Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы. Применение циклодекстринов в жидкостной хроматографии 9
1.1. Краткая характеристика циклодекстринов 9
1.2. Циклодекстрины как основные компоненты подвижных фаз в тонкослойной хроматографии 13
1.3. Применение циклодекстринов в составе подвижных фаз в ВЭЖХ 22
1.4. Разделение методом ВЭЖХ на сорбентах, модифицированных
циклодекстринами 30
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 42
2.1. Объекты исследования 42
2.2. Техника эксперимента в тонкослойной хроматографии 47
2.3. Расчет коэффициентов распределения в системе вода - ЦД - НФ 49
ГЛАВА 3. Хроматографическое поведение сорбатов в водных подвижных фазах, модифицированных органическими растворителями, электролитами и циклодекстринами 54
3.1. Влияние природы и концентрации органического растворителя 54
3.2. Влияние концентрации и природы ионов сильного электролита 62
3.3. Влияние концентрации и природы циклодекстринов 66
3.4. Совместное влияние циклодекстринов и органических растворителей 84
3.5. Совместное влияние циклодекстринов и сильных электролитов 88
ГЛАВА 4. Количественные характеристики разделения сорбатов в циклодекстрнновых подвижных фазах в отсутствие и присутствии сильных электролитов 94
ГЛАВА 5. Практическое применение метода ТСХ в подвижных фазах на основе циклодекстринов и электролитов 100
5.1. Определение степени чистоты эритрозина с применением циклодекстрнновых ПФ на основе ГП-у-ЦД 100
5.2. Разделение бинарных смесей реагентов ряда флуоресцеина 104
5.3. Идентификация красителей в пищевых объектах и лекарственных препаратах 104
5.4. Количественное определение индигокармина в капсуле лекарственного препарата "Интетрикс" 106
5.5. Хроматографическое определение тартразина в фруктовых леденцах "Бон Пари" 108
5.6. Хроматографическое определение производных 8-оксихинолина в лекарственных препаратах 109
Выводы 112
Литература
- Циклодекстрины как основные компоненты подвижных фаз в тонкослойной хроматографии
- Техника эксперимента в тонкослойной хроматографии
- Влияние концентрации и природы ионов сильного электролита
- Идентификация красителей в пищевых объектах и лекарственных препаратах
Введение к работе
Циклодекстрины (ЦД) применяются в различных областях аналитической химии для улучшения эффективности разделения и определения органических соединений, в фармацевтической химии для повышения стабильности, улучшения растворимости и биологической активности лекарственных препаратов, в парфюмерии для фиксации летучих веществ, сельском хозяйстве для стабилизации неустойчивых гербицидов, инсектицидов и фунгицидов, в пищевой промышленности и т.д..
Уникальной способностью ЦЦ является образование комплексов включения «гость-хозяин», в которых полость циклодекстрина выступает в роли «хозяина» для широкого круга органических и неорганических молекул и ионов, образуя соединения за счет гидрофобного, дисперсионного взаимодействий и водородной связи. Избирательность включения определяется соответствием размера полости циклодекстрина размеру молекулы-гостя, а также эффективностью связывания субстрата с внутренней поверхностью полости ЦД.
Известно, что ЦД широко применяются в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) и гораздо реже в тонкослойной хроматографии (ТСХ). В связи с этим возможности их использования в ТСХ в полной мере не изучены. Это касается как круга веществ, которые можно разделять в подвижных фазах на основе ЦД, так и влияния на процесс разделения сильных электролитов и органических растворителей, способных изменять условия солюбилизации веществ в полости ЦД. В связи с этим, необходима постановка системных исследований, направленных на изучение действия указанных факторов и выявление путей оптимизации хроматографического разделения в методе ТСХ.
Цель работы заключается в выявлении закономерностей хроматографического разделения органических соединений методом ТСХ в водных подвижных фазах модифицированных циклодекстринами.
Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить влияние природы и концентрации органического растворителя и сильных электролитов на хроматографическое разделение органических соединений различных классов методом ТСХ;
выявить влияние природы неподвижной фазы и ЦД (размер полости и присутствие заместителя), совместное влияние ЦД и органического растворителя, ЦД и электролита на закономерности хроматографического поведения сорбатов в методе ТСХ;
рассчитать коэффициенты распределения сорбатов в системах вода -ЦД и вода НФ и параметры, характеризующие эффективность их разделения;
разработать методики определения степени чистоты препаратов органических реагентов, разделения и количественного определения различных органических соединений и пищевых красителей в реальных объектах.
Научная новизна:
выявлены закономерности влияния концентрации и природы циклодекстринов в подвижной фазе в отсутствие и присутствии сильных электролитов и органических растворителей на подвижность и селективность разделения производных бензола, 8-оксихинолина, аминокислот, органических реагентов трифенилметанового ряда и азосоединений;
рассчитаны коэффициенты распределения сорбатов в системе вода -циклодекстрин и параметры, характеризующие эффективность разделения;
найдены оптимальные условия разделения соединений различных классов в подвижных фазах на основе циклодекстринов, показана возможность применения циклодекстриновых ПФ в ТСХ для
Циклодекстрины как основные компоненты подвижных фаз в тонкослойной хроматографии
Циклодекстрины (ЦД) в тонкослойной хроматографии (ТСХ) используют в составе подвижных фаз (ПФ) для разделения нитроанилинов [4, 5], производных фенола и бензойной кислоты [5-11], витаминов [11], аминокислот [12-16] и аминоспиртов [14], лекарственных препаратов [5, 10, 17-19], пестицидов [5, 20], красителей [10, 15, 21], триазинов [22] нитростиролов [23], полициклических ароматических углеводородов [5, 24, 25], алкалоидов и стероидов [24, 26]. Имеется ряд обзоров, посвященных модификации циклодекстринами подвижных фаз ТСХ [12, 27-29], некоторые авторы сравнивают особенности применения ЦД в ТСХ и ВЭЖХ [30-33].
Показано, что разделение молекул гидрофильных и гидрофобных соединений, основанное на связывании полостью ЦД, часто является более избирательным, чем разделение в соответствующих водно-органических элюентах. Отмечается, что наиболее важным достоинством ПФ на основе ЦД является возможность разделения не только различных по природе соединений, но и их структурных [5, 8, 9-11, 19, 24, 30, 34, 35] и геометрических изомеров [34-35], диастереомеров [26, 31, 34, 36, 37] и энантиомеров [12-16, 19, 24, 26-34, 36, 37].
Представителями наиболее часто используемых ЦД являются р-ЦД [4, 5, 12, 14, 18, 19, 21, 24, 25, 34, 38], а-ЦД [4, 8-11, 14-16, 18, 25, 35, 38] и [3-циклодекстриновый полимер (р-ЦДГТ) [6, 17, 18, 22, 23, 25, 34]; у-ЦД применяется значительно реже [4, 18, 25]. Одним из главных недостатков 3-ЦД является плохая растворимость в воде и органических растворителях. В связи с этим более эффективно применение гидроксиалкильных производных р-ЦД [4, 7, 13, 19-21, 26, 36], 2,6-ди-О-метил-р-ЦД [18, 36, 39], мальтозил-р» ЦД [36] а также карбоксиметилированного ЦД [20], растворимость которых в несколько десятков или сотен раз больше исходного Р-ЦД. Некоторые авторы для повышения растворимости 3-ЦД вводят в ПФ органические растворители [5, 7, 12, 18, 22, 26, 40, 41], мочевину [4, 5, 24] и электролиты [10, 16, 22]. Метод ТСХ предложено применять для определения констант устойчивости комплексов включения с ЦД [42], констант распределения в системе вода-ЦЦ [43], анализа смеси различных ЦД [44].
