Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 6
1.1 Сульфгидрильные соединения и их свойства 6
1.2 Титриметрические методы определения сульфгидрильных соединений в объектах окружающей среды 9
1.3 Спектральные методы анализа объектов окружающей
среды на содержание сульфгидрильных соединений 11
1.4 Хроматографические методы анализа объектов окружающей среды при определении сульфгидрильных соединений 20
1.5 Электрохимические методы определения сульфгидрильных соединений в объектах окружающей среды 27
1.6 Другие методы (газометрические, термометрические, кинетические, радиохимические, микробиологические) анализа объектов окружающей среды при определении сульфгидрильных соединений 39
1.7 Электрохимическое поведение сульфгидрильных соединений на электродах различного типа 43
1.8 Анализ литературного обзора и постановка задачи 59
2 Экспериментальная часть 61
2.1 Используемые реактивы и оборудование 61
2.2 Методика определения концентрации сульфгидрильных соединений методом вольтамперометрии 62
3 Результаты и их обсуждение 68
3.1 Оптимизация условий формирования РПЭ для определения цистеина 68
3.2 Электрохимическое исследование процессов на РПЭ 70
3.3 Вольтамперометрическое определение сульфгидрильных
соединений с использованием РПЭ на стеклоуглеродной подложке 81
Выводы 93
Список литературы 94
- Титриметрические методы определения сульфгидрильных соединений в объектах окружающей среды
- Электрохимические методы определения сульфгидрильных соединений в объектах окружающей среды
- Методика определения концентрации сульфгидрильных соединений методом вольтамперометрии
- Электрохимическое исследование процессов на РПЭ
Введение к работе
Определение сульфгидрильных (SH-) соединений - важная задача в медицине, фармации, пищевой, микробиологической и косметической промышленности. Известно, например, что содержание SH-групп в "безбелковом фильтрате" сыворотки крови позволяет диагностировать ранние стадии онкозаболеваний. Благодаря высокой чувствительности, экспрессности и селективности для этих целей широко применяют электрохимические методы анализа, обеспечивающие высокие аналитические характеристики вольтамперометрического определения указанных соединений. Вместе с тем, большинство из этих методик являются косвенными и отличаются сложностью, длительностью подготовки проб и реактивов, многостадийностью, недостаточно высокой точностью и экологической безопасностью. Таким образом, проблема разработки более универсальных методик анализа SH-соединений до сих пор остается актуальной.
При определении сульфгидрильных соединений в настоящее время применяют ртутные пленочные электроды (РПЭ) с подложкой из благородных металлов, использование для этих целей в качестве подложки различных углеродных материалов мало изучено. В практике аналитических лабораторий широко известен стеклоуглерод, благодаря его однородности, практически беспористой структуре и легкости механической обработки. В связи с этим особый интерес представляет изучение поляризационных процессов, протекающих на поверхности РПЭ на стеклоуглеродной подложке в присутствии сульфгидрильных соединений.
Целью настоящей работы являлось изучение электрохимического поведения SH-соединений на РПЭ с подложкой из стеклоуглерода для разработки чувствительной и экспрессной методики их определения на примере цистеина.
Для достижения поставленной цели было изучено электрохимическое поведение малорастворимого соединения цистеината ртути, образующегося на поверхности РПЭ в присутствии цистеина, подобраны оптимальные условия формирования РПЭ, концентрирования электроактивного малорастворимого
соединения, оптимизированы условия определения сульфгидрильных соединений на примере цистеина, изучено мешающее влияние сопутствующих компонентов.
Диссертационная работа выполнялась в рамках грантов РФФИ по исследованию закономерностей формирования вольтамперометрического аналитического сигнала на твердых электродах в анализе объектов окружающей среды (гранты №№ 00-03-32351, 03-03-32969, 03-03-96548).
Научная новизна:
1 Изучены электрохимическое поведение и особенности формирования
аналитического сигнала (АС) на РПЭ в процессе вольтамперометрического
определения SH-соединений на примере цистеина.
2 Разработана методика вольтамперометрического определения
сульфгидрильных соединений в водных растворах с использованием РПЭ на
стеклоуглеродной подложке.
3 Установлена возможность суммарного определения SH-соединений в
биологических объектах и пищевых продуктах с использованием цистеина в
качестве вещества-стандарта.
