Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы...13
- Изменения строения костей скелета в результате использования клеточных технологий
- Морфология костной ткани в условиях применения фибрина
- Биодеградируемые полимеры и их влияние на структурную организацию различных тканей
- Микроанатомическая организация и основные функции лимфотических узлов
Глава 2. Материал и методы исследования ...56
Глава 3. Структурная организация костной ткани при естественной регенерации ее дефекта...71
Глава 4. Морфологические изменения в дефекте костной ткани в условиях использования фибринового сгустка ...132
Глава 5. Восстановление строения костной ткани после введения мезенхимальных стволовых клеток ...200
Глава 6. Кость нижней челюсти после имплантации в ее дефект биодеградируемого полимера ...265
Глава 7. Сравнительная морфология костной ткани после воздействия различными способами на репарацию ее дефекта ...332
Глава 8. Обсуждение полученных результатов .358
Выво-ды...393
Практические рекоменда-ции...396
Список литературы
- Морфология костной ткани в условиях применения фибрина
- Микроанатомическая организация и основные функции лимфотических узлов
- Восстановление строения костной ткани после введения мезенхимальных стволовых клеток
- Сравнительная морфология костной ткани после воздействия различными способами на репарацию ее дефекта
Введение к работе
Актуальность темы исследования обусловлена тем, что успех восстановительного хирургического лечения травматических повреждений во многом определяется процессами репаративной регенерации костной ткани пациента.
Отмечено усиление регенерации костной ткани (костный дефект в эксперименте) при применении обогащенной тромбоцитами плазмы (Anitua E., 2001, 2006; Sanchez M. et al., 2003; Anitua E. et al., 2005, 2006б; Hokugo A. et al., 2005). В результате использования богатого тромбоцитами фибринового сгустка (БТФС) при дентальной имплантации меньше травматизация тканей и, соответственно, выраженность воспалительной реакции. Более интенсивно формируется соединительная ткань, прочно фиксирующая имплантат в альвеолярном отростке (Колесников И.С., 2006; Майбородин И.В. и др., 2007а, 2008б, 2009б; You T.M. et al., 2007а, 2007б; Lee H.J. et al., 2007).
Несмотря на развитие травматологии и ортопедии, полное восстановление костных тканей является проблемным, поскольку большие дефекты не могут спонтанно заживать. Использование стволовых клеток – это регенеративная биология и восстановительная медицина, являющиеся все более расширяющимися областями исследования с надеждой на успех терапевтических методов лечения ран и травм, на которые невозможно эффективно воздействовать современными хирургическими методами (Clines G.A., 2010; Galle J. et al., 2010; Chanda D. et al., 2010).
Среди биополимеров особое место занимают биодеградируемые полигидроксиалканоаты (ПГА) — полимеры гидроксипроизводных алкановых кислот (масляной, валериановой и др.), которые с середины 80-х годов активно изучают в качестве материала для хирургии, тканевой инженерии и создания биоискусственных органов (Chen G.Q., Wu Q., 2005; Федоров М.Б. и др., 2007; Волова Т.Г. и др., 2010; Яковлев А.В. и др. 2010). В экспериментах по изучению репаративного остеогенеза было показано, что имплантаты из некоторых ПГА, в частности полигидроксибутират, обладают выраженными направленными остеопластическими свойствами (Шишацкая Е.И. и др., 2008в).
Таким образом, в доступной литературе имеется множество данных об эффективности использования препаратов фибрина, клеточных технологий и биодеградируемых полимерных материалов в стоматологии, травматологии и хирургии. Однако, несмотря на многочисленные рекомендации о применении каждого способа воздействия на регенераторные процессы, в литературе полностью отсутствуют результаты сравнительной эффективности этих методов. Кроме того полностью отсутствуют результаты исследования лимфатических узлов (ЛУ) после указанных способов воздействия на репаративную регенерацию, тогда как именно эти органы являются маркером выраженности воспалительного процесса в регионе, по их изменениям можно точно оценивать результативность проведения тех или иных лечебных мероприятий, предсказывать развитие многих осложнений, а, значит, и успешно принимать меры по их профилактике.
Цель исследования: Разработать в эксперименте способ влияния на репаративную регенерацию поврежденного участка кости нижней челюсти, позволяющий значительно ускорить процессы заживления и вызывающий минимальные изменения регионарных ЛУ.
Задачи исследования:
-
Методами световой микроскопии и рентгеновской денситометрии изучить процессы репаративной регенерации участка поврежденной кости нижней челюсти крыс и изменения регионарных (субмандибулярных) ЛУ в различные сроки при естественном заживлении.
-
Исследовать особенности заживления дефекта кости нижней челюсти и реакций ЛУ после использования БТФС.
