Содержание к диссертации
Введение
1 Литературный обзор 9
1.1 Анализ показателей качества биологических объектов на примере рыбы и рыбопродуктов 9
1.2. Определение нелетучих аминов 13
1.3. Методы определения гистамина
1.3.1. Определение гистамина в различных биологических объектах 16
1.3.2. Определение гистамина в рыбе и рыбопродуктах
1.3.2.1. Фотометрические методы анализа 20
1.3.2.2. ВЭЖХ-определение гистамина 22
1.3.2.3. Использование флуоресцентных методов для определения гистамина 24
1.3.2.4. Газохроматографическое определение гистамина 26
1.3.2.5. Ферментативный метод определения гистамина 26
1.3.2.6. ТСХ-определение гистамина в рыбе 27
1.4. Определение АЛО в рыбе и продуктах ее переработки 32
1.4.1. Пробоподготовка при анализе рыбы и рыбопродуктов на содержание АЛО 33
1.4.2. Газохроматографические методы определения АЛО 35
1.4.3. Фотометрическое определение азотистых летучих оснований 37
1.4.4 Проточно-инжекционныи метод определения триметиламина 38
1.4.5. Ферментативные методы определения триметиламина 39
1.4.6. Титриметрические методы определения АЛО
1.4.7. Другие методы определения азотистых летучих оснований 43
1.5 Анализ литературных данных и постановка задач исследований 44
2 Экспериментальная часть и обсуждение результатов 46
2.1 Используемые реактивы и оборудование 46
2.2 Определение условий экстракции гистамина 49
2.3 Подбор оптимальных условий хроматографирования
2.3.1 Неподвижная фаза- пластинка Силуфол 57
2.3.2 Выбор подвижной фазы 57
2.3.3 Выбор проявителя и режимов хроматографирования
2.4 Работа с модельными смесями гистамина и гистидина 67
2.5 Работа с образцами рыбы
2.5.1 Выбор оптимальной пробоподготовки 69
2.5.2 Хроматографирование образцов рыбы 72
2.6. Обработка результатов анализа гистамина методом ТСХ 76
2.7 Построение градуировочного графика для определения гистамина методом ТСХ 81
2.8 Определение содержания гистамина в рыбе 84
2.9 Использование стандартного метода определения гистамина в качестве метода сравнения 88
2.10 Методика определения гистамина методом ТСХ в рыбной продукции 93
2.11 Разработка методики определения гистамина с использованием хроматографических пластинок Сорбфил
2.11.1 Выбор условий хроматографмрования 99
2.11.2 Определение гистамина в образцах рыбы 109
2.11.3 Методика определения гистамина с использованием хроматографических пластинок Сорбфил
2.12 Влияние консервантов на накопление гистамина в рыбе 120
2.13 Обоснование процесса выделения азотистых летучих оснований 124
2.14 Определение азотистых летучих оснований методом косвенной рН-потенциометрии 1 2.14.1 Выбор концентрации реагента 130
2.14.2 Приготовление и анализ модельных растворов АЛО 131
2.14.3 Определение АЛО врыбе 133
2.15 Разработка методики ГЖХ-определения триметиламина в биологических объектах 136
2.15.1 Обоснование выбора хроматографической колонки 136
2.15.2 Подбор условий хроматографирования 140
2.15.3 Оптимизация процесса разделения азотистых летучих оснований.. 141
2.15.4 Определение метиламинов 143
Выводы 153
Список литературы
- Использование флуоресцентных методов для определения гистамина
- Титриметрические методы определения АЛО
- Подбор оптимальных условий хроматографирования
- Разработка методики определения гистамина с использованием хроматографических пластинок Сорбфил
Использование флуоресцентных методов для определения гистамина
Для оценки качества необходимо анализировать содержание веществ, образующихся в процессе хранения и переработки. В процессе хранения рыбы ее химический состав изменяется, органические вещества, входящие в состав ткани рыбы, разрушаются, в результате образуются аммиак, летучие и нелетучие биогенные амины, циклические спирты, гетероциклические соединения и другие. При разложении микроорганизмами нуклеопротеидов из входящих в их состав нуклеиновых кислот образуются гипоксантин и ксантин, обладающие токсическими свойствами, а также способными при определенных условиях образовывать аммиак и углекислый газ [3]. Контроль содержания этих