Практическая ценность работы: разработана селективная и экспрессная вольтамперометрическая методика определения сульфгидрильных соединений в различных объектах.
Представленный в настоящей работе вольтамперометрический метод определения сульфгидрильных соединений с использованием сенсора из стеклоуглеродного материала с нанесенной на него ртутной пленкой включен в лабораторный практикум по спецкурсу "Электрохимические методы исследования" для специальности 011000 - химия по кафедре аналитической химии Кубанского госуниверситета.
На защиту выносятся:
результаты исследования условий формирования РПЭ на стеклоуглеродной подложке для целей определения сульфгидрильных соединений;
результаты исследования концентрирования электроактивного малорастворимого соединения SH-rpynn с ртутью и его электрохимическое поведение на поверхности РПЭ на стеклоуглеродной подложке;
методика вольтамперометрического определения сульфгидрильных соединений в водных растворах с использованием РПЭ на стеклоуглеродной подложке и результаты анализа различных объектов окружающей среды;
схема анализа биологических объектов и пищевых продуктов на содержание SH-соединений.
Апробация работы: Материалы диссертации изложены на Всероссийской конференции "Актуальные проблемы аналитической химии" (Москва, 2002), на Всероссийской научно-практической конференции "Электрохимия органических соединений" (Астрахань, 2002), на Международном симпозиуме "Разделение и концентрирование в аналитической химии" (Краснодар, 2002), на Международном форуме "Аналитика и аналитики" (Воронеж, 2003), на II Международной конференции по новым технологиям и приложениям современных физико-химических методов для изучения окружающей среды (Ростов-на-Дону, 2003), на V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2003" с международным участием (Санкт-Петербург, 2003).
Публикации. По материалам диссертационной работы опубликовано 9 работ, в том числе 6 тезисов, 2 статьи, подана заявка на выдачу патента РФ на изобретение (приоритет от 13.05.2003).
Структура и объем работы: Диссертация состоит из введения, литературного обзора, экспериментальной части, обсуждения результатов и списка литературы. Работа изложена на 122 страницах, содержит 21 рисунок и 9 таблиц. Библиография включает 289 наименований работ российских и зарубежных авторов.
Титриметрические методы определения сульфгидрильных соединений в объектах окружающей среды
Для определения сульфгидрильных соединений применяют различные титриметрические методы, в частности, иодометрический [14-17], в котором реакция простых меркаптанов выражается уравнением: и меркуриметрический [15, 18], в котором реакция в зависимости от условий может протекать в нескольких направлениях; в частности последний метод может быть основан на реакции:
Однако, иодометрический метод не пригоден для широкого применения ввиду значительного влияния рН среды, температуры, концентрации титранта, а также возможность протекания окисления в различных направлениях. Попытки разработать условия, в которых тиольная группа вела бы себя одинаково в различных соединениях, оказались неудачными. Меркуриметрический метод, предложенный Фритцем и Пальмером [15], в отличие от других методов, нашел практическое применение. В этом методе меркаптан титруют перхлоратом ртути (II) в ацетоновом или водном растворе в присутствии буфера и с тиокетоном Михлера в качестве индикатора. При этом определению меркаптанов не мешают органические и неорганические хлориды и бромиды, ненасыщенные соединения, а также другие серусодержащие функциональные группы. Главные трудности определения обусловлены присутствием элементарной серы, неорганических сульфидов, иодидов, цианидов и тиокарбоксильных соединений.
Для определения сульфгидрильных соединений также широко используются методы прямого титрования растворами периодата калия [17, 18], иодата калия [17], бромата калия [17], фенотиазона-3 [19], N-бромсукцинимида [20, 21], меди (II) [17, 22], феррицианида калия [17]. Все эти методы основаны на окислении цистеина в цистин.
Реакция комплексообразования лежит в основе титриметрического метода определения гидрохлорида L-цистеина, основанного на титровании аминокислоты стандартным раствором сульфата никеля в присутствии 1-(пиридил-2 -азо)-нафтола-(2) в качестве индикатора. В результате реакции образуется комплексное соединение Ni - цистеин состава 2:3 [23]. Однако этот метод не отличается высокой чувствительностью и не позволяет определять цистеин в присутствии других аминокислот.
