Содержание к диссертации
Введение
1. Определение модифицированных аминокислот методом обращенно-фазовой ысокоэффективной жидкостной хроматографией. Обзор реагентов для предколоночной дериватизации аминокислот 8
1.1 Определение аминокислот со спектрофотометрическим и флуориметрическим детекторами 9
1.2 Определение аминокислот с электрохимическим детектором 18
1.3 Дансилхлорид, как модифицирующий реагент для аминокислот 21
1.4 Использование о-фталевого реагента для предколоночной дериватизации аминокислот в обращенно-фазовой ВЭЖХ 25
1.5 Детектирование о-фталевых производных аминокислот 40
1.6 Определение энантиомеров аминокислот после дериватизации с о-фталевым альдегидом 42
2. Исходные вещества, аппаратура, методика эксперимента
2.1 Исходные реактивы и растворы 54
2.2 Получение производных аминокислот с о-фталевым альдегидом 55
2.3 Получение дансильных производных аминокислот 55
2.4 Аппаратура, сорбенты и подвижные фазы 56
2.5 Методика хроматографического эксперимента 57
3. Предколоночная дериватизация аминокислот с о-фталевым альдегидом в обращенно-фазовой ВЭЖХ
3.1 Исследование устойчивости ОФА/2-МЭ производных аминокислот в роцессе разделения на колонке с гидрофобизированным силикагелем 58
3.2 Оптимизация условий разделения ОФА/НАЦ производных аминокислот 67
3.2.1 Влияние природы органического растворителя подвижной фазы на елективность разделения ОФА/НАЦ производных аминокислот 69
3.2.2 Влияние рН и ионной силы подвижной фазы на разделение ОФА/НАЦ производных аминокислот 70
3.2.3 Разделение ОФА/НАЦ производных сложной смеси аминокислот 73
3.3 Изучение свойств нового хирального модификатора >Ц11)-манделил-(8)-цистеина 77
3.3.1 Чувствительность детектирования ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ производных аминокислот 92
3.4. Электрохимическое детектирование ОФА/НАЦ производных аминокислот 93
4. Определение аминокислот после дериватизации дансилхлоридом методом обращенно-фазовой ВЭЖХ 100
4.1 Оптимизация условий получения дансильных производных минокислот 101
4.2 Амперометрическое детектирование дансильных производных минокислот в обращенно-фазовой ВЭЖХ 105
5. Определение аминокислот и их оптических изомеров в пиве и фармацевтических препаратах методом обращенно-фазовой ВЭЖХ
5.1 Определение аминокислот и их энантиомеров в виде о-фталевых производных в пиве 113
5.2 Определение аминокислот и их энантиомеров в виде фталевых производных в фармацевтических препаратах 128
5.3 Определение аминокислот в виде дансильных производных в фармацевтических препаратах 136
Выводы 140
- Определение аминокислот с электрохимическим детектором
- Получение производных аминокислот с о-фталевым альдегидом
- Изучение свойств нового хирального модификатора >Ц11)-манделил-(8)-цистеина
- Амперометрическое детектирование дансильных производных минокислот в обращенно-фазовой ВЭЖХ
Введение к работе
Актуальность темы. Аминокислотный анализ является хорошо изученным и в то же время развивающимся разделом современной аналитической химии. Определение аминокислот в продуктах питания, напитках и лекарственных препаратах имеет большое значение для контроля технологии производства, оценки качества сырья и готовой продукции, выявления фальсификатов. В последнее время актуально определение D-изомеров аминокислот в пищевых продуктах и медицинских препаратах. Это связано с тем, что влияние на здоровье человека D-изомеров аминокислот изучено мало, но их небольшие количества могут появляться в пищевых продуктах при термической обработке, а в медицинских препаратах при использовании синтетических аминокислот. Наиболее успешно поставленные задачи позволяет решать обращенно-фазовая высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) с предколоночным переводом аминокислот в гидрофобные производные.
