медицинских генетиков (Уфа, 2005 г.).
Публикации. По теме диссертации опубликовано 15 работ.
Структура и объем диссертации.
Диссертация изложена на 202 страницах и состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, собственных результатов, заключения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 16 таблицами, 2 картограммами и 28 рисунками. Дано приложение (15 страниц). Библиографический указатель содержит 200 наименований, из них 63 зарубежных.
Межпопуляционное и внутрипопуляционное генетическое разнообразие
Анализ средней генетической изменчивости популяций в этносах различных репюнов бывшего СССР, проведенный Балановской Е.В. и др. [10] (таблица 4) свидетельствует о том, что народы европейской части (в основ ном включающей народы Прибалтики, Фенноскандии и восточнославянские народы) по уровню генной дифференциации (GS-E=1-24) занимают промежуточное положение между этносами Кавказа (GS-E=0.81) и народами Сибири и Дальнего Востока (GS-E .SS). При этом средняя гетерозиготность (по данному набору генов) популяций европейской части (Hs=0.376) выше, чем в популяциях Кавказа (Hs=0.365) и популяциях Уральского региона (Hs=0.365).
Согласно результатам исследований Рычкова Ю.Г. и Ящук Е.В.[86] уровень средней субэтнической дифференциации коренного населения Сибири составляет 051=3,0% и является одним из самых высоких в мире. Такая высокая дифференциация сибирских народов обусловлена интенсивным дрейфом генов (вследствие малого размера популяций) и изолированностью популяций. Напротив, субэтническая дифференциация народов зарубежной Европы, самая низкая в мире и не превышает 051=0,7% [87]. Минимальные генетические различия, по мнению авторов, могут указывать на интенсивные миграционные потоки, характерные не только для последних поколений, но и являющиеся одним из важных микроэволюционных факторов населения Европы.
В работе Хуснутдиновой Э.К. [121] по данным о частотах аллелей пяти независимых биохимических локусов была рассчитана степень генетической дифференциации популяции башкир. Автором показано, что основная доля генного разнообразия приходится на внутрипопуляционный уровень -Hs=0.4661 (98,94%). Доля межпопуляционных различий незначительна и составляет 1,06% (Б51=0.0050) от общего генного разнообразия. В популяциях Волго-Уральского региона в целом GST, характеризующий генную дифференциацию между популяциями, оказался несколько выше (1,91%) по сравнению с таковым у башкир (1,08%).
По данным исследований Гинтера Е.К и сотр. [67] внутриэтническое разнообразие мари (2,39%) превышает средний уровень, характерный для народов Волго-Уральского региона (1,91%), приближаясь к сибирскому типу микродифференциации. Уральский генофонд, согласно полученных авторами результатов, занимает промежуточное положение не только географически, но и по уровню GST между европейскими (0,7%) и сибирскими (3,0%) народами.
При анализе всей системы кавказских генофондов, проведенном Бала-новской Е.В. и др. [10], в целом и с учетом их лингвистической организации получены следующие оценки: общее генетическое разнообразие народонаселения Кавказа Нт=0.373; суммарное межпопуляционное разнообразие народонаселения Кавказа по 39 аллелям 18 локусов: АВО, АСР, СЗ, FY, GC, GLO, HP, KEL, LEW, MN, MNS, P, PGD, PGM1, RH-C, RH-D, RH-E, TF составляет Gsr=2.22. При этом средняя гетерозиготность (по данному набору генов) популяций Кавказа (Hs=0.365) ниже, чем в популяциях европейской части (Hs=0.376) и соответствует гетерозиготности популяций Уральского региона (Hs=0.365).
При описании генетической структуры различных популяций важное значение имеет корректная оценка генетических взаимоотношений между ними. В настоящее время при проведении популяционно-генетического анализа рассматривается, как правило, большое количество популяций, описанных по значительному спектру генетических маркеров. Для их всестороннего анализа достаточно эффективно применяется ряд методов многомерной статистики: кластерный, факторный анализ, многомерное шкалирование [31,71].