веществ может служить критерием качества продукта [3-6]. Наибольший интерес представляет определение азота летучих оснований (АЛО), триметиламина (ТМА), гипоксантин, гистамина и так называемого "К-индекса" (инозин + гипоксантин / сумма продуктов распада АТФ) [7 - 17]. Наиболее часто используют определение АЛО и ТМА. Анализ данных веществ рекомендован нормативами ЕС и российскими стандартами [18]. Однако литературные данные о возможности использования содержания азота летучих оснований как объективного показателя качества рыбы противоречивы. При определении АЛО и ТМА в некоторых видах средиземноморских рыб во время холодильного хранения выявлено, что содержание этих веществ характеризует качество рыбы в начале хранения, но не позволяет определить ее свежесть в промежуточный период и в начале гниения; увеличение содержания АЛО зависит также от разновидности рыбы [19]. Для оценки степени свежести четырех видов пресноводных и двух видов морских рыб.авторы [20] определяли содержание АЛО и ТМА в четырех видах пресноводных и двух видах морских рыб. Показано, что содержание ТМА хорошо коррелирует с концентрацией АЛО и может быть использовано как индекс свежести рыбы. Обсуждалась возможность применения в качестве показателя свежести образцов величины отношения содержания АЛО к содержанию ТМА [20]. Польскими учеными [21] установлена хорошая корреляция между ухудшением органолептических свойств и накоплением летучих азотистых оснований. Эта зависимость соблюдается в любой сезон вылова. При исследовании динамики накопления АЛО в мышечной ткани рыбы выявлено, что при хранении рыбы до замораживания отсутствует корреляция между содержанием АЛО и ее качеством, определяемым органолептическим методом [22]. В этом случае не представляется возможным использование этого показателя как объективного. Однако содержание азота летучих оснований может быть использовано для оценки качества замороженных рыб с высокой и средней суточной скоростью накопления АЛО (0,07-0,09 мг% и 0,03-0,05 мг% соответственно). Интенсивность накопления АЛО зависит от вида рыбы, среды обитания, а в пределах одного вида от содержания липидов.
Были предприняты попытки определения пределов содержания азотистых летучих оснований и триметиламина в рыбе, пригодной к употреблению [16, 17]. Определены категории качества по содержанию в морепродуктах ТМА: первый класс - азот ТМА от 0 до 10 мг/кг — свежесть высшего сорта; второй класс - азот ТМА от 10 до 30 мг/кг - свежесть первого сорта; третий класс — азот ТМА от 30 до 50 мг/кг для сардины и от 30 до 60 мг/кг для ставриды: средняя свежесть.
Другими учеными [23] было определено приблизительное содержание азота АЛО и ТМА в рыбе для каждой категории, установленной по органолептической оценке. В рыбе, отнесенной по степени свежести к высшей категории, содержание АЛО должно быть не более 250 мг/кг (европейский хек, средиземноморская сардина) и 300 мг/кг (сардина, атлантическая и японская скумбрия) при содержании ТМА не более 10 мг/кг. Количество АЛО в рыбе, еще пригодной к употреблению, не должно превышать 400-450 мг/кг; ТМА - 40 мг/кг. В работе [24] устанавливают допустимый уровень азота летучих оснований в мясе рыбы 288 - 333 мг/кг. По содержанию ТМА (мг/кг) рыбу характеризуют, как: (Н5 - свежая, 5 -50 - промежуточная (средняя степень свежести), свыше 50 - рыба, не пригодная для употребления в пищу [19]. Установлено также, что увеличение содержания азота ТМА на ранних стадиях хранения указывает на значительную порчу продукта. Кроме того, наблюдается повышенное начальное содержание азота АЛО и ТМА в рыбе, пойманной сетями в летний период. В этих случаях, оценка химического анализа не всегда согласуется с органолептическим тестом на свежесть [23].
Таким образом, очевидно, что вопрос об использовании содержания азота АЛО и ТМА в качестве показателей свежести рыбы не имеет однозначного решения. Содержание только лишь азота АЛО не может дать всесторонней информации о качестве морской продукции.
