Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 9
1.2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография 11
1.2.1. Удерживание и разрешение 12
1.2.2. Эффективность 15
1.2.3. Селективность 16
1.2. Псевдостационарные фазы на основе низкомолекулярных соединений 23
1.3. Псевдостационарные фазы на основе полимерных соединений 32
1.3.1. Полимерные мицеллы 33
1.3.2. Анионные полимеры 38
1.3.3. Катионные полимеры , 45
1.3.4. Дендримеры 46
1.3.5. Полимерные псевдостационарные фазы, содержащие хиралъпый селектор 48
1.3.6. Смешанные полимерные псевдостационарные фазы 49
1.4. Полиэлектролитные комплексы 51
2. Приборы, аппаратура, техника эксперимента 62
3. Результаты и обсуждение 66
3.1. Получение полиэлектролитных комплексов 66
3.2. Апробация комплексов в качестве псевдостационарных фаз 72
3.2.1. Комплексы приготовленные в присутствии бромида натрия 72
3.2.2. Комплексы приготовленные в отсутствии бромида натрия 78
3.2.2. Область применимости комплексов в качестве псевдостационарных фаз 93
3.3. Электрофоретическая подвижность полиэлектролитных комплексов и полиакриловых кислот , 91
3.4. Селективность ПЭК по сравнению с СДС 110
3.6.1. Производные фенола 111
3.6.2. Дансип-производные аминокислот .,. 117
3.6.3. Карбобензокси- производные аминокислот 123
3.6.4. Бутоксикарбомоил-проюводные аминокислот 126
3.5. Зависимость электрофоретических параметров разделения от концентрации и основных характеристик комплексов . 129
3.5.1. Концентрация комплекса в буферном электролите 131
3.5.2. Состав полиэлектролитного комплекса (f) 139
3.5.3. Степень полимеризации полиакриловой кислоты (Pw), её полидисперсность... 145
3.5.4. Длина алкильного радикала 148
3.6. Аналитические приложения 153
3, б. 1. Одновременное определение дансил- и карбобензокси-производных аминокислот 153
3.6.2. Определение кофеина в моче 155
3.6.3. Контроль качества лекарственных средств цефоперазона и цефотаксима... 159
3.6.4. Определение стереоизомеров при иодировании гомологов бензойной кислоты через таллирование 161
Выводы 163
Литература
- Псевдостационарные фазы на основе низкомолекулярных соединений
- Полимерные псевдостационарные фазы, содержащие хиралъпый селектор
- Комплексы приготовленные в отсутствии бромида натрия
- Зависимость электрофоретических параметров разделения от концентрации и основных характеристик комплексов
Введение к работе
В последнее десятилетие метод капиллярного электрофореза получил такое же широкое распространение, как жидкостная и газовая хроматография. На сегодняшний день уже стало понятно, что капиллярный электрофорез не заменит жидкостную хроматографию, как считали многие ученые в начале девяностых годов прошлого века, а является методом, дополняющим хроматографию и имеющим свою область применения.
В классическом капиллярном зонном электрофорезе (КЗЭ), разделение основано на различии в собственных электрофоретических подвижностях определяемых соединений. Этот вариант электрофореза используется для анализа заряженных соединений в виде анионов или катионов. В МЭКХ разделение основано на различном распределении определяемых компонентов пробы между псевдостационарной (мицеллярной) фазой и окружающим ее буферным раствором. Метод мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ), в отличие от варианта КЗЭ, позволяет определять как заряженные, так и незаряженные соединения и на сегодняшний день МЭКХ является одним из наиболее широко используемых вариантов капиллярного электрофореза.
Актуальность темы. Природа псевдостационарной фазы оказывает решающие влияние на взаимодействие между ней и разделяемыми соединениями, з, следовательно, и на селективность и эффективность электрофоретического разделения. По этой причине выбор и поиск новых псевдостационарных фаз является важной задачей. В последнее десятилетие наблюдается большой интерес к использованию псевдостационарных фаз на основе различных полимерных соединений. Применение псевдостационарных фаз на основе высокомолекулярных соединений позволяет решить многие проблемы, существующие при использовании классических мицелл: разделение смесей сильно гидрофобных смесей, высокая критическая концентрация мицеллообразования, существование точки Крафта и низкая устойчивость при большом содержании органического модификатора.