Одним из методов, позволяющих получить представление об уровнях генетического родства между различными популяциями, является метод оценки генетических расстояний [40,106].
В работе Хуснутдиновой Э.К. [121] представлена матрица генетических расстояний, полученная по частотам аллелей пяти классических биохимических маркеров между этногеографическими группами башкир и народами Волго-Уральского региона. На основе матрицы генетических расстояний автором был проведен кластерный анализ и построена дендрограмма. Анализ дендрограммы показывает, что северо-западные, северо-восточные и юго-западные башкиры находятся на одном уровне с популяцией татар. Относительно близкими к ним являются мордва, марийцы, чуваши и коми. При объединении этногеографических групп башкир в единую популяцию, взаиморасположение популяций Вол го-Уральского региона изменилось. Популяция башкир заняла промежуточное положение между удмуртами и популяциями мордвы, марийцев, татар, чувашей и коми. Проведение факторного анализа по данным о полиморфизме 9 локусов (четырех ДНК и пяти классических) позволило автору проиллюстрировать взаиморасположение популяций Вол-го-Уральского региона в пространстве двух главных факторов. Расположение обследованных популяций в пространстве соответствует степени родства между финно-угорскими и тюркскими народностями, и не противоречит данным об этнической связи этих народов, их происхождению и историческому взаимодействию.
В работе Спицына В.А и др. [101] для определения генетического положения гагаузов среди других тюрко-язычных популяций Европы, сопредельных и более отдаленных этнических групп использовалась матрица генетических расстояний, рассчитанная методом Nei по совокупности б изученных полиморфных локусов. Полученная матрица была использована для идентификации взаиморасположения популяций методом многомерного шкалирования. Авторами установлено, что гагаузы наиболее близки с палоц-кой группой венгров и молдаванами. Относительная близость гагаузов с русскими, (болгарами и турками свидетельствует о сложности процессов этногенеза в этом регионе Европы и значительной роли смешения в становлении народов.
История формирования генофонда восточных славян и населения Белгородской области
В связи с тем, что в данной работе анализируется полиморфизм классических генных маркеров в популяциях восточных славян в целом, причем особое внимание уделено населению Белгородской области, лежащей на границе двух основных восточнославянских народов — русских и украинцев — мы сочли необходимым сделать экскурс в историю сложения населения этих групп. Данные по антропологии, археологии, этнографии, лингвистике, демографии и истории народонаселения помогают понять и корректно интерпретировать выявляемые генетические различия между популяциями.
Наиболее многочисленными в нашей стране являются три родственных народа, относящихся к восточнославянской подгруппе славянской языковой группы индоевропейской семьи: русские, украинцы и белорусы. На основании данных по славянским средневековым сериям Алексеева Т. И. [26] пришла к заключению, что имеется единый исходный антропологический тип славян, что обусловливает сходную комбинацию антропологических признаков во всех современных славянских группах. Различия между ними объясняются проявлением черт местного населения, с которым славяне вступали в контакт при освоении новых территорий. Нередко иноязычное население выступало в качестве субстрата как, например, финно-угры - в русском населении, балты - в белорусском, древние иранцы - в украинском.
Русские - основная часть населения Российской Федерации; в районах своего исконного расселения они составляют свыше 95% всего населения [27]. По своему происхождению русские связаны с восточнославянскими племенами, которые со второй половины I тысячелетия н.э. расселялись по территории Восточной Европы. В их формировании принимали участие и некоторые неславянские народы, издавна живущие на этой территории. В IX-XII вв. из многочисленных славянских племен сложилась единая древнерусская народность, ставшая впоследствии, после распада Киевской Руси, основой для формирования трех родственных народностей — русской, украинской, белорусской.