Методами прямого и обратного титрования исследовано окисление цистеина действием хлорамина Т и дихлорамина Т. Метод прямого титрования тиолов стандартными растворами этих реагентов в присутствии KI, H2SO4 и крахмала рекомендован для быстрого и точного анализа тиолов. Метод обратного титрования стандартным раствором тиосульфата непригоден для определения цистеина [24].
В работе [25] предложен титриметрический метод определения меркаптанов и серусодержащих аминокислот окислением щелочным раствором КМп04 при комнатной температуре в присутствии ионов бария (И). В ходе титрования Мп04 восстанавливается до Мп(Х Барий осаждается в виде соли бария, что предотвращает дальнейшее восстановление марганца (VII) до МпОг. Титрование ведут до исчезновения розовой окраски раствора.
Описан метод определения аминокислот, в том числе и цистеина, предусматривающий взаимодействие их с 2-нитробензолсульфенилроданидом, разложение избытка реагента щелочью и водой, обработку образовавшегося 2-нитробензолсульфенамида кислотой и иодометрическое определение полученного 2-нитробензолсульфенилхлорида [26].
Известны способы определения цистеина методом обратного титрования. По одной методике [27] к раствору цистеина прибавляют 50%-ный избыток слабощелочного раствора о-иодозобензоата калия и раствор аскорбиновой кислоты, избыток которой оттитровывают раствором иода. Другая методика [28] основана на окислении цистеина раствором 1 -хлорбензотриазола в присутствии 0,01 М раствора НС104 и иодометрическом титровании избытка ю f 1-хлорбепзоіриазола. Определению не мешают ионы Na , К+, Ва"+, NO3"", РО4 , ClOf и SO/ . Мешают ионы Hg2+ (более 5 мкг/мл), Си2+ (более 5 мкг/мл) и СГ (0,35 мг/мл).
многореагентностью, многостадийностью и трудоемкостью, что ограничивает возможность их применения. Спектральные Таким образом, титриметричекие методы определения SH-соединений отличаются методы анализа объектов окружающей среды на содержание сульфгидрильных соединений
Спектральные методы широко применяются для определения цистеина. Большое значение для обнаружения и количественного определения аминокислот имеет их реакция с нингидрином. Даже весьма разбавленные водные растворы нингидрина при небольшом нагревании дают интенсивное сине-фиолетовое окрашивание ("пурпур Руэманна") с цистеином (X 570 нм) [29, 30].
Данный метод непригоден для практического применения, так как отсутствует селективность, мала чувствительность реакции.
Для цистеина высокоспецифичной цветной реакцией является реакция Салливана. Цистеии при этом дает характерную красно-коричневую окраску с 1,2-нафтохинон-4-сульфонатом натрия в сильно восстанавливающей среде (например, гидросульфита натрия) [4, 16]. Несмотря на специфичность реакции, окраска очень слаба и весь метод слишком сложен. О наличии цистеина в некоторых белках можно судить по положительной цветной реакции с нитропруссидом в разбавленном растворе щелочи или ЫНз (фиолетово-красное окрашивание) [16, 31, 32]. Эту реакцию применяют для определения CySH и его гидрохлорида в чистом виде и в готовых лекарственных формах [33].
Электрохимические методы определения сульфгидрильных соединений в объектах окружающей среды
Методами классической, синусоидальной и дифференциальной импульсной полярографии, а также кулонометрии при постоянной силе тока и контролируемом потенциале исследован механизм электрохимического восстановления цистеина и цистина и разработана методика анализа их смеси. Определение проводят при рН 9,2, на подпрограммах наблюдается три пика (Ei/2= -0,535; -0,625; -0,91 В), первый соответствует цистеину, а два следующих - восстановлению цистина [167].
Возможность количественного определения цистеина и ряда других аминокислот прямым полярографическим методом в водном 85%-ном диметилформамиде, насыщенным по тетраметиламмоний йодиду показана в работе [166]. Появление полярографической волны восстановления слабых кислот обусловлено в данном случае разрядом ионов водорода (-Е/2=1,52-1,86 В относительно ртутного дна). Предельные токи исследованных волн имеют кинетическую составляющую и пропорциональны концентрации кислоты в пределах 1-10 -1,5-10-2 М.