Цель работы. Полиэлектролитные комплексы ионогенных поверхностно активных веществ (ПАВ) с линейными противоположно заряженными полиэлектролитами, образующиеся при смешении водных растворов исходных компонентов, представляют собой соединения, стабилизированные кооперативной
системой солевых связей и гидрофобными взаимодействиями. Целью данного исследования было изучение возможности использования водорастворимых полиэлектролитных комплексов (ПЭК) в качестве нового типа псевдостационарных фаз в мицеллярной электрокинетической хроматографии. Конкретные задачи были следующими:
- поиск области существования водорастворимых и устойчивых комплексов,
образованных полиакриловой кислотой (ПАК) и солями четвертичных аммониевых
оснований, в условиях электрофоретического эксперимента;
- изучение влияния приложенного внешнего напряжения в разделяющем кварцевом
капилляре на полиэлектролитные комплексы, выступающие, как в качестве
псевдостационарной фазы, так и в качестве определяемых соединений в варианте
капиллярного зонного электрофореза;
измерение электрофоретической подвижности полиакриловых кислот и полиэлектролитных комплексов;
- апробация полиэлектролитных комплексов в качестве псевдостационарных фаз для
разделения и определения ряда замещенных фенолов, дансил-, карбобензокси- и
бутоксикарбомоил-производных аминокислот;
сравнение основных электрофоретических характеристик разделения для полиэлектролитных комплексов и псевдостационарных фаз, образованных классическими мицеллообразователями (додецилсульфатом натрия, СДС и др.);
изучение влияния основных параметров полиэлектролитных комплексов: степени полимеризации полиакриловой кислоты (Pw), длины алкильного радикала аммониевого основания (Сп), состава полиэлектролитного комплекса (ф) и содержания комплекса в разделяющем буфере на селективность и эффективность разделения;
установление механизма взаимодействия разделяемых анализируемых соединений с псевдостационарной фазой на основе полиэлектролитных комплексов.
Научная новизна. Впервые полиэлектролитные комплексы были предложены в качестве принципиально нового типа псевдостационарных фаз в МЭКХ.
Найдена область значений основных параметров полиэлектролитных комплексов, состава буферного электролита и условий электрофоретического
Псевдостационарные фазы на основе низкомолекулярных соединений
Наличие большего перечня псевдостационарных фаз с различными селективностями предоставляет большое преимущество при разработке методики анализа. С другой стороны, большое количество вариантов выбора делает процесс подбора псевдостационарной фазы очень трудоемким и долгим. Эта проблема возникает в случае разделения сложных смесей или сильно гидрофобных соединений, когда критичен подбор наиболее приближенных к оптимальным условий. Ранее, в связи с отсутствием данных о химической природе взаимодействия между псевдостационарной фазой и определяемым соединением, выбор псевдостационарной фазы и оптимизация условий проводили путем многократных проб и ошибок, в основном основываясь на опыте аналитика. Для решения этой проблемы Янг с сотр. [25,261 предложили методологию, основанную на линейном отношении энергии сольватации (linear solvation energy relationships - LSER), что позволяет получать полезную информацию о природе взаимодействия между псевдостационарной фазой и аналитом. Разные механизмы взаимодействия приводят к различной селективности. В LSER зависимость между удерживанием определяемых соединений (log к ) и их структурными свойствами описывается согласно следующему уравнению: log Г = SP0 + mV/100 + SK + bp + аа 1.4 где V - молярный объем соединения, ж - мера способности соединения вступать с диполь-дипольные (поляризационные) взаимодействия с растворителем, /Ї и а - основность и кислотность соединения, соответственно. Три параметра тг /Ї и а рассчитываются по сольвато-хромному сравнительному методу. SPQ является константой, которая несет информацию об отношении содержания псевдостационарной фазы и водной фазы, и зависит от концентрации мицелл.