Биогенный амин гистамин ((3-имидазол-4(5)-этиламин) образуется из аминокислоты гистидина при бактериальном декарбоксилировании. Наряду с ним, при разложении белков образуется ряд других нелетучих аминов. Накопление биогенных аминов в пищевых продуктах, обусловленное декарбоксилированием аминокислот, приводит к разного рода пищевым отравлениям. Гистамин является хорошо известным токсичным веществом, вызывающим определенную реакцию организма на его повышенное содержание [26]. Другие биогенные амины, такие как кадаверин и тирамин, усиливают токсическое действие гистамина.
Известен ряд работ, посвященных определению содержания аминов и полиаминов в рыбе и морских продуктах. Показателем качества рыбы является содержание в ней путресцина, кадаверина, гистамина, а также следовых количеств спермидина и спермина [27]. Ритчи и Макий [28] отмечают значительное накопление в макрели и сельди гистамина, кадаверина и путресцина при хранении рыбы. Группой японских ученых изучалось содержание таких аминов, как путресцин, кадаверин, тирамин, триптамин, спермидин, спермин в свежей рыбе [28]. Отмечено, что при хранении содержание спермина уменьшается, спермидина - остается постоянным, а путресцина, кадаверина и тирамина - значительно возрастает. Наиболее оптимальным показателем недоброкачественности мяса сардины является содержание кадаверина.
Из вышесказанного следует, что нелетучие амины являются индикатором свежести рыбы. Их накопление свидетельствует о процессах разложения, происходящих при хранении рыбной продукции. Определение содержания этих веществ помогает сделать вывод о пригодности рыбы к потреблению.
Титриметрические методы определения АЛО
Полученные результаты исследований указывают на приоритетное использование для разделения бутиловых спиртов: частично смешивающихся с водой бу-танола-1 и 2-метилпропанола-1 или неограниченно смешивающегося с водой 2-метилпропанола-2 [91]. На экстракционные свойства гйстамина сильно влияет кислотность растворителей. С увеличением кислотности экстрагента усиливается специфическая сольватация при взаимодействии гйстамина и экстрагента, что приводит к образованию более прочных связей. Кислотность бутиловых спиртов увеличивается от 2-метилпропанола-2 (рКа 19) к бутанолу-1 (рКа=16,1) [92]. На межфазное распределение гйстамина также значительное влияние ока зывает ассоциация молекул растворителя, снижающая вероятность образования водородных связей между гистамином и экстрагентом. В молекулах спиртов атом кислорода имеет две неподеленные пары электронов, что способствует образованию водородной связи и появлению цепочечных и циклических ассо-циатов молекул [93]. Степень ассоциации одноатомных спиртов уменьшается с увеличением разветвленности. Для бутиловых спиртов степень ассоциации минимальная для 2-метилпропанола-2.
Исследовали процессы реэкстракции гистамина из бутиловых спиртов в 0,1 М раствор НС1. Степень извлечения гистамина максимальна для бутанола-1 (97%). Для получения двухфазной системы в присутствии 2-метилпропанола-2 в раствор НС1 необходимо добавлять высаливатель.
Изучено влияние природы высаливателя на коэффициенты межфазного распределения гистамина в системах с бутанолом-1. С этой целью к водному раствору гистамина прибавляли 20% раствор NaOH до рН 12 и вносили в раствор при перемешивании MCI (M-Li, Na, К) до получения насыщенного раствора. Пробирку помещали на вибросмеситель. Межфазное равновесие достигалось в течение 15-20 мин. Коэффициенты распределения гистамина в системах насыщенный водный раствор МС1 - бутанол-1 равны: в присутствии LiCl - (8,4±0,7 ), NaCl - (6,3±0,4 ), КС1 - (3,5±0,3) при Р=0,95 и п=6. Ионы малого радиуса имеют большую плотность заряда и лучше гидратируются, поэтому высаливающее действие ионов натрия и особенно лития больше, чем ионов калия [25].