-
Установить динамику регенераторного процесса и структурную организацию ЛУ после введения в искусственно созданное отверстие кости нижней челюсти суспензии аутологичных мезенхимальных стволовых клеток костномозгового происхождения (АМСККП) в культуральной среде.
-
Определить основные этапы репарации кости нижней челюсти, структурные и клеточные изменения ЛУ после имплантации ПГА.
-
Сравнить эффективность каждого способа воздействия на репарационный процесс и выбрать наиболее целесообразный метод.
-
Установить положительные и отрицательные стороны каждого способа влияния на регенерацию поврежденного участка кости нижней челюсти и изменения регионарных ЛУ.
-
Оценить возможные осложнения каждого способа воздействия на процессы репаративной регенерации.
Научная новизна: Впервые проведено сравнительное исследование процессов регенерации в участке повреждения кости нижней челюсти и реакций регионарных (субмандибулярных) ЛУ крыс при естественном заживлении, после применения БТФС, на фоне введения суспензии АМСККП и после имплантации ПГА.
Впервые показано, что после повреждения кости нижней челюсти у крыс и естественном ходе регенерации происходит заполнение дефекта кровью, формирование кровяного сгустка с большим числом эритроцитов. Через 1 неделю в дефекте кости среди фрагментов кровяного сгустка и грануляций формируются отдельные островки молодой костной ткани, через 2 недели дефект в кости нижней челюсти полностью замещается молодой костной тканью. На 3–4 неделе в костной мозоли на месте дефекта появляются структуры красного костного мозга. По данным денситометрии отмечено медленное и плавное возрастание плотности костной ткани в участке повреждения. В субмандибулярных ЛУ при заживлении участка повреждения нижней челюсти расширяется корковое плато, увеличивается относительный объем лимфоидных фолликулов и мозговых синусов. Во всех структурных отделах ЛУ сначала возрастает число иммуно- и плазмобластов, делящихся клеток и клеточных элементов с признаками деструктивных изменений, к концу наблюдения увеличивается содержание ретикулярных клеток и макрофагов.
Впервые установлено, что начало репарационных процессов после применения БТФС проходит интенсивнее, чем при спонтанном заживлении, отверстие в кости раньше заполняется островками костной ткани.
Впервые получены свидетельства, что после заполнения искусственно созданного отверстия в кости суспензией АМСККП в культуральной среде происходит резкое ускорение процессов, способствующих быстрому (к 2 неделе) восстановлению структур красного костного мозга.
Впервые доказано, что отличия в строении субмандибулярных ЛУ при естественном заживлении дефекта кости нижней челюсти и репарации на фоне применения БТФС или АМСККП заключаются в большей сохранности структурной организации данных органов.
Впервые продемонстрировано, что после применения матриксов из ПГА на все сроки наблюдения сохраняется неизменным отверстие в кости, где находился сам полимер. Признаков консолидации ПГА с краем дефекта кости ни в одном случае нет. Свидетельства деградации искусственного материала на все сроки эксперимента отсутствуют, также нет признаков формирования гигантских клеток инородных тел по краю матрикса. Полученные данные указывают не на биодеградируемость, а на выраженную биоинертность используемого полимера. Прочность поврежденных тканей после применения ПГА не только не восстанавливается, а остается сниженной за счет соединительнотканной капсулы между полимером и краем кости.
Впервые получены данные, что на хронический воспалительный процесс в тканях нижней челюсти, индуцированный присутствием инородного тела – ПГА, ЛУ сначала отвечают гипертрофией структур, точно также как и при естественном ходе репаративной регенерации, однако, начиная с 4 недели, наступает декомпенсация функций этих органов, проявляющаяся в резком уменьшении численности иммунокомпетентных клеток, снижении митотической активности и быстром развитии соединительной ткани во всех зонах.
Теоретическое и практическое значение работы: Получены новые знания об особенностях регенерации кости нижней челюсти после использования БТФС, на фоне введения суспензии АМСККП в культуральной среде и после имплантации ПГА. Важное значение для практической деятельности имеет выявление значительно более интенсивного, чем при спонтанном заживлении, течения репарационных процессов при применении БТФС и ускорения восстановления структур красного костного мозга после введения АМСККП. И после использования фибрина и после применения стволовых клеток была отмечена большая сохранность структуры регионарных ЛУ, что является свидетельством менее активного воспалительного процесса в участке повреждения. Применение ПГА и материалов на их основе для ускорения репарации костных тканей нецелесообразно. Имплантация ПГА не только не ускоряет репарацию участка повреждения кости нижней челюсти, но препятствует процессам заживления, в регионарных ЛУ снижается количество иммунокомпетентных клеток и прогрессирует склеротическая трансформация. Прочность поврежденных тканей после применения ПГА не только не восстанавливается, а остается сниженной за счет соединительнотканной капсулы между полимером и краем кости.