Используя ряд замещенных ароматических соединений в качестве тестовых, были получены характеристики разных мицеллярных псевдостационарные фаз с использованием метода LSER. Коэффициенты т, s, b и а в уравнении 1.4, характеризующие мицеллярные псевдостационарные фазы и число соединений, которые использовались для расчета этих параметров представлены в табл. 2.
На основании данных представленных в табл. 2, можно сделать вывод, что размер аналита играет наиболее важную роль в удерживании, поскольку значение коэффициента т наибольшее, по сравнению с другими. Положительное значение этого коэффициента показывает, что большие по объему молекулы будут иметь более сильное взаимодействие с псевдостационарной фазой и, следовательно, сильнее удерживаться. Следующий по величине коэффициент для большинства систем (за исключением LiPFOS системы) -Ъ , который показывает, что образование водородной связи в варианте, когда растворитель выступает донором, а анализируемое соединение акцептором, является вторым по величине вкладом в удерживание для большинства изученных систем. В данном случае вполне закономерен отрицательный знак у коэффициента Ь, чем больше по модулю его значение, тем более сильные акцепторные свойства имеет соединение, следовательно, оно будет меньше распределяться в мицеллу и слабее удерживаться. Это так же объясняется тем, что естественно, вода является большим донором протонов, чем любая мицеллярная фаза и более основные анализируемые соединения будут иметь большее сродство к водной фазе буфера, чем к мицеллам.
По сравнению с бензолом, замещенные ароматические соединения, такие как нитробензол, динитробензол, имеют больший размер и являются более сильными акцепторами водородной связи. Больший размер замещенных бензолов приводит к более сильным взаимодействиям с псевдостационарной фазой по сравнению с бензолом, но с другой стороны, их большая основность снижает распределение в мицеллы. Таким образом, видно, что отношение этих противоположных по знаку факторов и определяет в большинстве случаев, взаимодействие между соединениями и псевдостационарной фазой [9].
Индексы удерживания, предложенные Муиселаром и сотр. [27,28], так же могут использоваться для изучения и характеристики селективности в МЭКХ. Данные индексы являются хорошим параметром для сравнения специфичных взаимодействий между аналитами и псевдостационарной фазой и являются хорошей характеристикой удерживания для различных систем. Авторами работы [29] было продемонстрировано, что индексы удерживания применимы для классификации аналитов в рамках селективности функциональных групп разделяемых соединений.
Относительно новое и малоизученное направление - это использование смешанных мицелл в качестве псевдостационарных фаз в МЭКХ [30-32]. При добавлении любого ионогенного или неионогенного мицеллообразующего реагента, к системе с устойчивой псевдостационарной фазой образованной другим детергентом, даже при очень низких концентрациях, добавка может существенно изменить гидрофильные/гидрофобные свойства поверхности раздела между мицеллой и окружающим ее водным раствором. Следовательно, псевдостационарные фазы с различными солюбилизирующими свойствами могут быть получены целенаправленно для оптимизации селективности.
На рис. 4 показан пример селективности разделения смесей ряда действующих веществ лекарственных препаратов с использованием псевдостационарных на основе СДС, триоксиэтиленалкилацетата натрия (ЕСТ), и смешанной псевдостационарной фазы. Бромид тимепидиума использовался в качестве маркера миграции мицелл. Псевдостационарная фаза образованная 50 мМ ЕСТ, проявляет существенно меньшее взаимодействие с разделяемыми соединениями в сравнении с аналогичной фазой с СДС. Относительное удерживание на смешанной псевдостационарной фазе, как и следовало ожидать, меньше чем при использовании только СДС и больше, чем при использовании только ЕСТ. Интересен тот факт, что наблюдается существенное изменение в селективности для смешанной псевдостационарной фазы (рис, 4).
Литтл и Фолей [33] предложили смешанную псевдостационарную фазу, образованную ионогенным и неионогенным мицеллообразователями, додецилсульфатом натрия и полиоксиэтилен(23)додеканолом (Brij 35). Для данной смешанной системы было продемонстрировано, что наблюдаемые изменение в селективности разделения могут быть объяснены различным сродством образующих детергентов к образованию водородной связи [29]. В следующей работе [30] сообщается об использовании смешанных псевдостационарных фаз состоящих из детергентов желчных солей и СДС для разделения смеси кортикостероидов. Смешанные псевдостационарные фазы, содержащие хиральный центр у одного из детергентов могут использоваться для разделения энантиомеров Г34-36].