Русская народность складывалась в XIV-XV вв. в области Волго-Окского междуречья и Великого Новгорода в процессе сопротивления монголо-татарскому нашествию. Этническим ядром русских явились восточнославянские племена, заселявшие в раннем средневековье западную зону нынешней России и передвигавшиеся затем по Оке и Волге на восток [26]. С образованием Русского централизованного государства происходит расширение этнической территории русских за счет слабозаселенных восточных, северных и южных районов. Особенно интенсивно этот процесс происходил в XVI-XVII вв., когда русские стали заселять Нижнее Поволжье, Урал, Северный Кавказ и Сибирь. В ходе русской антропологической экспедиции было обнаружено, что русские имеют весьма однородный антропологический состав, несмотря на то, что они расселены на значительной территории. По многим признакам русские являются типичными европеоидами, занимающие центральное положение среди народов Европы [26].
В составе современных европейских русских существует три основных антропологических варианта: западный (в его состав входят четыре близких друг к другу антропологических типа: ильменско-белозерский, валдайский, верхнеокский, центральный); северо-восточный (объединяет три антропологических типа - вятско-камский, клязьминский и восточный верхневолжский); юго-восточный (западный верхневолжский) [26].
Украинцы — крупнейший после русских восточнославянский народ, основное население Украины. Украинцы выделились из единой древнерусской народности [118]. Как самостоятельная этническая общность украинская народность окончательно сложилась к XVI в. Районом формирования этой народности было Среднее Поднепровье - Киевская, Полтавская области и юг Черниговской. Образование украинского этноса происходило в борьбе с польско-литовскими, венгерскими и татаро-монгольскими нашествиями.
На территории современной Украины выделяют пять антропологических типов: полесский, центрально-украинский, нижнеднепровский, карпатский и закарпатско-верхнеднестровский. Карпатский тип является ответвлением распространенной в Центральной Европе малой альпийской расы. Полесский тип представлен и среди южных белорусов [26,118].
Белорусы составляют основное население Белоруссии. В их этногенезе кроме восточнославянских племен приняли участие ассимилированные ими литовские этнические элементы. В IX в. все эти группы вошли в состав Киевской Руси и консолидировались в древнерусскую народность. После распада государства белорусские земли были включены в состав Великого княжества Литовского. В XVI в. завершается процесс формирования белорусской народности, а во второй половине XIX в. белорусская народность трансформируется в нацию [26].
На территории Белоруссии существует два антропологических типа: валдайский и полесский. Первый распространен также на востоке — в западной зоне России (верховья Волги, Днепра, Западной Двины). Полесский тип белорусов сходен с одноименным типом украинцев, отличаясь от него меньшей выраженностью черт южных европеоидов [26].
Таким образом, восточные славяне, населяющие территорию современных России, Украины и Белоруссии, характеризуясь отдельными антропологическими типами, имеют сходную комбинацию антропологических признаков, как вследствие наличия единого исходного антропологического типа славян, так и в результате значительных перемещений и смешений в процессе их формирования [26,118,119,120].
Первобытные люди на территории Белгородской области появились около 100 тыс. лет назад в палеолите [20]. Уже к мезолиту и неолиту они расселились практически по всей территории области (на месте Белгородского водохранилища, в бассейнах рек Ворсклы, Оскола, в Вейделевском и Валуй-ском районах). В середине II в. до н.э. на территорию области хлынула волна переселенцев с востока, оттеснившая местное население на запад. Наиболее развитую и богатую культуру железного века в Белгородской области оставили племена Скифии, которая занимала территорию к северу от Азовского и Черного морей вплоть до территории области. Скифы — ираноязычный народ, пришедший с востока и господствовавший здесь с VII по III в. до н.э. Западную часть территории нынешней Белгородской области занимали оседлые племена скифов. Северо-восток области между реками Тихой Сосной и По-туданью занимало обособившееся от остальных скифов племя «воронежских скифов». Юго-восток области занимали кочевья савроматов (сарматов), которые в III в. до н.э. заняли Скифию и господствовали здесь в течение шести веков. В 375 г. н.э. их оттеснила новая волна мигрантов с востока — гуннов [20].