На защиту выносятся следующие основные положения:
-
Репаративные процессы при повреждении кости нижней челюсти и применении БТФС в эксперименте проходят значительно интенсивнее, чем при спонтанном заживлении, дефект раньше и быстрее заполняется островками костной ткани, которые раньше сливаются и формируют молодую костную ткань.
-
После заполнения искусственно созданного отверстия в кости суспензией АМСККП в культуральной среде происходит резкое ускорение процессов, способствующих быстрому восстановлению структур красного костного мозга.
-
Особенности структурной организации субмандибулярных ЛУ крыс при естественным ходе регенерации дефекта кости нижней челюсти и после заполнения отверстия БТФС или АМСККП заключаются в большей сохранности структуры и цитоархитектоники регионарных ЛУ.
-
После применения матриксов из ПГА на все сроки наблюдения свидетельств деградации искусственного материала, также нет признаков формирования гигантских клеток инородных тел по краю полимера, что указывает не на биодеградируемость, а на выраженную биоинертность используемого полимера.
-
На хронический воспалительный процесс в тканях нижней челюсти крыс, индуцированный присутствием инородного тела, ЛУ сначала отвечают гипертрофией структур, однако, начиная с 4 недели, уменьшается численность иммунокомпетентных клеток, снижается митотическая активность и прогрессивно развивается соединительная ткань во всех зонах.
Апробация материалов диссертации: Основные положения диссертации доложены на Всероссийской конференции «Регенеративная биология и медицина» (Москва, 2011), международной научной конференции «Фундаментальные и прикладные аспекты воспаления» (Минск, 2011) и на заседании научного персонала лабораторий стволовой клетки, восстановительной медицины и персонализованной медицины Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН (Новосибирск, 2012).
Внедрение результатов исследования в практику: Результаты диссертационной работы внедрены в научно-исследовательскую работу «Центра новых медицинских технологий» Института химической биологии и фундаментальной медицины СО РАН, лечебную практику ООО «Дентал-Сервис» и стоматологическую клинику «Дента», МУЗ детскую клиническую больницу скорой помощи № 3 г. Новосибирска, МБУЗ Новосибирска стоматологическую поликлинику №3, на кафедрах ортопедической стоматологии, факультетской хирургической стоматологии и стоматологической имплантации Государственного бюджетного образовательного учреждения высшего профессионального образования «Новосибирский государственный медицинский университет» Минздравсоцразвития России и могут быть использованы при разработке новых методов лечения, оказывающих влияние на регенерацию костной ткани, а также при изучении клинических дисциплин, стоматологии, хирургии и травматологии.
Публикации: По теме диссертации опубликованы 25 печатных работ, из них 20 в ведущих научных изданиях, рекомендованных ВАК для публикации результатов диссертационных исследований на соискание ученой степени доктора медицинских наук.
Структура и объем диссертации: Диссертация состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов исследования, собственных результатов, обсуждения полученных результатов, выводов, практических рекомендаций и списка литературы. Работа изложена на 489 страницах компьютерного текста, содержит 55 таблиц, иллюстрирована 103 многокомпонентными комбинированными рисунками. Список литературы включает 586 источников (126 отечественных и 460 иностранных). Весь материал, представленный в диссертации, получен, обработан и проанализирован лично автором.
Морфология костной ткани в условиях применения фибрина
Мезенхимальные стромальные (стволовые) клетки формируют строму ко-стного мозга, а гемопоэтические стволовые клетки участвуют в регенерации красного костного мозга. Поэтому не происходит образования костного мозга при введении только гемопоэтических клеток в различные участки тела (Patt H.M., Maloney M.A., 1975). Однако, в последнее время появились данные о воз-можности трансдифференцировки гематопоэтических клеток костного мозга в тканеспецифичные стволовые клетки и обратно (Ratajczak M.Z. et al., 2004).
Красный костный мозг содержит прогениторные клетки (мезенхимальные стволовые клетки), способные к дифференцировке в кость, хрящ, сухожилия и другие виды соединительной ткани. Это позволяет широко применять такие клетки для ускорения регенерации костной ткани (Rosenbaum A.J. et al., 2008; Miljkovic N.D. et al., 2008; Kim S.E. et al., 2008; Centeno C.J. et al., 2008; Tai K. et al., 2008; Kessler M.W. et al., 2008; Hong D. et al., 2010; Chanda D. et al., 2010; Goldschlager T. et al., 2010; Goepfert C. et al., 2010; Peppo de G.M. et al., 2010).