Полимерные псевдостационарные фазы, содержащие хиралъпый селектор
Катионные полимеры (рис. 14) также использовали в качестве псевдостационарных фаз в МЭКХ. Положительно заряженные молекулы полимера адсорбируются на поверхности капилляра, изменяют знак поверхности на положительный и направление электроосмотического потока изменяется.
Озаки и Ичихара [11] первыми предложили использование катионного полимера метакрилат-метакрило-оксиэтилтриметаламмоний хлорида (ВМАС, рис. 14А). В связи с низкой растворимостью ВМАС в воде, использовали буферные электролиты, содержащие 20% изопропанола. Селективность разделения не отличается от полученной для его анионного аналога ВВМА (рис. 10А).
Полиэтиленимин (PEI, рис. 14Б) использовали для разделения фенолов и ряда других соединений [105-108]. Сильные взаимодействия, где большую роль играют ионные взаимодействия, Наблюдаются между фенолами и PEI (хотя фенолы недиссоциированы при рН эксперимента). Полифенолы удерживаются согласно числу гидроксильных групп [108]. Чем большее число групп, тем сильнее удерживание. Добавки органических модификаторов-метанола или ацетонитрила оказывают негативное влияние на селективность и эффективность разделения в случае PEI [107].
Структуры катионных полимеров. (А) ВМАС, (В) PEI, (С) ПДАДМА. Полидиаллилдиметиламмоний (ПДАДМА, рис. 14В), был предложен в качестве катионной псевдостационарной фазы в работах [109-116]. По сравнению с типичными полимерами, используемыми в МЭКХ, данный гидрофильный полимер не обеспечивает достаточного удерживания большинства классов органических соединений, даже тогда, когда его содержание в буфере велико и составляет 3-4% [109].
Селективность и эффективность разделения различных классов соединений с использованием ПДАДМА, 3,6-ионена (Полибрен) и низкомолекулярных катионных псевдостационарных фаз сравнена в работе [ПО]. На полибрене олигофенолы имели очень сильное удерживание, основанное на ионообменном механизме взаимодействия. В разделение нафтолов основной вклад вносит удерживание их на полимере или низкомолекулярном детергенте, адсорбированном на поверхности капилляра. За исключением нафтолов, остальные исследуемые соединения имеют различный порядок выхода на полимерных и низкомолекулярных катионных фазах.
Математическая модель для нахождения коэффициентов диффузии определяемых соединений в присутствии ПДАДМА была предложена Майчелом и соавторами [111]. Полидиаллилдиметиламмоний был использован для разделения ряда нейролептических соединений в лекарственных препаратах [112]. Авторы [113] использовали смешанную псевдостационарную фазу ПДАДМА-р-циклодекстрин, для достижения достаточной селективности разделения, основанной как на ионообменном механизме, так и на гидрофобных взаимодействиях, для разделения модельных смесей неорганических и органических анионов.
Дендримеры - это сильно ветвящиеся полимеры, получающиеся с помощью многостадийного синтеза путем наращивания разветвляющейся структуры на исходное ядро (рис. 15). В результате получается полимер, имеющий четко определенную химическую и пространственную структуру, молекулярную массу и размер. Еще одним существенным преимуществом данных полимеров является то, что такие параметры, как гидрофобность, гидрофильность и природа функциональных групп и, отсюда, электрофоретическая подвижность закладываются на стадии синтеза. Дендримеры на основе амидов с концевыми карбоксильными группами показали хорошую селективность и эффективность разделения для алкилпарабенов и ряда гидрофобных лекарственных веществ без добавок органического модификатора
Танака с соавторами [117, 118] использовали в качестве псевдостационарной фазы коммерческие исходные и модифицированные дендримеры. Бутил-, октил-, додецил- и тетрадецил-модифицированные дендримеры были синтезированы. Селективность немодифицированных дендримеров отличалась очень сильно по сравнению с низкомолекулярными мицеллами и алкил-модифицированными дендримерами. ПАУ были разделены в присутствии 40% метанола. Селективность разделения сравнивали с системой, содержащей 200 мМ СДС и метанол в качестве органического модификатора [117]. Разница в селективности разделения на дендримерах по сравнению с СДС проиллюстрирована на рис. 16. Для исходного дендримера наблюдается сильная разница в удерживании между бензольными и нафталиновыми производными, но отсутствует различие в удерживании для веществ, содержащих разные функциональные группы (рис. 16А), Малое различие в удерживании наблюдали для алкилбензолов (селективность к метиленовой группе 1). Наилучшую селективность разделения показал SBD-Cg, благодаря хорошей разнице в удерживании, как по гидрофобности, как и по групповой селективности.