Для предколоночной дериватизации аминокислот предложено несколько десятков реагентов, из них наибольшими преимуществами обладают о-фталевый альдегид (ОФА) и 5-диметиламинонафталин-І-сульфонилхлорид(дансилхлорид).
о-Фталевый альдегид в присутствии серосодержащего нуклеофила быстро и количественно взаимодействует с аминокислотами при комнатной температуре. Актуальным является изучение устойчивости ОФА производных в процессе хроматографического разделения и выбор условий, в которых разложение производных минимально. Хиральные нуклеофилы образуют с аминокислотами диастереомерные производные, что позволяет определять оптические изомеры аминокислот. Известно несколько хиральных модификаторов аминокислот, но каждый из них проявляет энантиоселективность к ограниченной группе аминокислот. В связи с этим необходим поиск и изучение свойств новых, универсальных хиральных нуклеофилов для дериватизации аминокислот.
В отличие от ОФА дансилхлорид легко реагирует с вторичными и первичными аминогруппами, дансильные производные аминокислот устойчивы в условиях ВЭЖХ. Недостаток дансилхлорида - длительность процесса дериватизации, поэтому важно изучение факторов, влияющих на скорость и выход реакции дериватизации, особый интерес представляет исследование воздействия температуры и микроволнового поля. о-Фталевые и дансильные производные аминокислот обладают высокой флуоресценцией и светопоглощением. Селективность и чувствительность определения аминокислот в реальных объектах, что особенно важно при определении низких концентраций D-аминокислот, может повысить амперометрическое детектирование. Для его использования нужны дополнительные исследования, так как мало изучена электрохимическая активность аминокислот, модифицированных ОФА и хиральными нуклеофилами. Электрохимическое детектирование дансильных производных аминокислот до сих пор не применялось, между тем наличие электроактивных групп в структуре дансильных производных делает возможным их окисление и последующее амперометрическое детектирование.
Цель работы состояла в изучении условий предколоночной дериватизации аминокислот о-фталевым альдегидом и дансилхлоридом, выборе оптимальных условий разделения и детектирования аминокислот и их энантиомеров в виде производных и определении L- и D- аминокислот в фармацевтических препаратах и пиве. Для достижения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
изучить устойчивость производных аминокислот с реагентом о-фталевый альдегид/2-меркаптоэтанол (ОФА/2-МЭ) в процессе хроматографирования и провести оптимизацию условий их разделения;
изучить влияние состава подвижной фазы на селективность и эффективность разделения аминокислот и их оптических изомеров, модифицированных о-фталевым альдегидом в присутствии N-ацетил-Ь-цистеина (НАЦ);
исследовать энантиоселективность двух новых мультихиральных модификаторов аминокислот Ы-(К)-манделил-(8)-цистеина (НМЦ) и Ы-фенилацетил-(К)-фенилглицил-(8)-цистеина (НФФЦ);
выбрать оптимальные условия для разделения и детектирования двадцати аминокислот в виде ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ производных;
показать возможность амперометрического детектирования ОФА/НАЦ производных аминокислот;
исследовать влияние температуры и микроволнового поля на дериватизацию аминокислот дансилхлоридом;
оптимизировать условия разделения и электрохимического детектирования дансильных производных аминокислот; Научная новизна. Исследована устойчивость ОФА/2-МЭ производных аминокислот в процессе разделения на колонке с гидрофобизированным силикагелем. Показано, что степень разложения производных не превышает 10% и уменьшается при повышении скорости потока подвижной фазы. Предложены новые мультихиральные модификаторы аминокислот - М-(Я)-манделил-(8)-цистеин и Ы-фенилацетил-(Я)-фенилглицил-(8)-цистеин. Проведено систематическое исследование влияния природы нуклеофильного реагента и состава подвижной фазы на разделение аминокислот и их оптических изомеров в виде ОФА производных. Показано, что М-(Я)-манделил-(8)-цистеин обладает большей энантиоселективностыо по сравнению с ранее изученными аналогами. Использование НМЦ для предколоночной дериватизации позволяет методом обращенно-фазовой ВЭЖХ разделить с высоким разрешением энантиомеры всех аминокислот, входящих в состав белков, кроме аргинина (Rs=0.7). Найдены условия электрохимического детектирования дансильных и ОФА/НАЦ производных аминокислот. Сопоставлены метрологические характеристики определения дансильных и ОФА/НАЦ производных аминокислот с использованием амперометрического, флуориметрического и спектрофотометрического детекторов.