Подобными остеогенными свойствами обладают и МСК, выделенные из жировой ткани (Tapp H. et al., 2009; Lee S.W. et al., 2009; Grewal N.S. et al., 2009; Xie L.W. et al., 2009; Diederichs S. et al., 2009; Estes B.T. et al., 2010; An C. et al., 2010; Niemeyer P. et al., 2010а; Shoji T. et al., 2010; Lee S.J. et al., 2010), крови со-судов пупочного канатика (Ciavarella S. et al., 2009; Martins A.A. et al., 2009; Jger M. et al., 2009б; Kang J.M. et al., 2010; Schneider R.K. et al., 2010; Liu G. et al., 2010; Zhao L. et al., 2010а, 2010б; Xu H.H. et al., 2010), его межклеточного вещества (Hsieh J.Y. et al., 2010), периферической крови (Wan C. et al., 2006; Peterbauer-Scherb A. et al., 2010), волосяных фолликулов (Wu G. et al., 2009); надкостницы (Wakitani S., Yamamoto T., 2002; Hayashi O. et al., 2008; Zhang X. et al., 2008), различных синовиальных структур, причем количество их возрастает на ранних стадиях остеоартрита (Nimura A. et al., 2008; Morito T. et al., 2008; Jones E.A. et al., 2008; Steinwachs M.R. et al., 2008; Kanamoto T. et al., 2008; Pei M. et al., 2009; Fan J. et al., 2009; Shi X. et al., 2009; Wang Y. et al., 2010), субхон-дральной кости (Neumann K. et al., 2008), костей свода черепа (Steenhuis P. et al., 2009), связок и сухожилий (Cheng M.T. et al., 2009), нервной ткани (Chung I.H. et al., 2009), слизистой оболочки полости рта (Tomar G.B. et al., 2010), и эмбрио-нальные стволовые клетки (Jukes J.M. et al., 2008а, 2008б; Hwang N.S. et al., 2008; Arpornmaeklong P. et al., 2009; Ji Y.H. et al., 2010; Hu J. et al., 2010), в том числе - амниотические (Wei J.P. et al., 2009; Sun H. et al., 2010) и зубных зачат-ков (Yamada Y. et al., 2010). По некоторым данным МСК из костного мозга и надкостницы по их ос-теогенной активности имеют преимущество перед клетками жировой ткани (Hayashi O. et al., 2008; Niemeyer P. et al., 2010а) и перед клетками перифериче-ской крови, так как костномозговые клетки содержат больше клеточных эле-ментов CD105+, CD34+ и CD14+ (Smiler D. et al., 2008).
Выделенные у собак МСК в смеси с фибриновым клеем и recombinant human morphogenetic protein-2 инъецировали под кожу голым мышам. Образо-вание кости было обнаружено на 12 неделе. Гистоморфометрический анализ показал, что подкожные узелки содержат 26,9% вновь сформированной костной ткани после применения МСК костномозгового происхождения (МСККМП), 41,1% костной ткани после использования МСК из альвеолярной кости и 58,2% - после введения периоссальных МСК (Zhu S.J. et al., 2006).
МСККМП от молодых и пожилых пациентов и экспериментальных жи-вотных не отличаются по своим свойствам и характеристикам, но с возрастом количество таких клеток снижается (Cei S. et al., 2006). Однако, по другим дан-ным, с возрастом резко снижается пролиферативная активность МСК, что мо-жет быть связано с их микроокружением, повреждениями генома, оксидатив-ным стрессом и включениями механизмов супрессии ростовых факторов (сни-жение риска развития опухолей) (Beausjour C., 2007; Scharstuhl A. et al., 2007; Roobrouck V.D. et al., 2008; Quarto N. et al., 2010). У пожилых людей может различаться способность МСК к репарации тка-ней в зависимости от источника. МСККМП пожилых пациентов (средний воз-раст 64,6 года) продемонстрировали более высокий потенциал к дифференци-ровке в хондрогенном направлении, по сравнению с МСК, полученными из трабекулярной кости (Coipeau P. et al., 2009).
Эстрогены дозозависимо влияют на дифференцирование МСК человека в остеогенном или адипогенном направлениях. Таким образом, возможны разли-чия как результатов использования МСК у пациентов мужского и женского по-ла, так и эффективности применения клеток, выделенных от доноров различно-го пола (Crisostomo P.R. et al., 2006; Hong L. et al., 2006, 2009; Varkey M. et al., 2007; Strube P. et al., 2009). МСК имеют различную морфологию, что зависит, в первую очередь, от способов их получения и культивирования. Поэтому перед применением необ-ходимо проведение теста на возможность дифференцировки в заданном на-правлении (Tallheden T. et al., 2003). Морфологически МСККМП характеризуются как крупные, фибробласто-подобные, D7-FIB+ клетки. Они являются позитивными по CD105, CD73, LNGFR, HLA-DR, CD10, CD13, CD90, STRO-1 и негативными по CD14, CD34, CD45, CD117 и CD133. При культивировании только такие клетки образуют монослой и способны к хондрогенной, остеогенной и адипогенной дифферен-цировке (Jones E.A. et al., 2002; Chamberlain G. et al., 2007).