В качестве неподвижных фаз (НФ) в циклодекстриновой ТСХ используют целлюлозу [10, 14-16, 25, 29], кизельгель 60 F [13], малополярные или гидрофобные сорбенты, например полиамид-6 [5, 8, 9, 21, 25, 40], силикагель марки КС 18F [21, 24-26, 37], RP-18W/UV254 [5, 38], а также пластины с гидрофильными (полярными) сорбентами, которые гидрофобизируют импрегнированием парафиновым (вазелиновым) маслом в н-гексане (5:95 об.%) [4-6, 17-19, 22, 23, 25, 27, 28, 30, 39], а также ТСХ пластины с привитым ЦД [34]. Рассмотренные выше данные по разделению методом ТСХ в ПФ на основе различных ЦД суммированы в таблице 1 (приложение).
Основным механизмом связывания молекул полостью ЦД является гидрофобное взаимодействие. Селективность и величина константы связывания в этом случае определяются соответствием размеров полости ЦД и молекулы гостя, а также геометрией и гидрофобностью гостя.
Анализ литературных данных позволил выявить следующие факторы, влияющие на эффективность применения циклодекстринов в ТСХ: природа и концентрация ЦД; концентрация электролитов и содержание органического растворителя в подвижной фазе; природа неподвижной фазы; геометрическая форма разделяемых соединений наличие оптической изомерии соединений. Рассмотрим влияние этих факторов на конкретных примерах. В работе [20] исследовано влияние концентрации карбоксиметилированного-р-циклодекстринового полимера и электролита на хроматографическое поведение 28 пестицидов (фунгицидов, инсектицидов, гербицидов). Исследования проводили на пластинах силикагель 60, импрегнированных 5%-ным раствором парафинового масла в гексане. Концентрацию циклодекстрина изменяли в интервале от 10 до 50 мг/мл. Установлено, что с увеличением содержания ЦД в ПФ величина Rf сорбатов растет, так как уменьшается их связывание с гидрофобной поверхностью сорбента. Повышение концентрации хлорида натрия в ПФ дополнительно увеличивает подвижность пестицидов.
В ПФ на основе водного раствора а-ЦЦ исследовали хроматографическое поведение производных бензойной кислоты и фенолов на пластинках Полиамид - 6 UV254 [5, 8, 11]. Концентрацию ос-ЦЦ варьировали от 0.01 до 0.1 М. Установлено, что подвижность бензойных кислот и фенолов с увеличением концентрации а-ЦД возрастает (табл. 2). Анализ величины Rf показал, что порядок элюирования замещенных бензойных кислот следующий: пара- мета- орто-изомеры. Высказано предположение, что а-ЦД из-за малого диаметра полости может иметь ограниченное применение. Крупные молекулы, содержащие нафталиновое кольцо, не образуют с ним комплексов включения, поэтому повышение концентрации а-ЦД на величину их Rf практически не влияет.
Согласно данным [9], ПФ на основе водных растворов сх-ЦЦ оказались эффективными для разделения изомеров фенола. Авторы исследовали поведение 21 производных фенола в ПФ с концентрацией а-ЦД от 0 до 0.11 М и установили связь между концентрацией а-ЦД и подвижностью веществ. Отмечено, что среди орто-, пара- и мета-изомеров фенола, как и для бензойных кислот [8], орто-изомер имеет наименьшую величину Rf, мета-изомеры занимают промежуточное место между орто- и пара изомерами.
Техника эксперимента в тонкослойной хроматографии
Природные химически привитые циклодекстрины достаточно часто используют в качестве хиральных НФ для разделения энантиомеров. Авторы работы [112] использовали циклодекстриновые привитые фазы (Р , у-ЦД, их гидроксипропильные, ацетильные, нафтилэтилкарбаматные производные) для разделения оптических форм большого числа ди- и трипептидов. В ПФ, смесях ацетонитрила и метанола с добавками уксусной кислоты и триэтиламина, как правило, достигалось достаточно эффективное разделение энантиомеров (а=1.1-1.3). Использование водно-органической ПФ или введение избытка метанола ухудшало разделение. Найдено, что величины Rg и а весьма чувствительны к незначительным изменениям структуры разделяемых соединений. Особенностью механизма энантиодифференцирования является невозможность образования истинных комплексов включения.