Методом переменнотоковой полярографии изучено электрохимическое поведение цистеина и цистина на фоне 0,01-0,5 М НС104 [170]. Найдено, что при рН 1,5 цистин полярографически не активен; при рН 1,5 наблюдают необратимый невоспроизводимый пик (Пкі) в интервале потенциалов от -0,3 до -0,8 В относительно насыщенного каломельного электрода. На полярограмме цистеина наблюдаются анодные несимметричные пики Пк2 и Пк3 при потенциалах -0,18 и 0,32 В соответственно (концентрация НС104 0,02 М), зафиксированные как на фарадеевской, так и на емкостной составляющих тока. При увеличении концентрации кислоты Пк2 на фарадеевской составляющей тока раздваивается и сдвигается в область более анодных потенциалов. Изучена зависимость высот и потенциалов Пк2 и Пк3 от рН (емкостная составляющая тока) и частоты переменного напряжения (фарадеевская составляющая тока). Полагают, что Пк2 отвечает образованию комплекса 2:1 цистеина с ртутью. При низких концентрациях НСЮ4 можно количественно определить цистеин в присутствии цистина.
Авторы [171] изучили анодные реакции цистеина на ртутных электродах. В водных растворах, содержащих цистеип, анодные реакции на ртутном электроде включают электроокисление ртути в двух отдельных стадиях: до цистеинатов ртути (I) и (II), которые прочно адсорбируются на электроде. При низких заполнениях поверхности электрода продуктами электроокисления ртути цистеинат Hg+ образуется в области потенциалов второй стадии путем нефарадеевского поверхностного процесса диспропорционирования адсорбированного тиолата Hg . Это сопровождается изменением емкости электрода. Путь электродной реакции определяется формой цистеината ртути (II) в адсорбированном состоянии, которая сильно зависит от рН раствора.
Метод катодной инверсионной вольтамперометрии применен для изучения электрохимического поведения хлоргидрата цистеина и других тиолов [177]. Предварительное накопление производили на стационарном ртутном электроде при 0,85 В (относительно насыщенного каломельного электрода) в ацетатном буферном растворе с рН 4,76 в течение 1 мин. Потенциал катодного пика -0,119 В. Высота пика линейно увеличивается с ростом концентрации в интервале 0,4-1,2 мкА.
Катодная квадратно-волновая инверсионная вольтамперометрия на электроде типа ВРК была использована для определения цистеина и других серосодержащих соединений [184]. Линейный диапазон определяемых концентраций цистеина наблюдался в интервале 5 10 7—5 10-9 М.
Определение цистеина может проводиться методом анодной инверсионной вольтамперометрии с электродом типа ВРК с амальгамой меди вместо чистой ртути [185]. На рабочем электроде первоначально концентрируют медный комплекс цистеина при потенциале 0,06 В относительно каломельного электрода, а после этого при анодной поляризации измеряют высоту пика при 0,06 В, которая пропорционатьна концентрации в области 0,02-1 мкмоль/л цистеина при времени накопления 1 мин. Определению мешают железо, висмут, сурьма, бром, йод, роданид-ион, тиомочевина, глутатион и желатин.
Ряд работ посвящен изучению поведения сульфгидрильмых соединений и разработке методики их определения по каталитической волне выделения водорода [172, 173, 180]. Полярографическим методом изучены каталитические волны водорода (Е]/2 = -1,25 В по насыщ. к. э.) и никеля (Еи2 = -0,6 В) в ацетатном буферном растворе с рН 6, содержащем цистеин и NiCb [180]. Показано, что в электродных реакциях участвуют комплексы никеля (II) с цистеином. Электродные процессы, отвечающие возникновению как водородной, так и никелевой предволн, тесно связаны между собой, так как комплексы Ni (0) образуются при каталитическом разряде Ni (II) и действуют как катализаторы реакции выделения водорода. Предложен механизм электровосстановления, учитывающий зависимость поверхностной концентрации восстанавливающихся частиц от потенциала электрода.