МСККМП взрослого человека, фетального костного мозга и пупочной крови оказались одинаковыми по визуальной морфологии и следующим показа-телям: позитивными по CD29, CD44, CD59, CD90, CD105, CD166 и негативны-ми по CD11a, CD14, CD28, CD33, CD34, CD45, HLA-DR, B7-1(CD80), B7-2 (CD86), CD40, CD40L (Zhou D.H. et al., 2003; Martins A.A. et al., 2009).
Выделенные из периферической крови и костного мозга МСККМП имеют сходные антигенные показатели: они положительные по CD44, CD13, CD29, CD90 и CD105, негативные по CD45, CD14, DR, CD34, CD19, CD1a, CD38 и CD25. В крови здоровых доноров таких клеток содержится 0,0078±0,0044%, при ожогах в остром периоде этот показатель возрастает до 0,1643±0,115; P 0,001 (Mansilla E. et al., 2006).
Микроанатомическая организация и основные функции лимфотических узлов
АМСККП выделяли, вымывая костный мозг из эпифизов бедренных кос-тей, взятых под эфирным наркозом у самцов крыс инбредной линии Wag (Май-бородин И.В. и др., 2010в, 2010г, 2010д; Ковынцев А.Н., 2011). Полученную суспензию клеток помещали в пластиковые флаконы («Nunk», Дания), через 48 часов после эксплантации костного мозга неприкрепившиеся клетки сливали. Прикрепившиеся клетки культивировали в среде -МЕМ с добавлением 10% эмбриональной телячьей сыворотки («Biolot», Россия) при 37С в СО2-инкубаторе с 5% СО2 в условиях насыщенной влажности. Смену среды произ-водили каждые три дня. При субкультивировании монослойную культуру рас-севали в плотности 1000-5000 клеток/см2 (в зависимости от ростовых свойств используемой эмбриональной сыворотки), использовали стандартные растворы Версена и трипсина. Методами световой и флуоресцентной микроскопии и цитологическими методами окрашивания было показано, что культивируемые клетки костного мозга крысы: - были CD90+, CD105+, CD34-, CD45- (Jones E.A. et al., 2002; Zhou D.H. et al., 2003; Tuli R. et al., 2003; Mayer H., 2004; Mansilla E. et al., 2006; Chamberlain G. et al., 2007; Lee S.Y. et al., 2007; Martins A.A. et al., 2009; Coipeau P. et al., 2009; Berner A. et al., 2010). - in vitro прикреплялись к поверхности пластика культивирования, - имели фибробластоподобную морфологию, которую сохраняли все время культивирования, - поддерживались в культуре в течение нескольких пересевов, - формировали колонии фибробластоподобных клеток при посеве в низкой плотности, - в присутствии линейно-специфичных факторов дифференцировались в клет-ки костной ткани. Для исследования использовали клетки 2-3 пассажей. Однако физические, морфологические и фенотипические признаки также не являются специфическими критериями, которые могут быть использованы для точной идентификации АМСККП. Способность АМСККП к индуцирован-ной дифференцировке in vitro в кости, жир и хрящ является единственным кри-тическим требованием для определения предполагаемых популяций стволовых клеток.
Индукция остеогенной дифференцировки мезенхимальных стволовых клеток in vitro: МСК имеют различную морфологию, что зависит, в первую очередь, от способов их получения и культивирования. Поэтому перед приме-нением необходимо проведение теста на возможность дифференцировки в за-данном направлении (Tallheden T. et al., 2003). Поскольку АМСККП свойственна дифференцировка в клетки костной ткани и условия ее проведения наиболее воспроизводимы, этот вид дифферен-цирования обычно используют для характеристики культур стволовых клеток in vitro и он является типичным заданным по умолчанию путем развития для большинства АМСККП в культуре. Для индукции остеогенной дифференци-ровки использовали 0,1 M дезоксиметазон, 50 M аскорбиновую кислоту и 10 mM -глицерофосфат («Sigma», США), вызывающие остеогенную дифференци-ровку (Niemeyer P. et al., 2004; Montjovent M.O. et al., 2004; Minamide A. et al., 2005; Cao T. et al., 2005; Laino G. et al., 2006; Romero-Prado M. et al., 2006; Chai G. et al., 2006; Jger M., Krauspe R., 2007; Song S.J. et al., 2007; Bischoff D.S. et al., 2008; Liu J. et al., 2009а, 2009б; Park K.H. et al., 2009; Reichert J.C. et al., 2009; Hamidouche Z. et al., 2009, 2010; Shi X. et al., 2010; Wang Y. et al., 2010; Korecki C.L. et al., 2010; Hu J. et al., 2010).