Авторы работы [119] использовали добавку дендримеров с анионными и катионными концевыми группами для повышения селективности разделения протеинов в биологических объектах. Коммерчески доступные дендримеры с привитыми сульфоновыми концевыми группами применяли для разделения изомеров метил- и диметилфенолов [120]. Селективность разделения была существенно лучше по сравнению с СДС. Наибольшая эффективность разделения достигалась при больших концентрациях дендримера в буфере.
Комплексы приготовленные в отсутствии бромида натрия
В связи с отсутствием в литературе каких-либо данных о поведении полиэлектролитных комплексов ПАК-АІкТМАБ и ПМАК-АІкТМАБ под действием приложенного напряжения (300-400 В/см) и возможного их взаимодействия с поверхностью немодифицированного кварцевого капилляра, имеющего отрицательно заряженные силанольные группы - необходимо было провести серию экспериментов с использованием кварцевых капилляров, внутренняя поверхность которых модифицирована поливиниловым спиртом (PVA): К5 и К9 (табл. 8). В данном случае кварцевая поверхность гидрофобизирована ковалентно привитыми молекулами поливинилового спирта, не заряжена при любом значении рН буфера и, следовательно, электрофоретический поток отсутствует.
Предварительно были найдены электрофоретические подвижности дансил-производных аминокислот с использованием немодифицированного капилляра. Электрофореграмма смеси шести производных с использованием в качестве буферного электролита 50 мМ фосфата, рН 6.0, без дополнительных добавок представлена на рис. 27. На основании полученных данных о времени выхода пиков соответствующих ЕОП, времен выхода производных, характеристик капилляра и приложенного напряжения была найдена электрофоретическая подвижность производных аминокислот (более подробно схема расчетов электрофоретических подвижностей приводится ниже).
Найдено что, электрофоретическая подвижность производных находится в диапазоне от -2.6 до -2.4 10 4 см2/В сек. Данные значения являются физико-химической характеристикой соединений и показывают с какой собственной скоростью в см/сек данные соединения двигаются при приложении напряжения равного 1 В/см. Эти значения не зависят от используемого прибора и размеров капилляра, знак минус обозначает, что они движутся в направлении анода, против направления движения электроосмотического пока, и имеют отрицательный заряд.
На рис. 28 представлены электрофореграммы двух вводов смеси пяти дансил-производных аминокислот (DNS-OH примесь). Буфер содержит 34 мМ полиэлектролитного комплекса Pw = 1800/ДТАБ, р = 0.3 (без NaBr), капилляр К5, модифицированный поливиниловым спиртом. Основные параметры электрофоретического разделения для производных аминокислот рассчитаны и представлены в табл. 11. При разделении подобной смеси в тех же условиях, но без добавления полиэлектролитного комплекса в буфер наблюдали группу неразрешенных пиков с окном миграции от 8.5 до 9.7 мин. Данное время выхода полностью согласуется с найденными ранее значениями подвижностей дансил-производных. Для того чтобы удостовериться, что именно полиэлектролитный комплекс является причиной различия в удерживании анализируемых соединений, в боратный буфер вместо комплекса было добавлено 30 мМ полиакриловой кислоты ПАК4, Pw=1800. Разделения пиков в данном случае не происходило, время выхода группы пиков с полиакриловой кислотой и без нее практически совпадало (аналогично рис. 27).