Методами ИК-спектроскопии и газовой хроматографии установлен меха низм сольватации гистамина. С этой целью исследовали сухой остаток бута-нольного экстракта. При экстракции NaOH частично переходит в органическую фазу, поэтому для получения рН раствора 12 применили концентрированный раствор аммиака, в котором растворили гистамин, добавили до насыщения NaCl. Затем добавили бутанол-1. После установления межфазного равновесия бутанольный экстракт перенесли в чашку Петри и высушили под вакуумом (40 мм рт.ст.) при комнатной температуре. На ИК-спектрофотометре Specord М 80 снимали спектр полученной пленки (рис. 2). AOW 3300 Э М 2500 2000 (в«0 «ЄЄ И»» 120О МП ««О «М «О 20ОЄЧ- Рисунок 2 - Спектр поглощения в ИК-области
В области 1600 - 700 см-1 спектр полностью идентичен спектру гистамина. Поглощение в области 3500 - 3300 см-1 вызвано валентными колебаниями связей N - Н [94]. Подобно гидроксильной группе аминогруппа склонна к образованию меж- и внутримолекулярных водородных связей. При этом полосы поглощения валентных колебаний N - Н смещаются в низкочастотную область. Эти смещения меньше, чем в случае гидроксильной группы. Присутствие гидро-ксильной группы, затрудняет идентификацию полос поглощения аминогруппы, так как харатеристические валентные колебания О - Н наблюдаются в широком интервале частот (3600 - 2500 см-1), это связано со способностью гидроксильной группы образовывать водородные связи [95]. В полученном ИК-спектре (рис. 2) в области 3600 - 2500 см-1 наблюдается интенсивная широкая полоса поглощения, вызванная, возможно, характеристическими валентными колебаниями О - Н группы, которая может быть отнесена как к спирту, так и к воде. Молекула спирта имеет интенсивную полосу поглощения в области 1180 - 1020 см-1 (валентные колебания связей С - О). В экспериментально полученном ИК-спектре в этой области отсутствует интенсивное поглощение, это свидетельствует об отсутствии или следовых количествах бутанола-1 в анализируемой пробе. Можно предположить, что интенсивное поглощение в области 3600 - 2500 см-1 вызвано характеристическими валентными колебаниями О - Н группы молекулы воды, связанной с гистамином. Для дальнейших исследований применили метод газовой хроматографии. Полученную пленку растворили в абсолютном метиловом спирте и раствор ввели в газовый хроматограф Хром-5 с пламенно-ионизационным детектором. Стеклянная колонка, длиной 1200 мм, . диаметром 3 мм, заполнена Porapak Q. Температура испарителя 180С, колонки 160С, детектора 130С, скорость азота 50 мл/мин., водорода 30 мл/мин. Обнаружены следы (0,01 об.%) бутанола-1. Для определения содержания воды в полученном твердом остатке его навеску (0,1089 г) растворили в абсолютном пропаноле-2 (V=0,30 мл) и проанализировали на хроматографе М-3700, в каче стве детектора использовали катарометр. Колонка была заполнена Porapak Q. Бутанол-1 обнаружен не был. На хроматограмме получены два хорошо разделенных пика: воды и пропанола-2. Для количественного определения воды были приготовлены стандартные растворы воды в пропаноле-2. Анализ проводили путем сравнения площадей пиков воды в стандартных растворах с площадями пиков воды в исследуемых растворах. Мольное соотношение гистамина и воды 1:2,1.
Гистамин переходит в бутанол-1 в виде гидрато-сольватов. Кислотность воды выше, чем кислотность спирта, поэтому гистамин образует по донорно-акцепторному механизму ковалентные связи с молекулами воды и переходит в экстрагент в виде гидратно-сольватного комплекса, образуя водородные связи между гидратной оболочкой гистамина и бутиловым спиртом.
Подбор оптимальных условий хроматографирования
Метод основан на получении окрашенного производного гистамина с нингидрином и определении суммарной яркости полученного в ходе хромато-графирования и проявления пятна производного гистамина. Предел обнаружения метода 75 мг/кг. Относительное стандартное отклонение при определении гистамина в интервале концентраций 90 - 175 мг/кг изменяется от 0,018 до 0.053. Градуировочный график линеен в интервале от 1,5 до 24 мкг гистамина. Степень извлечения добавленного к образцу стандарта гистамина составляет 92 - 96 %. Общее время анализа 2,5 часа.