Остеогенную дифференцировку определяли по 2 маркерам: по актив-ности щелочной фосфатазы и минерализации межклеточного матрикса ионами кальция. Цитохимическое выявление щелочной фосфатазы проводили с использованием нитротетразолиевого синего в присутствии субстрата щелоч-ной фосфатазы 5-бромо-4-хлоро-3-индолила. Накопление кальция в межклеточ-ном матриксе регистрировали по окрашиванию Ализарином красным. Использование АМСККП, выделенных у одних особей крыс, для введе-ния другим особям основано на результатах многочисленных литературных со-общений, что недифференцированные МСК не экспрессируют поверхностные маркеры иммуногенности, не вызывают иммунного ответа даже после аллоген-ной и ксеногенной трансплантации, также ингибируется пролиферация алло-генных Т-клеток, подавляются воспалительные и имунные процессы (Arinzeh T.L. et al., 2003; Niemeyer P. et al., 2004, 2010б, 2010в; Zhao Z.Y. et al., 2005; Liu H. et al., 2006; Wulf G.G. et al., 2006; Bourin P., Gadelorge M., 2007; Sotiropoulou P.A. et al., 2007; Sotiropoulou P.A., Papamichail M., 2007; Patel S.A. et al., 2008; Iyer S.S., Rojas M., 2008; Meng E. et al., 2008; Caplan A.I., 2009; Poncelet A.J. et al., 2009; Undale A.H. et al., 2009; Yamaza T. et al., 2010; Charbord P., 2010). Эм-бриональные МСК также не обладают иммуногенными свойствами и проявля-ют иммуносупрессивный эффект (Heng B.C. et al., 2005а, 2005б; Poncelet A.J. et al., 2009).
После применения ксеногенной трансплантации МСК человека для реге-нерации дефекта большеберцовой кости длиной 3 мм у овец, было получено более быстрое заживление. При этом не было локальных и системных реакций на длительное присутствие ксеногенных МСК. Вместе с этим, использование аутологичных МСК сопровождалось еще более быстрым формированием кости (подтверждено сравнением минерализации коллагена) (Niemeyer P. et al., 2010б, 2010в).
Для ускорения формирования хряща аллогенные МСК без иммуносупрес-сии вводили на пористом керамическом контейнере из бета-трикальция фосфа-та в нормальную суставную полость овец. Спустя 8 недель не было гистологи-ческих (лимфоцитарная реакция) и биохимических (антитела против аллоген-ных МСК) признаков иммунологического конфликта. Не было различий в фор-мировании хряща из аллогенных или аутологичных МСК. В условиях примене-ния контейнера без МСК образования хрящевой ткани не найдено (Zhao Z.Y. et al., 2005).
Восстановление строения костной ткани после введения мезенхимальных стволовых клеток
Численная плотность всех клеток в просвете мозговых синусов лимфати-ческих узлов через 1 и 2 недели после начала эксперимента была больше в 3,2 и 2,5 раза, соответственно, по сравнению с контролем. Кроме того, спустя 1 неде-лю величина значения этого показателя была больше в 2,5, 2,3 и 2,2 раза, соот-ветственно, относительно состояния на 3, 4 и 5 неделях (рис. 30-33) (табл. 9).
Процент лимфоцитов через 1, 2 и 5 недель после начала эксперимента был ниже на 89,8%, 39,7% и 24,7%, соответственно, по сравнению с контролем. Кроме того, спустя 1 неделю величина значения этого показателя была меньше на 68,3%, 65,9% и 52,2%, соответственно, относительно состояния на 3, 4 и 5 неделях (рис. 30-33) (табл. 9).
Относительное содержание иммуно- и плазмобластов возросло к 1 неделе, но далее достоверно не отличалось от исходного. Величина значения этого по-казателя через 1 неделю была выше в 5,8, 7,3 и 6,5 раза, соответственно, чем в контроле и спустя 4 и 5 недель (табл. 9).
Точно также, но еще более выражено, менялась численная плотность им-муно- и плазмобластов. Этих клеток через 1 неделю было больше в 14,6, 17,5 и 15,6 раза, соответственно, по сравнению с состоянием в контроле и спустя 4 и 5 недель (табл. 9).