На основании приведенных выше данных можно сделать вывод, что разделение смеси дансил-производных аминокислот происходит благодаря присутствию в буфере полиэлектролитного комплекса. Комплекс проявляет сильное дифференцирование в удерживание производных аминокислот, например в отсутствии комплекса времена выхода DNShr и DNS-Leu отличаются менее чем на одну минуту, а после добавки комплекса разница достигает 15 минут. Использовать общепринятые параметры для описания емкостного фактора удерживания в данном случае мы не могли, поскольку для этого необходимо знать время выхода электрофоретического потока (to) и времени миграции мицелл (tm). амп ft. s ast ,ю Htt-жі .га (FJWMA jnzt. o nAntft.s9-2s1.1a ягкяип (JMVFM.mas .9
Определить временя миграции псевдостационарной фазы или собственную электрофоретическую подвижность полиэлектролитного комплекса на данном этапе исследования не удалось. Использование общепринятого маркера миграции мицелл -Судана III, а также, нафтола и фенантрена не привело к успеху - пика соответствующего времени миграции ПЭК на электрофореграмме не наблюдали.
Для количественно описания вклада псевдостационарной фазы в удерживание дансил-производных аминокислот была рассчитана разница в подвижности Дц (табл. 11) до и после добавки комплекса. Без полиэлекролитного комплекса в буфере подвижность всех пяти производных составляла от -2.6 до -2.4 10" см /В сек. Чем больше разница в удерживании, тем больше и изменениие подвижности. Собственное движение буфера отсутствует - ЭОП=0, а производные и ПЭК заряженные отрицательно, движутся в одном направлении сторону детектора (анода).
Зависимость электрофоретических параметров разделения от концентрации и основных характеристик комплексов
Семь дансил-производных аминокислот: дансил-треонин (DNShr), дансил-серин (DNS-Ser), дансил-валин (DNS-Val), дансил-метионин (DNS-Met), дансил-лейцин (DNS-Leu), дансил-норлейцин (DNS-NorLeu) и дансил-фенилаланин (DNS-Phe) с разными свойствами исходных аминокислот, гидрофобностью и долей заряженной и незаряженной формы были выбраны в качестве второй модельной смеси для изучения свойств псевдостационарных фаз на основе полиэлектролитных комплексов (рис. 49).
Согласно значениям pKa карбоксильных групп аминокислот (которые находятся в пределах от 2.2 до 2.6 [159]), все производные аминокислот, несмотря на влияние дериватизируюшего агента, должны быть отрицательно заряжены в условиях эксперимента (рН 6.0). Напротив, из данных по распределению между заряженной и незаряженной формами производных аминокислот при рН 6.0 только у дансил-серина и дансил-треонина карбоксильная группа диссоциирована на 90%, и отрицательно заряженная форма превалирует над незаряженной формой (табл. 15). То, что все семь производных имеют общий отрицательный заряд подтверждается электрофореграммой (рис. 50), полученной с использованием 50 мМ фосфатного буфера рН 6.0 без каких-либо добавок псевдостационарных фаз. В данном случае реализуется вариант капиллярного зонного электрофореза и разделение основано только на разнице в собственных элетрофоретических подвижностях аналитов. Все семь производных аминокислот мигрируют протав направления движения ЭОП (в сторону входного конца капилляра - аноду) и выходят в виде группы неразрешенных пиков. Электрофоретическая подвижность ЭОП равна 5.5 10 4 см2/В сек, электрофоретическая подвижность всех семи производных аминокислот лежит в диапазоне от -2.6 до -2.4 10"4 см2/В сек. То что электрофоретические подвижности производных отличаются незначительно, обусловлено тем, что все они имеют одинаковую, объемную, достаточно гидрофобную и большую по сравнению молекулой исходной кислоты дансил-ьную группу. Также небольшая разница в подвижностях согласуется с тем, что согласно рКа карбоксильных групп все производные должны иметь равный отрицательный заряд [159].
Небольшое противоречие возникает с данными полученными расчетным способом, с использованием программного продукта ACD lab (табл. 15), ведь различие на порядок между заряженними и незаряженными формами производных, например для DNS-Ser и DNS-Leu должно было, по нашему мнению, приводить к существенной разнице в электрофоретических подвижностях, и соответственно, к существенной разнице во времени миграции.