Практическая значимость работы. Выбраны условия разделения о-фталевых производных энантиомеров двадцати аминокислот, содержащихся в пиве и являющихся активными компонентами лекарственных препаратов. После предколоночной дериватизации с ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ реагентами определен энантиомерный аминокислотный состав нескольких образцов пива и лекарственного препарата «Полиамин». Проведенные исследования показали, что D-аланин можно использовать в качестве маркера заражения пива молочнокислыми бактериями. Разработана методика определения аминокислот в виде дансильных производных методом ВЭЖХ с амперометрическим детектированием. Содержание аминокислот определено в препарате «Долголет».
На защиту выносятся следующие положения:
1. Результаты исследования устойчивости ОФА/2-МЭ производных аминокислот в процессе хроматограф ичес ко го разделения.
2. Результаты изучения энантиоселективности М-(Л)-манделил-(8)-цистеина и ее сравнения с уже известными хиральными модификаторами.
3. Совокупность данных о влиянии состава подвижной фазы на разделение ОФА/НАЦ и ОФА/НМЦ производных аминокислот.
4. Совокупность данных по определению оптимальных условий дериватизации
аминокислот дансилхлоридом. 5. Данные по исследованию условий амперометрического детектирования ОФА/НАЦ и дансильных производных аминокислот.
6. Условия и результаты определения аминокислотного состава пива и некоторых лекарственных препаратов.
Апробация работы. Основное содержание работы изложено в 10 публикациях. Результаты исследований доложены на VIII Всероссийском симпозиуме по жидкостной хроматографии и капиллярному электрофорезу (Москва, 2001 г.), Международной конференции студентов и аспирантов «Ломоносов-2003» (Москва, 2003 г.), Всероссийском симпозиуме «Хроматография и хроматографическое оборудование» (Москва, 2004 г.), II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005 г.), International Congress on Analytical Sciences «ICAS-2006» (Moscow, 2006).
Публикации. По материалам диссертации опубликованы 5 статей и 5 тезисов докладов.
Определение аминокислот с электрохимическим детектором
Определение дериватизированных аминокислот с электрохимическим детектором в обращенно-фазовой ВЭЖХ достаточно мало изучено, поэтому этот детектор редко используется в практическом аминокислотном анализе. Это может быть объяснено сложностями в изучении механизма окисления или восстановления органических соединений на твердых электродах и проблемами с загрязнением электродов в процессе анализа. Авторами работы [9] было показано, что по чувствительности амперометрический электрохимический детектор не уступает флуоресцентному детектированию в ВЭЖХ. Диапазон определяемых концентраций электрохимическим детектором составляет пикамоли вещества. В обращенно-фазовой ВЭЖХ возможно детектирование только трёх несвязанных аминокислот: триптофана, тирозина и цистина. Но и эти аминокислоты проявляют достаточно слабую электроактивность, поэтому при их определении необходим высокий потенциал рабочего электрода, что ограничивает круг применяемых электродов и затрудняет регистрацию сигнала. Ряд модификаторов, уже используемых при спектрофотометрическом и флуоресцентном детектировании, применим и для электрохимического детектирования. Определять аминокислоты можно либо по реакции восстановления, либо окисления на рабочем электроде. Анализ литературных данных показал, что чаще для детектирования используют реакции окисления производных аминокислот. Это в основном связано с проблемами, возникающими при определении аминокислот по току восстановления. При электрохимическом детектировании кислород, растворённый в подвижной фазе и пробе, может восстанавливаться на рабочем электроде и быть причиной возникновения сильных шумов базовой линии [24], поэтому важно удалять кислород до введения пробы в колонку и из подвижной фазы. Это достаточно трудоёмкий процесс, поэтому предпочитают использовать окислительный способ детектирования. Для восстановительного амперометрического детектирования в обращено-фазовой ВЭЖХ используют прежде всего нитросоединения, к которым относятся реагент Сангера и его аналоги [9]. Это сильные электрофоры, так как в процессе реакции восстановления возможна передача шести электронов от одной нитрогруппы соответствующей аминной групировке. Чем больше электронов участвует в окислительно-восстановительной реакции, тем больше отклик детектора.