Kuik М. и др. [172] показали возможность определения гемоглобина в присутствии цистеина и наоборот с применением каталитических токов Брдички, т.е. каталитических волн водорода, получаемых в аммиачном растворе Со (II). В качестве фонового электролита выбран аммиачный фоновый раствор с оптимизированным составом. Изучено влияние концентрации аммиака на форму каталитической волны гемоглобина, цистеина и глутатиоиа в крови. Установлена зависимость каталитического тока от концентрации этих веществ в аммиачном буферном растворе. Отмечено искажение нисходящей части каталитической волны в том же буферном растворе в присутствии цистеина, что может быть признаком присутствия цистеина в растворах гемоглобина, но цистеин практически не влияет на величину каталитического тока гемоглобина. При постоянной концентрации последнего каталитический ток аминокислоты линейно зависит от ее концентрации. На угловой коэффициент градуировочного графика влияет концентрация гемоглобина.
Методика определения концентрации сульфгидрильных соединений методом вольтамперометрии
Методика определения концентрации сульфгидрильных соединений вольтамперометрическим методом заключается в формировании РПЭ, накоплении электроактивного соединения SH-групп с ртутью на поверхности РПЭ при разомкнутой цепи и последующей регистрации катодного или анодного аналитического сигнала (АС).
Определение сульфгидрильных соединений проводят в "безбелковом фильтрате"сыворотки крови. Для получения сыворотки из цельной крови проводят ее термостатирование при 36С в течение 30 мин с последующим центрифугированием образца при 7000 об/мин в течение 15 мин, затем 2 см3 сыворотки последовательно обрабатывают 1 см3 0,5 М NaOH и, после выдерживания в течение 30 мин, 1 см3 3,3 М НСЮ4. Через 5 мин удаляют белки фильтрованием через бумажный фильтр и анализируют полученный "безбелковый фильтрат" сыворотки крови.
При определении сульфгидрильных соединений в пробах мочи, пива, сока образец фильтруют через бумажный фильтр и анализируют. Анализ твердых пищевых продуктов (дрожжи, мясо) проводят после перевода определяемого компонента из пробы в раствор. Для этого навеску дрожжей (1,000 г) растирают и прибавляют 10 см3 бидистиллированной воды, а навеску мяса (10,00 г) растирают, прибавляют 10 см3 бидистиллированной воды, затем 10 см3 фонового электролита (ОД М NaClCu + 0,1 М НСЮ4) и снова тщательно растирают. Полученный раствор фильтруют и анализируют.
Вольтамперометрическое определение сульфгидрильных соединений в анализируемых растворах проводят на полярогафе ПУ - 1 с использованием трехэлектродной системы: индикаторный электрод - стационарный РПЭ со стеклоуглеродной подложкой диаметром 2 мм, электрод сравнения -хлоридсеребряный (нас), в качестве вспомогательного электрода используют стеклоуглеродную чашку, в которой находится анализируемый раствор.
Для формирования РПЭ стеклоуглеродный электрод (СУЭ) помещают в трехэлектродую ячейку (электрод сравнения - хлоридсеребряный (нас), вспомогательный - стеклоуглерод (СУ)), содержащую 20 см3 раствора состава: 0,1 М КО + 1-Ю"4 М Hg(N03)2, и проводят электролиз при потенциале -0,5 В в течение 180 с. Сформированный РПЭ аккуратно промывают, переносят в другую электрохимическую ячейку, содержащую анализируемый раствор, и регистрируют вольтамперограммы в переменно-токовом режиме с квадратно-волновой модуляцией. Для получения воспроизводимых вольтамперных кривых необходимо проведение механической регенерации поверхности электрода.
Перед анализом пробы проводят проверку электрохимической ячейки и фонового раствора на чистоту. Для этого в электрохимическую ячейку вносят 20 см3 фонового электролита состава 0,1 М NaC104 + 0,1 М НС104. Установив необходимые режимы работы полярографа согласно табл.1, предварительно сформированный, как описано выше, РПЭ выдерживают в течение 120 с в анализируемом растворе при разомкнутой цепи, затем регистрируют катодные или анодные вольтамперные кривые в диапазоне потенциалов (+0,2 (-1,0))В, которые в отсутствие SH-соединений имеют вид, представленный на рис.1. При наличии на вольтамперограммах пиков токов содержимое ячейки выливают, ее моют, а поверхность электрода регенерируют и вновь формируют РПЭ.
Для анализа проб в ячейку вносят 18 см3 фонового электролита состава 0,1 М NaGC»4 + 0,1 М HCIO4 и 2 см3 подготовленной пробы, предварительно сформированный РПЭ выдерживают в течение 120 с в анализируемом растворе при разомкнутой цепи и регистрируют катодные или анодные вольтамперные кривые как в случае чистого фонового электролита.