Процент плазматических клеток к 4 неделе стал статистически достоверно больше на 61% и 57,8%, соответственно, относительно контроля и аналогично-го показателя на 1 неделе. Этот показатель на 5 неделе был больше на 53,3%, но только относительно контроля (табл. 9).
Абсолютное содержание плазмоцитов к 2 неделе было выше в 3 раза, по сравнению с исходными значениями (табл. 9).
Относительное число ретикулярных клеток постепенно возрастало и на 5 неделе стало больше на 26,6%, 48,8%, 51% и 34,2%, соответственно, относи-тельно состояния в контроле и спустя 1, 2 и 3 недели (табл. 9).
Численная плотность клеточных элементов стромы к 2 неделе была выше в 2,7 раза, по сравнению с исходным значением (табл. 9).
Процент моноцитов был больше на 90,3%, чем в контроле, только по ис-течении 1 недели после начала эксперимента (табл. 9).
Численность этих лейкоцитов на единицу площади среза была выше ис-ходной на 1 и 2 неделе, но на остальные сроки не отличалась от контроля. Ве-личина значения этого показателя через 1 неделю была выше в 5,8, 4, 4,3 и 3,5 раза относительно контроля и состояния на 3, 4 и 5 неделях после начала экспе-римента. Спустя 2 недели моноцитов было больше в 3,7, 2,5, 2,7 и 2,2 раза, так-же соответственно, и также по сравнению с контролем и состоянием спустя 3, 4 и 5 недель (табл. 9).
Через 1 неделю относительное количество макрофагов было больше в 3,9, 2,7, 3,2 и 3,9 раза, соответственно, чем в контроле и на 3, 4 и 5 неделе. Спустя 2 недели этих клеток стало больше в 2,9, 2, 2,4 и 3 раза, также соответственно, относительно контроля и состояния на 3, 4 и 5 неделе (рис. 30-33) (табл. 9).
Величина значения абсолютной численности макрофагов через 1 неделю была выше в 12,2, 6,6, 7,5 и 9 раз, относительно контроля и на 3, 4 и 5 неделях после начала эксперимента. На 2 неделе макрофагов было больше в 7,2, 3,8, 4,4 и 5,3 раза, также соответственно, и также по сравнению с контролем и состоя-нием спустя 3, 4 и 5 недель (рис. 30-33) (табл. 9).
К 1 неделе процент нейтрофилов был больше в 3,9, 2,6, 3,2 и 3 раза, соот-ветственно, чем в контроле и на 3, 4 и 5 неделе. Через 2 недели таких лейкоци-тов стало больше в 3, 2,4 и 2,3 раза, также соответственно, относительно кон-троля и состояния на 4 и 5 неделе (табл. 9).
Численная плотность нейтрофильных лейкоцитов через 1 неделю была выше в 12,2, 6,1, 7,2 и 6,7 раза относительно контроля и на 3, 4 и 5 неделях по-сле начала эксперимента. Спустя 2 недели данных клеточных форм было боль-ше в 7,3, 3,7, 4,3 и 4 раза, также соответственно, и также по сравнению с кон-тролем и состоянием спустя 3, 4 и 5 недель (табл. 9).
Относительное число эритроцитов через 1 неделю после начала экспери-мента было выше в 8, 5,3 и 4,3 раза, соответственно, чем в контроле и на 3 и 4 неделе (табл. 9).
Абсолютное количество эритроцитов через 1 неделю было больше в 2,5, 13,9, 10,4 и 10,4 раза относительно контроля и состояния на 3, 4 и 5 неделях (табл. 9).
Процент клеток с признаками деструктивных изменений резко увеличился к 1 неделе, оставался повышенным на 2 неделе, далее это показатель постепен-но уменьшался и на 3 неделе и позже достоверно не отличался от исходного. Величина значения этого показателя через 1 неделю была выше в 2,4 раза, на 83,2%, в 2,3 раза и на 92,4%, соответственно, чем в контроле и на 3, 4 и 5 неде-ле. На 2 неделе нежизнеспособных клеток было больше в 2,1 и 2 раза, также со-ответственно, относительно контроля и состояния на 4 неделе (табл. 9).
Аналогично менялось абсолютное число клеток с деструктивными изме-нениями. Спустя 1 неделю величина значения этого показателя была выше в 8, 4,5, 5,4 и 4,2 раза, соответственно, чем в контроле и на 3, 4 и 5 неделе. На 2 не-деле клеточных форм с признаками деструкции было больше в 5,6 и 3,8 раза, также соответственно, и также относительно контроля и состояния на 4 неделе (табл. 9).