Электрофореграммы, подобные представленным на рис. 50А, — группа неразрешенных пиков с очень близким временем удерживания - были получены с использованием фосфатного буфера с добавками полиакриловых кислот (без ПАВ, комплекс не образуется) на уровне от 8 до 50 мМ со степенями полимеризации Pw 320 и 1800. То что добавки полиакриловой кислоты не влияют на удерживание и дансил-производных и фенолов, очень существенно, так как это позволяет сделать выводы о том, что, во-первых полиакриловая кислота не образует в данных условиях мицелло-подобных агрегатов, взаимодействующих с аналитами, во-вторых, отсутствуют ионообменные взаимодействия, вносящие существенный вклад в удерживание между поликислотой и производными аминокислот или фенолами.
Отрицательно заряженные дансил-производные мигрируют против направления движения ЭОП в сторону входного конца капилляра (анода), добавка полиэлектролитного комплекса ПАК/ДТАБ в буфер приводит к разделению смеси производных на индивидуальные пики рис. 50Б. Это происходит благодаря различию в удерживании (распределению между фазой и окружающим буферным раствором) разных производных в мицелло-подобном агрегате псевдостационарной фазы на основе ПЭК. Времена миграции дансил-производных увеличиваются с увеличением содержания ПЭК в разделяющем буфере (рис. 50В). Это является одним из основных доказательств того, что здесь реализуется распределительный механизм удерживания, лежащий в основе метода МЭКХ.
Порядок миграции дансил-производных аминокислот следующий: DNShr DNS-Ser DNS-Val DNS-Met DNS-Leu DNS-NorLeu. В сравнении с СДС псевдостационарной фазой полиэлектролитные комплексы Р№=1800/ДТАБ (ф=0.1-0.3) и Р№=3500/ДТАБ (ф=0.1-0.3) проявляют аналогичный порядок выхода при разделении дансил-производных аминокислот (рис. 51).
Даже в присутствии 5 мМ комплекса Р,У=1800/ДТАБ (ф=0.3) в качестве псевдостационарной фазы пики шести производных аминокислот (кроме дансил-фенилаланина) полностью разрешены.
Необходимо отметить, что пика, принадлежащего DNS-Phe не было обнаружено при использовании комплекса со степенью полимеризации Pvv= 1800 и ДТАБ. Даже, когда в качестве пробы использовался раствор с различным содержанием только одного дансил-фенилаланина 1-50 мкг/мл. Наиболее гидрофобная и большая из всех производных молекула дансил-фенилаланина могла бы необратимо связываться с мицелло-подобным агрегатом комплекса. В таком случае он являлся бы маркером времени удерживания (скорости движения) мицелл, но мы не смогли получить какой-либо пик, соответствующий времени миграции псевдостационарной фазы даже при увеличении времени анализа до 1.5 часов. В предположении о том, что подвижность комплекса превосходит подвижность ЭОП, мы изменили полярность прилагаемого напряжения и ввели зону пробы в центр капилляра, чтобы исключить вымывание зоны пробы ЭОП при подаче напряжения. С другой стороны в случае ПЭК ПАК Pw=1800/flTAE дансил-фенилаланин возможно вообще не взаимодействовал с комплексом из-за своего большого размера. Хотя в случае полиэлектролитного комплекса, образованного кислотой с существенно большей степенью полимеризации Pw=6250 и ДТАБ (ф=0.2 и 0.3) и, следовательно, большим размером внутримолекулярной фазой, удалось получить пик, принадлежащий DNS-Phe.
На рис. 52 приведена зависимость относительного удерживания дансил-производных аминокислот для СДС псевдостационарной фазы и псевдостационарной фазы, образованной ПАК Р№=1800/ДТАБ (ф=0.3). Относительное удерживание увеличивается с увеличением гидрофобности соединения, поскольку более гидрофобные соединения имеют большее сродство к мицеллярной фазе. DNShr и DNS-Ser, заряженные отрицательно и имеющие отрицательный LogD показывают другой характер зависимости, так как комбинация гидрофобных взаимодействий с псевдостационарной фазой и собственная электрофоретическая подвижность вносит вклад в относительное удерживание.