Высоты катодных и анодных АС, наблюдаемых в присутствии SH-соединений, пропорциональны их концентрации. Способ измерения высоты АС представлен на рис.2.
Для определения SH-соединений в образцах использовали метод стандартной добавки. При этом в качестве вещества-стандарта SH-соединений используют цистеин.
Для применения РПЭ на стеклоуглеродной подложке для анализа различных SH-соединений важной проблемой являлась необходимость формирования его поверхности с воспроизводимыми свойствами, позволяющими контролировать содержание определяемого компонента с высокой чувствительностью и воспроизводимостью.
Для этого первоначально отрабатывались два способа нанесения ртутной пленки на подложку: а) одновременным формированием ртутной поверхности и концентрированием определяемого компонента; б) предварительным формированием РПЭ с последующим концентрированием определяемого компонента. Наиболее целесообразным представляется использование режима "in situ", однако в присутствии цистеина в данном режиме не удалось зарегистрировать хорошо воспроизводимых катодных и анодных вольтамперных кривых, что, по-видимому, объясняется образованием прочных малорастворимых соединений с ртутью в растворе. Поэтому необходимо предварительное формирование РПЭ в растворе, не содержащем цистеин.
Формирование РПЭ на стеклоуглеродной подложке проводили в электролите состава МО"1 М KN03 + МО М Hg(NOj 2 при потенциале -0,5 В, так как в кислой среде при более отрицательных потенциалах возможно выделение на поверхности электрода водорода, и, как следствие, ухудшение качества формируемой пленки.
Используя сформированный РПЭ регистрировали вольтамперограммы в переменно-токовом режиме с квадратно-волновой модуляцией в фоновом электролите состава 0,1 М NaC104 + 0,1 М НСЮ4, содержащем определяемый компонент (цистеин). Для получения воспроизводимых вольтамперных кривых необходимо проведение механической регенерации поверхности электрода.
При оптимизации условий формирования РПЭ изучали зависимость высот пиков катодных и анодных АС от времени электролиза, которая имеет вид кривой с насыщением (рис.3). При малом времени формирования РПЭ (менее 180 с) повышение сигналов свидетельствует об увеличении степени заполнения поверхности электрода агрегатами из атомов ртути, которые при большем времени электролиза (180 с и более) полностью закрывают поверхность стеклоуглерода, образуя слой ртути. При этом площадь поверхности РПЭ, а, следовательно, и высоты АС, мало изменяются [278].
Изучение циклических вольтамперных кривых, полученных в кислых растворах перхлората натрия, содержащих цистеин, показало, что катодный сигнал несколько выше анодного при незначительной разнице потенциалов максимумов пиков (рис.4). Катодный сигнал обусловлен восстановлением цистеинатов ртути, образующихся на поверхности РПЭ, а анодный - вероятно, окислением цистеината ртути (І) в цистеинат ртути (II). Образование малорастворимого соединения на поверхности электрода наблюдается как при наложении положительных и отрицательных потенциалов, так и при разомкнутой цепи, что подтверждается наличием АС и в этих условиях (рис.5). Полученные пики тока не зависят от начального потенциала развертки (рис.6).
Электрохимическое исследование процессов на РПЭ
Во многих случаях в биологических объектах и пищевых продуктах присутствуют различные SH-соединения. При определении содержания сульфгидрильных соединений в этих объектах было проведено сопоставление уравнений градуировочных кривых для цистеина и трипептида - глутатиона, а также результатов попеременного дозирования обоих веществ. Градуировочные графики имеют примерно одинаковый наклон (2,04-104; 2,03-104 и 2,10-104; 2,15-104 для катодных и анодных АС цистеина и глутатиона соответственно) и одинаковый вклад в величину сигналов (табл.4). Это подтверждает предположение об участии в электрохимическом процессе малорастворимых соединений, образующихся при взаимодействии различных сульгидрильных веществ с ртутью на поверхности РПЭ.
Были проанализированы модельные смеси цистеина и глутатиона в различных соотношениях методом градуировочного графика и методом стандартной добавки с использованием цистеина в качестве вещества-стандарта (табл.5). Цистин и окисленный глутатион определяются совместно с цистеином и глутатионом, так как дают такие же продукты взаимодействия со ртутью [261]. Таолица 4 - Результаты попеременного дозирования цистеина и глутатиона (п = 3; Р = 0,95)
Учитывая тот факт, что АС для всех SH-соединений является суммарным, представляется возможным использование цистеина в качестве вещества-стандарта для их определения.