Методы математического анализа популяционно-генетических данных
Система глиоксалазы 1 (GLO 1) (КФ 4.4.1.5). Молекула GLOl - ди-мер с относительной молекулярной массой каждой из субъединиц - 24 кД. Фермент катализирует необратимое превращение глутатиона и метилглиок-саля в S-лактоилглутатион. Активность различных вариантов глиоксалазы неодинакова и убывает в ряду GLOl 2-2 GL01 2-l GL01 1-1 [27,160,186].
Полиморфизм GLOl выявляли с помощью вертикального электрофореза в 5% ПААГ, содержащем крахмал в концентрации 1% [14]. Электрофорез проводили с использованием трис-боратного электродного буфера, рН 8,0. Для приготовления образцов гемолизат разводили 20% раствором сахарозы в соотношении 1:1. Преэлектрофорез проводили 30 минут при 100V, 25mA и 3W. Электрофорез длился 1,5 часа при 30mA, 200V и 6W. Для выявления фенотипов глиоксалазы гель после электрофореза покрывали листом фильтровальной бумаги размером 10 см, смоченной раствором следующего состава: 10 мл 0,2М фосфатного буфера рН 6,7, содержащего 50 мг восстановленного глутатиона и 3% раствор метилглиоксаля. Гель инкубировали при температуре 37С 40 минут. Затем бумагу удаляли, и блок промывали в проточной воде в течение 5 минут. Окрашивание геля проводили в течение 2-3 минут раствором йода. Фенотипы глиоксалазы были видны в виде темно-синих фракций в постгемоглобиновой зоне. Типирование основных фенотипов глиоксалазы (GLOl 1-1, GLOl 1-2 и GLOl 2-2) проводили в соответствии с [27,186]
Система аі-антитрипсина (PI), а 1-антитрипсин (PI) является глико-протеидом сыворотки крови человека, обеспечивает до 90% от всей активности ингибиторов протеаз в отношении трипсина и других протеолитических ферментов [27,186]. Концентрация а 1-антитрипсина в сыворотке крови человека колеблется в пределах 2-4 г/л. Относительная молекулярная масса -50 кД. Изоэлектрическая точка рН 4,4-4,7 [135].
Типирование системы (PI) производили методом ИЭФ в 0,5 мм агароз ном геле: 200 мг агарозы (для ИЭФ, Amersham Biosciences), 2,4 г сорбита, 57 мг ACES, 14 мг серина, 18 мл воды, 1 мл фармалита рН 4,2-4,9 (Pharmacia), 100 мкл амфолина рН 4-6 (Bio-Rad), 130 мкл сервалита рН 4-5 (Serva) [153]. Образцы сыворотки разводили 40 мМ ДТТ (1:1), через 30 минут добавляли 20 мМ раствор UAA (100 мкл раствора на 50 мкл сыворотки). Пробы вносили на бумажных мишенях размером 5x3 мм в 2 см от катодного края пластины. Максимальные электрические параметры Р=12 W, V=1600 V, 1=10 mA. Префокусировка 20 минут, ИЭФ — 2 часа. Температура охлаждения 10 С. В качестве электролитов применяли 1М Н3Р04 на анодном и 1М глицин на катодном электродах. Фиксация геля осуществлялась 10 минут в 3% растворе сульфосаллициловой кислоты в 33% растворе этанола. Окраска производилась в течении ночи Кумасси R-250. Этот метод позволил выявить шесть наиболее распространенных субтипов системы PI: Ml, М1М2, М1МЗ, М2, М2МЗ, МЗ, а также редкие аллели. Редкие варианты системы PI не идентифицировались в связи с отсутствием соответствующих стандартов.
Система эритроцитарной 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы (6-PGD) (КФ 1.1.1.41). Молекула 6-PGD - димер с относительной молекулярной массой 52 кД. 6-PGD, фермент, участвующий в превращении гексоз и пептоз в организме человека и других млекопитающих и необходим для синтеза нуклеиновых кислот [27].