Для обеспечения разделения в ЖХ энантиомеров гексабарбитала перметилированный (3-ЦД связывают с СГ [ИЗ]. Перметилирование гидроксильных групп ЦД усиливает гидрофобные свойства его молекул и улучшает работу в обращённофазовом режиме. С увеличением содержания в ПФ метанола от 0 до 10% происходит монотонное уменьшение Кик7 гексабарбитала. Величины удерживания проходят через экстремум (в интервале значений R = 0-2), а значение коэффициента ёмкости монотонно растёт (в интервале 2-10) с увеличением в ПФ концентрации триэтиламина и уменьшением добавок ледяной уксусной кислоты в интервале 0.1-1.4% (СН3СгЧ:СНзОН = 98:2). Оптимальное разделение получено при содержании триэтиламина и СН3СООН (лед.) - 0.7% и снижении температуры от 35 до 22 С.
Для разделения энантиомеров антихолинергического препарата бромистого оксифенониума использовали К Л с иммобилизованным на лихросорбе Si 100 перметил-Р-циклодекстрином [П4]. Наиболее эффективное разделение достигалось при изократическом элюировании смесью ацетонитрила, метанола и 0.3-0.5% - ного триэтиламмонийацетатного буфера (рН 6.5) в соотношении 4:2:2. При температуре равной 20С а м 1.6, a с повышением температуры колонки разделение заметно ухудшается.
Авторами работы [115] изучено хроматографическое поведение оптически активных производных аминокислот с различными по структуре модификаторами на силикагеле, модифицированном аминированным рецикл од екстрином. Показано, что на распознавательную способность колонки влияет как структура модификатора, так и наличие полярных групп в аминокислоте. Установлено, что данная хиральная неподвижная фаза более селективна к тем аминокислотам, в структуре которых содержится одна амино- или одна кислотная группа. При наличии дополнительных гидрокси-(серин), амино- (аспарагин, аргинин, глутамин) и кислотной (глутаминовая кислота) групп разделения не наблюдается. Присутствие дополнительных полярных групп в структуре заместителя у хирального атома углерода аминокислоты уменьшает удерживание производных АК с о-фталевым альдегидом.
Для разделения 28 замещённых фенолов, авторы работы [116] синтезировали сорбент на основе силикагеля, модифицированного полимерным Р-ЦД. Элюирование проводили смесями метанола и воды, увеличивая содержание спирта в воде от 65 до 80% (скорость элюирования -1 мл/мин). Методом поэтапного регрессионного анализа показано, что липофильность веществ не определяет механизм удерживания на (3-циклодекстрине. Большую роль играют стерические характеристики и электронная структура сорбатов.
ВЭЖХ с использованием природных ЦЦ в качестве неподвижных фаз, обеспечивает разделение ароматических углеводородных кластеров-фуллеренов С60-С84 [П7]. Изменение соотношения полярных органических растворителей в ПФ позволило управлять удерживанием всех фуллеренов. Основные элюенты включали ацетонитрил с добавкой дополнительных модификаторов, например метиленхлорида, хлороформа или толуола. Испытаны альтернативные НФ: природный цикло декстрин и производные ЦД неароматической природы, однако в последнем случае разделение не было достигнуто. Установлено, что механизмы разделения включают к - % и дипольное взаимодействие с НФ; более предпочтительно использование ароматических неподвижных фаз.
Исследовано влияние соотношения метанола и буферного раствора (1%-ный ацетат триметиламмония, рН 4.1) на к1 и разрешение бензоксикарбонил производных аминокислот. Установлено, что минимум удерживания достигается при содержании метанола в ПФ между 30 и 65 об. %. Такой характер зависимости связан с изменением механизма удерживания сорбатов при высоком содержании полярных растворителей. При высокой концентрации органического компонента в ПФ он занимает полости Р-ЦД, делая их недоступными для образования комплекса включения с хиральным соединением. Разделение происходит за счёт образования водородных связей, дипольных и стерических взаимодействий. Исследовано влияние рН ПФ на поведение аминокислот. Установлено, что с увеличением значения рН удерживание сорбатов на циклодекстриновой НФ уменьшается.