При анализе реальных образцов наряду с определяемым соединением присутствуют сопутствующие компоненты, которые могут влиять на аналитические характеристики определения цистеина. Выбор посторонних ионов и веществ обусловлен возможностью образования ими соединений с цистеином или ртутью. Установлено, что среди различных компонентов (тяжелые металлы, различные аминокислоты, мочевина) мешающее влияние оказывает только 100-кратный избыток ионов меди (II) (табл.6).
Были разработаны схемы анализа биологических объектов (схема 4) и пищевых продуктов (схема 5). Наиболее перспективное направление создания аналитических схем основывается на минимизации числа операций и, по возможности, совмещения в пространстве и времени в расчете на многоцелевое назначение. Схема анализа содержит пробоотбор, пробоподготовку, собственно определение (измерение), обработку результатов и сравнение полученных данных с литературными. В случаях, когда невозможно добиться гармоничного совмещения во времени и пространстве всех операций, входящих в схему, используется создание схем анализа с разрывом отдельных стадий, но также построенных по блочно-модульному принципу. При этом следует развивать методы и приемы концентрирования, обеспечивающие избирательное выделение матрицы либо микрокомпонентов с близкими свойствами [286].
Обработка результатов Разработанная методика применена для определения суммарного содержания сульфгадрильных соединений в биологических объектах ("безбелковом фильтрате" сыворотки крови, моче) и ряде пищевых продуктов (пиве, соках, дрожжах, мясе) методом стандартной добавки (табл.7) [287]. При этом предпочтительнее использовать катодные АС, так как они имеют более четкую форму, менее подверженную влиянию матрицы. Из табл.7 видно, что концентрация SH-групп в "испорченных" дрожжах несколько выше, чем в свежих. Это, вероятно, свидетельствует о возможности вдальнейшем разработки методики определения сульфгадрильных групп как суммарного показателя качества дрожжей.
Результаты анализа "безбелкового фильтрата" сыворотки крови онкобольных (7 образцов) и условно здоровых (9 образцов) показали, что АС по цистеину для первой группы образцов выше в 2-3 раза, чем для второй. По-видимому, наработка большого объема статистических данных по содержанию сульфгидрильных соединений в "безбелковом фильтрате" сыворотки крови позволит разработать методику диагностики разных стадий онкозаболеваний [288, 289].
Влияние варьирования объема пробы на результат анализа (п = 3;Р = 0,95) Анализируемый объект Содержание SH-соединений, мкг/г Объем пробы 2 см" Объем пробы 18 CMJ Дрожжи 0,4 ±0,1 0,5 ±0,1 # выводы
1 Изучено электрохимическое поведение сульфгидрильных соединений, установлены механизмы реакций в катодном и анодном вольтамперометрических процессах, протекающих на ртутно-пленочном электроде на стеклоуглеродной подложке.
2 Рассчитаны кинетические характеристики исследованных электрохимических процессов (величины кажущейся энергии активации, температурных коэффициентов и порядка реакции).
3 На примере цистеина изучены особенности формирования аналитического сигнала и разработана методика вольтамперометрического определения SH-соединений в водных растворах с использованием РПЭ на стеклоуглеродной подложке. Установлены оптимальные условия определения сульфгидрильных соединений (состав фонового электролита, время формирования РПЭ и накопления цистеината ртути, рН, температура, мешающее влияние сопутствующих компонентов и др.).
4 Обоснована и экспериментально доказана возможность вольтамперометрического определения суммарного содержания SH-соединений с использованием цистеина в качестве вещества-стандарта.
5 Разработанная методика вольтамперометрического определения сульфгидрильных соединений апробирована на различных биологических объектах ("безбелковом фильтрате" сыворотки крови, моче) и ряде пищевых продуктов (пиве, соках, дрожжах, мясе). Показана возможность использования разработанной методики для контроля качественных характеристик вышеперечисленных объектов.
Похожие диссертации на Вольтамперометрическое определение сульфгидрильных соединений в биологических объектах и пищевых продуктах