При подготовке пробы к выполнению анализа 6,0 г мышечной ткани рыбы, взятой с точностью 0,01 г, переносят в аппарат для микроизмельчения тканей и добавляют около 10 мл 10 % раствора трихлоруксусной кислоты. Гомогенизацию проводят в течение 5 мин. Гомогенизат количественно переносят в емкость для центрифугирования. Центрифугируют пробу в течение 3 минут при 20 тыс. об/мин. Надосадочную жидкость отделяют и фильтруют в мерный цилиндр. Объем доводят до 15 мл 10% раствором трихлоруксусной кислоты. Добавляют 2 мл 20 % раствора NaOH и сухой ИагСОз до насыщения. Затем экстракт переносят в делительную воронку и прибавляют 5,00 мл н-бутанола. Встряхивают смесь в течение 30 секунд. После разделения фаз нижнюю (водную) фазу сливают, а от верхней (бутанольной) фазы отбирают 4,00 мл и переносят в пробирку с пришлифованной пробкой, содержащую 3,00 мл 0,1 М раствора соляной кислоты. Встряхивают содержимое в течение 30 секунд, после разделения фаз отбирают 2,50 мл нижнего (водного) слоя и упари вают на ротационном вакуумном испарителе до сухого остатка. После охлаждения до комнатной температуры к остатку добавляют 1 мл дистиллированной воды и раствор фильтруют. Фильтрат готов к анализу.
Для проведения процесса хроматографирования на пластинке марки Silu-fol (10 х 10 см) в двух взаимно перпендикулярных направлениях проводят линии на расстоянии 1,5 см от края пластинки (рис. 11). На расстоянии 1,5 см от края пластинки, в точку А (рис. 11) наносят 3 мкл раствора анализируемой пробы. В точки В и С, также находящиеся на расстоянии 1,5 см от края пластинки, наносят по 3 мкл внешнего стандарта гистамина. Он представляет собой раствор гистамина с концентрацией 0,05 - 0,40 мг/мл (в зависимости от предполагаемого содержания гистамина в образце) в 10 % растворе трихлоруксусной кислоты, предварительно прошедший все этапы пробоподготовки, начиная с прибавления к 15 мл стандартного раствора гистамина 2 мл 20 % раствора NaOH.
Для проведения двумерной хроматографии необходимо наносить на пластинку 2 стандарта, двигающиеся во взаимно перпендикулярных направлениях. Тогда, после завершения процесса хроматографирования и проявления пластинки, станет возможным точное установление местонахождения определяемого вещества. Для этого необходимо опустить перпендикуляры из центров проявленных пятен стандартов в область хроматографической картины, в направлении, перпендикулярном движению стандартов. На пересечении этих линий будет находиться интересующее нас вещество.
После нанесения растворов в точки А, В и С пластинку опускают в хрома тографическую камеру, предварительно насыщенную системой растворителей этанол : аммиак (7 : 3). В камере высота слоя растворителя не должна превышать 0,5 - 1,0 см. Проводят двойное элюирование в направлении I (рис. 11). Для этого пластинку, после прохождения фронтом растворителя половины пути, сушат досуха и вновь элюируют в том же направлении (І) в той же системе растворителей, но уже до конца. После этого пластинку вынимают, сушат, а затем повторяют процесс двойного элюирования в направлении П. Подвижная фаза - этанол: аммиак (7 : 3).
Следует помнить о том, что перед каждым новым элюированием подвижную фазу необходимо обновлять, чтобы ее состав оставался постоянным.
После проведения процесса двумерной хроматографии пластинку вынимают и сушат досуха на воздухе (в течение 10 мин.), либо при очень слабом нагревании, не касаясь поверхности нагревательного прибора (в течение 3 мин.). Затем пластинку обрабатывают проявителем - раствором 0,5 % нингидрина в изоамиловом спирте. После этого пластинку высушивают сначала на воздухе (под тягой!) в течение 10 мин., а затем - в термостате при 80 ± 5С в течение 2-3 мин. Полученные пятна производного гистамина устойчивы в течение 12 часов. Их следует занести в базу данных компьютера посредством сканирования. Для автоматизированной обработки результатов анализа гистамина методом ТСХ с помощью разработанного программно-аппаратного комплекса, изображение полученных пятен сканируется и вводится в компьютер в формате файлов Windows BMP. Таким образом обеспечивается документирование результатов анализа, то есть создается библиотека полученных хроматограмм, содержащая файлы изображений пятен и соответствующие им текстовые файлы с информацией о концентрации и объеме вкола стандарта, массе навески рыбы, объеме экстракта рыбы, объеме вкола образца в данном анализе.