Влияние концентрации и природы ионов сильного электролита
Поскольку предполагалось изучить хроматографическое поведение органических соединений различных классов не только в циклодекстриновых ПФ, но и дополнительно модифицировать последние органическими растворителями и электролитами, нами предварительно изучены хроматографические свойства каждой из ПФ отдельно. Таким образом, алгоритм исследования состоял в изучении хроматографического поведения исследуемых соединений в следующих ПФ: вода - органический растворитель, вода - электролит, вода - ЦД, вода - ЦД - органический растворитель, вода - ЦД - электролит.
Влияние природы и концентрации органического растворителя
Предварительные исследования показали, что при использовании цикло декстринов наиболее эффективно применение подвижных фаз средней полярности: полиамида, сорбтона и плазмахрома. В связи с этим, изучено хроматографическое поведение на полиамиде указанных выше рядов соединений в водно-органических ПФ на основе протонных (этиловый, изопропиловый, изобутиловый спирты) и апротонных (ацетонитрил) растворителей, которые наиболее часто применяются в жидкостной хроматографии. Рассмотрим результаты, полученные для различных классов органических соединений. Хинолины
Изучено хроматографическое поведение хинолинов в водно-органических ПФ на основе протонных и апротонных растворителей (рис. 5, 6). Концентрацию органической составляющей варьировали в интервале от 5 до 75 об. %. Из приведенных данных видно, что независимо от природы органического растворителя с увеличением его концентрации в ПФ подвижность сорбентов увеличивается.
Влияние концентрации этанола на подвижность хинолинов. CR=1-10" М. НФ: полиамид. 1 - этилхи ноли ний Br, 2 - 2.3-дигидроксихиноксалин, 3 -6-нитрохинолин, 4 - 6-гидроксихинолин.
Влияние концентрации ацетонитрила на подвижность хинолинов. CR=1-10"3 М. НФ: полиамид. 1 - этилхинолиний Вг, 2 - 2.3-дигидроксихиноксалин, 3 - 6-нитрохинолин, 4 - 6-гидроксихинолин. Такое поведение согласуется с вытеснительным механизмом теории Хорвата и связано с преимущественной адсорбцией молекул растворителя на поверхности сорбента, усиливающей перенос сорбатов подвижной фазой.
Нитроанилины, хлорфенолы, аминокислоты
Изменение подвижности нитроаншинов в широком интервале концентраций органического растворителя показано на рис. 7, 8, из которых видно, что независимо от природы органического растворителя, с появлением органического растворителя и увеличением его содержания в ПФ, величина Rf НА на НФ средней полярности (полиамид) увеличивается. Хроматографическое поведение НА согласуется с описанным в литературе поведением сорбатов и теорией Хорвата. Следует, однако, отметить, что разделить все три изомера сложно, так как хроматографические пятна достаточно размыты и, в случае о- и м-изомеров, накладываются друг на друга. Влияние концентрации ацетонитрила на подвижность нитроанилинов. НФ: полиамид. CR=1 -Ю-3 М. 1 - п-НА, 2 - м-НА, 3 - о-НА.
Влияние концентрации спирта на хроматографическое поведение хлорфенолов представлено на рис. 9. Аналогичное хроматографическое поведение хлорфенолом наблюдается и в ацетонитрильных ПФ. Как видно из рис. 9, значения Rf хлорфенол ов на полиамиде в присутствии органического растворителя отличаются друг от друга незначительно, что доказывает невозможность применения данных ПФ для разделения исследуемых сорбатов.
Идентификация красителей в пищевых объектах и лекарственных препаратах
Эритрозин (ЭР) является представителем органических реагентов флуоресцеинового ряда и используется некоторыми странами как пищевой краситель (Е 127) в промышленном производстве пищевых продуктов (в Российской Федерации его применение запрещено). Анализ литературных данных, а также собственных результатов показывает, что в препаратах флуоресцеина, как правило, встречается полный набор галогенпроизводных от моно- до тетрагалогенфлуоресцеинов, отличающихся величиной Rf и относительным углублением цвета. Для определения степени чистоты препаратов флуоресцеиновых реагентов предложены водно-органические элюенты состава: диоксан-23 %-ый ЫН4ОН-изопропанол (2:1:1).