Сравнительная морфология костной ткани после воздействия различными способами на репарацию ее дефекта
Через 1 неделю после моделирования дефекта кости и заполнения его БТФС, в одном случае весь дефект был заполнен молодой грануляционной тка-нью с большим числом кровеносных сосудов (рис. 34). Не исключено, что у данного животного в месте операции был септический воспалительный про-цесс. У других крыс отверстие кости было полностью заполнено слившимися островками вновь сформированной кости. То есть регенерация кости после применения БТФС уже к 1 неделе привела к полному заполнению искусствен-ного дефекта (рис. 35).
В большинстве случаев через 2 недели после создания дефекта в кости и заполнения его БТФС, отверстие так же, как и при спонтанной регенерации, было закрыто вновь образованной костной тканью с большим числом полно-кровных кровеносных сосудов на периферии дефекта и хрящевой тканью в цен-тре (рис. 36). В одном случае весь дефект костной ткани был заполнен рыхлой волокнистой соединительной тканью с очень широкими кровеносными сосуда-ми с тонкими стенками (скорее всего, островки грануляций), следует отметить связь сосудов этого отверстия с сосудами корня нижнего центрального резца (рис. 37). Спустя 3 недели после моделирования дефекта в кости нижней челюсти и применения БТФС, также как и без использования фибрина, отверстие было полностью закрыто вновь образованной костной тканью с хаотично располо-женными костными балками сформированной костной мозоли и полостями с костным мозгом.
На 4 неделе после заполнения дефекта кости БТФС отверстие, так же как и при самостоятельном заживлении, было полностью заполнено костной тка-нью. Однако в одном случае, когда при производстве операции был поврежден корень нижнего центрального резца, дефект кости сохранялся. Края дефекта со-стояли из нежизнеспособных тканей, в самом дефекте и в окружающих тканях находились костный детрит и остатки тканей ростовой зоны поврежденного зу-ба. Признаков регенерации дефекта тканей не было даже на этот срок, не было формирования кровеносных сосудов и регенерации красного костного мозга. Фактически были морфологические признаки хронического остеомиелита кости нижней челюсти (рис. 38).
После применения БТФС на 5 неделе дефект кости был полностью запол-нен вновь образованной костью. Если же в процесс создания дефекта костной ткани вовлечен корень резца, восстановления зуба не было отмечено, в тканях его корня и в кости нижней челюсти, непосредственно прилегающей к корню, присутствовало много костного детрита, нежизнеспособных костных тканей и были довольно выражены признаки воспаления. Но даже в таких случаях сле-дует отметить наличие некоторых несомненных признаков начала регенерации (рис. 39, 40).
После статистической обработки данных денситометрии процессов реге-нерации дефекта кости нижней челюсти крыс при естественном заживлении и после применения БТФС было обнаружено отсутствие достоверных различий плотности тканей в очаге между сравниваемыми группами животных на каж-дую точку исследования. При естественном заживлении плотность кости в дефекте была меньше соответствующего здорового участка на контралатеральной стороне на 1, 2, 3 и 5 неделях на 12,1%, 11%, 10,5% и 9,3%, соответственно. На срок в 4 недели достоверных отличий с другой стороной не было. То есть при естественном хо-де репаративной регенерации происходит медленное и постепенное возрастание плотности костной ткани в искусственно созданном отверстии, но даже к концу наблюдения (5 недель) не произошло нормализации плотности ткани в дефекте (рис. 41-45) (табл. 10).
После использования БТФС плотность кости в дефекте была меньше, от-носительно состояния на противоположной кости только на 1 и 2 неделях на 9,5% и 4,9%, соответственно. При этом произошло резкое увеличение плотно-сти тканей в патологическом очаге на срок в 1-2 недели после операции, по сравнению с состоянием при спонтанной регенерации. А далее, начиная с 3 не-дели и вплоть до 5 недели, плотность тканей медленно уменьшалась, практиче-ски сравниваясь с величинами значений данных показателей при естественном ходе репаративной регенерации (рис. 41-45) (табл. 10).
При этом плотность тканей при естественном ходе репаративных процес-сов статистически значимо отличалась от здоровой кости на контралатеральной стороне в течение 3 первых недель и на 5 неделе, а на фоне использования БТФС – только на 1 и 2 неделях. То есть плотность тканей в дефекте после применения фибрина была выше и раньше происходила нормализация значения этого показателя (рис. 41-45) (табл. 10).
Кроме этого необходимо отметить, что на все сроки наблюдения плот-ность тканей в патологическом очаге после применения БТФС была несколько больше, чем при естественном ходе репарации, хотя такая разница и была не-достоверна. Максимальные различия плотности тканей были отмечены в пери-од со 2 по 4 неделю, к 5 неделе эти различия несколько сглаживаются (табл. 10). Следует обратить внимание, что и при морфологической оценке процессов репарации были также получены данные о нивелировании отличий к концу времени наблюдения.