Для получения результатов анализа в цифровом виде соответствующее изображение пятен с помощью "быстрых кнопок" пользовательского меню инвертируется и фильтруется. Затем в программу вводятся параметры данного анализа (навеска рыбы, объем экстракта, объемы вколов и т. д.), "мышкой" выделяются пятна анализируемых растворов и растворов стандарта. При этом количество параллельных опытов может быть любым. С помощью соответствующей "кнопки" пользовательского меню обрабатывают выделенные пятна анализируемого раствора и раствора стандарта и получают результат данного анализа в цифровом виде на экране дисплея.
Разработка методики определения гистамина с использованием хроматографических пластинок Сорбфил
Предварительно необходимо выбрать оптимальные условия разделения смеси азотистых летучих оснований. Температура испарителя должна быть выше температуры кипения наиболее высококипящего компонента в исследуемой смеси на 10 - 20С, чтобы обеспечить быстрое и полное испарение всех компонентов смеси. Мы работали не только с водными растворами, но и с бутаноль-ными экстрактами. Так как температура кипения н-бутанола 117С, то была выбрана температура испарителя 150С.
В данной работе использовали пламенно-ионизационный детектор (ПИД). Постоянство температуры детектора должно отвечать высоким требованиям, иначе возможно появление больших погрешностей, особенно при работе в режиме программирования температуры, поэтому ПИД лучше помещать в отдельный термостат. Температура термостата должна быть такой, чтобы надежно исключалась конденсация воды и компонентов пробы на рабочих поверхностях электродов. С учетом вышесказанного в наших исследованиях была выбрана температура детектора 130С.
Эффективность применения ПИД зависит также от условий его эксплуатации. Необходимо применять оптимальные скорости потоков водорода и воздуха. Скорость потока водорода составляла 25 - 30 мл/мин, а воздуха - 500 мл/мин, так как при этих условиях обеспечивался минимальный дрейф нулевой линии.
Оптимальная скорость газа-носителя для разделения анализируемой смеси составила 20 мл/мин, в качестве газа-носителя использовали азот марки о.с.ч.
Решающее влияние на ход газохроматографического разделения оказывает температура колонки. Нами был экспериментально осуществлен подбор температуры колонки. Для этого варьировали температуру колонки от 20 до 100С с шагом 10С и оценивали форму хромагографического пика и возможности разделения анализируемой смеси. В итоге была выбрана температура колонки 50С.
Разделение АЛО проводили на изготовленной колонке, в качестве неподвижной жидкой фазы использовали ПЭГ-4000, нанесенный на хромосорб W -AW. Идентификацию компонентов смеси проводили по времени удерживания индивидуальных веществ. Время удерживания определяли от момента ввода индивидуального вещества до появления на выходе из колонки максимума пика. Время удерживания ТМА (24±1)с, ДМА - (40±1)с, монометиламина (ММА) -(52±1)с. Хотя время удерживания ДМА и ММА несколько различаются, но из-за асимметричности хроматографических пиков данных веществ происходит их наложение, и вещества не разделяются в смеси.
Для улучшения формы пика пробовали заменить растворитель и перейти от анализа водных растворов к анализу органических экстрактов. Определяемые амины экстрагировали н-бутиловым спиртом из водных растворов, которые подщелачивали твердым гидроксидом калия. При анализе бутанольных экстрактов наблюдали только уменьшение асимметричности второго пика, отвечающего сумме ДМАи ММА, но разделение веществ достигнуто не было.
Ввиду того, что даже очень малые количества воды отрицательно влияют на разделительную способность неподвижной жидкой фазы [125], был опробован вариант парофазной газовой хроматографии. Модельную смесь аминов вводили шприцем в плотно закрытый стеклянный сосуд с 30% раствором щелочи, встряхивали и выдерживали в течение 5 мин, затем отбирали 2 см3 паровой фазы и вводили в хроматограф. Разделение смеси ММА и ДМА не наблюдалось.
С целью улучшения разделения смеси в поток газа-носителя попробовали ввести аммиак, который получали из сухой смеси натронной извести и хлорида аммония. Смесь помещали в специально изготовленную трубку длиной 15 см и диаметром 1 см. Газ-носитель пропускали через заполненную трубку и вводили в хроматограф. Введение аммиака в поток газа-носителя не улучшило разделение смеси.
Для проведения дальнейшего эксперимента было отдано предпочтение анализу водных растворов, так как улучшение формы пика определяемых веществ в бутанольном экстракте незначительно, но резко увеличивались затраты времени на получение экстракта и проведение анализа.