Полиморфизм 6-PGD выявляли методом вертикального электрофореза в 7,5% ПААГ [27]. В качестве электродного буфера использовали трис-боратный буфер рН 8,0 следующего состава: трис 0,115 моль/л, борная кислота 0,16 моль/л и ЭДТА (Na - соль) 0,005 моль/л. Пробы готовили из гемо-лизата путем разведения их 20% раствором сахарозы в соотношении 1:1. Преэлектрофорез проводили 30 минут при 100V, 25mA и 3W. Электрофорез длился 2,5-3,5 часа при 50mA, 250V и 10W, пока гемоглобин не достигал 3-3,5 см от места вхождения образцов в гель. Выявление ферментативной активности 6-фосфоглюконат-дегидрогеназы проводили методом агаровой аппликации, наливая на гель 15 мл раствора агара. После застывания пластинку с гелем помещали в термостат при 37С на 30-40 минут до появления фиолетовых зон формазана в местах проявления ферментативной активности. Состав агаровой аппликации: в 15 мл 0,1 М трис-HCl буфер, рН 8,0 растворяли 75 мг агара (Difco) и варили до прозрачности при 100С. После охлаждения агарового раствора до 40С в него добавляли 10 мг 6-фосфоглюконата натрия (AppliChem), 4 мг МТТ, 4 мг NADPH, 3 мг феназин метасульфата. Учет фенотипов проводили в соответствии с [27]. Наиболее часто (90-95%) выявляли фенотип 6-PGD А-А, электрофоретически характеризующийся одной изо-ферментной полосой. Гетерозиготный фенотип 6-PGD А-С и гомозиготный 6-PGD С-С идентифицировали по трем изоферментным компонентам совпадающим по локализации на фореграмме, но различающихся по активности, проявлявшейся в интенсивности окрашивания. У гетерозигот интенсивность окрашивания фракций изоферментов уменьшалась в направлении от анодной фракции к катодной, у гомозиготного фенотипа - наоборот (рис. 5) [27].
Система фосфоглюкомутазы 1 (PGM1) (Кф 2.7.5.1). Фосфоглюкому-таза является фосфотрансферазным ферментом, катализирующим взаимопревращения глюкозо-1 -фосфата и глюкозо-6-фосфата. Молекулы изоферментов PGM1 мономерны, их относительная молекулярная масса - 51 кД [27].
Типирование PGM1 проводили с помощью ИЭФ в ПААГ с применением амфолина рН 5-7 (Bio-Rad) в концентрации 1% [188,193]. В качестве като-лита использовали 1% раствор амфолина рН 6-8 (Pharmacia), анолита - 1% раствор амфолина рН 4-6 (Bio-Rad). Для приготовления образцов очищенный гемолизат разводили 20% раствором сахарозы в соотношении 1:1. Образцы вносили на бумажных мишенях размером 4x7 мм на расстоянии 2 см от анодного края пластины. Максимальные электрические параметры: P=10W, 1=30 mA, V=2800V. Префокусировка - 20 минут, ИЭФ - 2 часа. Температура охлаждения— 10 С. Выявление ферментативной активности PGM1 проводили методом агаровой аппликации. Состав инкубационной среды, входящей в состав агаровой аппликации [27,186]: 20 мл 0,1 М трис - НС1 рН 8,0,46 мг ос-D-глюкозо-І-фосфат (Fluka), 0,35 ЕД G6PD, 4 мг NADPH, 4мг МТТ, 4 мг феназин метасульфата. Инкубацию геля проводили 60-90 минут до появления фиолетовых зон формазана в области локализации изоферментов. Различные исследовательские группы авторов дают разные обозначения изоэлектриче-ски разделенным изоферментам PGM1 (табл. 6). При типировании фенотипов PGM1 мы придерживались классификации, предложенной Bissbort et al.