Нами показана возможность применения водно-циклодекстриновых ПФ, исключающих применение токсичных растворителей для решения этой задачи. Исследования проводили в ПФ на основе р-ЦД и ГП-у-ЦД. Установлено, что ПФ на основе ГП-у-ЦД являются лучшими. Показано, что оптимальная концентрация ГП-у-ЦД, при которой можно идентифицировать две четкие зоны (рис. 55), находится в интервале (0.3-Ю.4) 10" М. Более интенсивно окрашенная зона с меньшим значением Rf принадлежит основному веществу. Вторая зона, по-видимому, содержит примеси дииодфлуоресцеина. При повышении концентрации ГП-у-ЦД в ПФ выше оптимальной величины зоны на хроматограмме сближаются и размываются (рис. 55, 56, табл. 13).
Установлено, что добавление в ПФ как спирта, так и электролита (КО, Na2S04) не улучшает разделения сорбатов, а наоборот приводит к размыванию хроматографических зон и уменьшению ARf.
Результаты сравнение хроматографического поведения ЭР в предложенной ЦД и используемой ранее водно-органической ПФ приведены на рис. 57, из которого видно, что число зон не меняется при разделении, отличается только форма пятен, которые приобретают более размытый характер в присутствии растворителей.
Хроматограммы ЭР (изготовитель - завод им. Войкова). НФ: RP-3. ПФ: 1 - 0.004 М ГП-у-ЦД, 2 - диоксан-23 %-ый NH4OH-изопропанол (2:1:1) (зона основного вещества Результаты расчета параметров эффективности и селективности разделения в исследуемых системах (табл. 14) свидетельствуют о преимуществах предлагаемых ПФ по этим характеристикам.
На основе проведенного исследования разработаны методики определения чистоты препаратов органических реагентов. Нами проанализированы два препарата ЭР различных фирм (табл. 15). Из таблицы 3 видно, что Rf основного компонента не меняется.
Разделение бинарных смесей реагентов ряда флуоресцеина Исследовано разделение смеси ФЛ:ЭР в соотношении 1:1, 1:2 в ПФ, на основе р-ЦД и ГП-у-ЦД. На основании расчетов параметров эффективности и селективности разделения можно более обосновано выбрать лучшую ПФ (табл. 16).
Как видно из таблицы 16, лучшее разделение достигается в ГП-у-ЦД ПФ. В этом случае число N максимально и меняется от 630 до 690, a Ks от 39 до 41. Идентификация красителей в пищевых объектах и лекарственных препаратах
В настоящее время пищевые красители широко используются не только как добавки к различным пищевым продуктам, но и лекарственным препаратам [125]. Установлено, что пищевые красители не обладают токсичными свойствами, но могут проявлять аллергенные и мутагенные свойства, накапливаясь в организме в больших количествах. Поэтому их содержание в пищевых продуктах и лекарственных препаратах должно быть строго нормировано. Так, в безалкогольных напитках оно не должно превышать 50 мг/л.
На основании результатов исследования главы 3 проанализированы синтетические красители, содержащиеся в капсуле лекарственного препарата "Интетрикс" (Франция), во фруктовых леденцах "Бон Пари" (Россия, Пермь), в красках для пасхальных яиц (Россия). Полученные результаты представлены в таблице 17. Правильность идентифицируемых красителей подтверждена использованием свидетелей.
Таблица 17. Идентификация ПК в пищевых продуктах и лекарственных препаратах на пластина RP - 3 (п=3, Р=0.95).
Построение градуировочного графика В мерных колбах объемом 50 мл, последовательным разбавлением стандартного раствора инднгокармина (C=l-10_1 М) дистиллированной водой, готовят рабочие растворы с концентрациями 1 10 6-И 102 М. Хроматографирование проводят в ПФ состава: 9-10" М р-ЦД в присутствии 0.01 М КС1. Общий объем ПФ равен 5 мл. Объем аликвоты, наносимой на стартовую линию пластины, составляет 1 мкл. По полученным значениям SOTH строят градуировочный график, измеряя площадь пятна на денситометре (рис. 58).