Генетические расстояния и таксономический анализ русского населения Белгородской области на уровне сельсоветов
На следующем этапе было проведено исследование генетических взаимоотношений между коренным русским и украинским населением Белгородской области. В анализ были включены четыре района Белгородской области: Прохоровский и Красненский районы (коренные русские); Грайворон-ский и Красногвардейский районы (коренные украинцы Белгородской области). На основе матрицы генетических расстояний (таблица 10) был проведен кластерный анализ и построена дёндрограмма (рис.9). Анализ дендрограммы, построенной по методу Уорда, показывает, что в первую очередь объединяются популяции Прохоровского и Красногвардейского районов. Следует отметить, значимый коэффициент корреляции между матрицей генетических и географических расстояний между рассматриваемыми районами R=0.77 (р=0.07).
При проведении многомерного шкалирования получен график, представленный на рис.10. Коэффициент стресса данного графика равен So=0, кривая Шепарда удовлетворительная, что позволяет считать приемлемыми результаты многомерного шкалирования. Как и на дендрограмме, на данном графике видно, что наиболее близкими в двухмерном пространстве являются Прохоровский и Красногвардейский районы.
Таким образом, проведенный анализ генетических взаимоотношений 10 изученных сельских популяций по данным о частотах 33 аллелей 12 локусов биохимических систем показал, что сельсоветы Прохоровского и Красненского районов Белгородской области четко дифференцируются друг от друга на две отдельные группы, каждая из которых представлена только сельсоветами своего района. При рассмотрении генетического родства 4 районных популяций Белгородской области с коренным русским и украинским населением установлено, что наиболее близкими являются Прохоровский (коренное русское население) и Красногвардейский районы (коренное украинское население). Красненский (коренное русское население) и Грай-воронский (коренное украинское население) районы достаточно генетически далеки как друг от друга, так и от двух выше рассмотренных районных популяций. Одним из факторов установленной нами дифференциации рассматриваемых популяций являются географические расстояния между ними.
С целью оценки положения генофонда белгородской популяции в структуре русского генофонда проведен расчет генетических расстояний между двумя районами Белгородской области (Прохоровский и Красненский районы), представляющих коренное русское население, коренным украинским населением Белгородской области и рядом русских популяций.
На первом этапе данного исследования мы провели анализ генетических взаимоотношений между населением Белгородской области и 20 русскими популяциями, населяющими территорию исконно русского ареала, с использованием данных о частотах аллелей системы HP. Выбор этой системы для сравнительного анализа обусловлен тем, что среди всех типируемых биохимических маркеров по системе HP изучено максимальное количество популяций. В анализ были включены следующие популяции русских [3,8,9,102,131,132,133]: Московская область (г. Егорьевск), г. Ленинград (3 популяции), г. Москва, г. Нижний Новгород, Ленинградская область, Ме-зеньский и Пинежский районы Архангельской области, г. Архангельск, Курская область (г. Курск), Рязанская область (г. Рязань), Костромская область (г. Кострома), Новгородская область (с. Волот), Вологодская область (суммарная выборка по трем сельсоветам), Тверская область (суммарная выборка по 4 сельсоветам), Псковская область (суммарная выборка уроженцев разных районов), Ярославская область (с. Поречье), Брянская область (с. Староду-бье).
Матрица генетических расстояний между исследованными популяциями, рассчитанных по частотам двух аллелей системы HP, представлена в приложении 6. На основе этой матрицы был проведен кластерный анализ, построена дендрограмма методом Уорда (рис. 11). Методом многомерного шкалирования получен график (рис. 12) взаимного расположения изученных популяций в двухмерном пространстве. Коэффициент стресса данного графика равен So=0,02, коэффициент алиенации К=0,04, сделано 45 итераций, кривая Шепарда удовлетворительная. Анализ дендрограммы и графика многомерного шкалирования позволяют заключить, что большинство из изученных русских популяций, в том числе и популяция Белгородской области, генетически близки между собой. Наименьшие генетические дистанции для населения Белгородской области отмечены с популяциями русских г. Москвы, Вологодской, Рязанской, Ленинградской и Костромской областей.