Наибольшая чувствительность достигается при использовании тринитробензолсульфоновой кислоты. Наиболее подробно изучен и описан для восстановительного детектирования аминокислот органический реагент - р-нафтилгуанин-4-сульфонат натрия. Он реагирует с аминогруппами по реакции замещения, а продукт взаимодействия восстанавливается с образованием катехолов по схеме: Избыток реагента удаляется до образования лактама экстракцией диэтиловым эфиром. Наиболее часто используются для электрохимического детектирования аминокислот о-фталевый альдегид и 6-аминохинолил-М-гидроксисукцинимидил карбамат [25]. Аминокислоты, модифицированные этими реагентами, могут быть определены с помощью комбинации из флуориметрического, спектрофотометрического и электрохимического детекторов, что увеличивает надежность анализа. Структура б-аминохинолил-N-гидроксисукцинимидил карбамат производных аминокислот содержит ароматическую аминогруппу, в то время как ОФА производные тоже содержат в себе эту функциональную группу [26]. К достоинствам реагента относятся простота химизма реакции, отсутствие флуоресцентных свойств у продукта гидролиза АХК и лёгкость процесса дериватизации по сравнению с родственными модифицирующими реагентами [27]. Разделение АХК производных аминокислот при использовании амперометрического детектирования проводилось в градиентном режиме элюирования, тогда как для ОФА производных, в этом случае, лучше подходит изократический режим. Как известно, градиентный режим элюирования совместно с хорошим лабораторным оборудованием позволяет более оперативно определять анализируемые вещества. То есть, при амперометрическом детектировании АХК реагент позволяет существенно сократить время хроматографического разделения. Ли и соавторы [26] проводили определение АХК производных аминокислот с амперометрическим детектором и УФ-детектором. В амперометрическом детекторе использовалась гидродинамическая ячейка со стеклоуглеродным рабочим (индикаторным) электродом (GC), коррозионно-стойким стальным вспомогательным электродом и хлоридсеребрянным электродом сравнения. Потенциал рабочего электрода по результатам исследования гидродинамических и циклических вольтамперограмм составил +1.1 В. Оптимальное разделение восемнадцати производных аминокислот получено в градиентном режиме элюирования при рН элюента 3.0. К сожалению, АХК производные аргинина и глицина не были разделены. Пределы обнаружения аминокислот составляют порядка 1 пикомоль, при соотношении шумхигнал 1:3. Пределы обнаружения можно понизить, если использовать изократический режим элюирования, так как градиентная подача элюента в системе с электрохимическим детектированием создаёт шумы базовой линии. Линейная зависимость площади пика производного от концентрации соблюдается в широком интервале и охватывает три порядка значений от 5 до 2500 пикамолей, коэффициент корреляции больше 0.995. Недостатками используемого АХК реагента являются большое по сравнению с ОФА значение потенциала окисления (+1100 и 700 мВ соответственно), присутствие большого пика очень электроактивного реагента или продукта его гидролиза.
Поэтому в настоящее время невозможно определение следовых количеств аминокислот с этим органическим реагентом. Тем не менее, производные 6-аминохинолил-Ы-гидроксисукцинимидил карбамата очень стабильны, и, несмотря на все его недостатки, он используется для определения аминокислот с электрохимическим детектором [26]. В отличие от ОФА дансилхлорид легко реагирует с вторичными и первичными аминогруппами, дансильные производные аминокислот устойчивы в условиях ВЭЖХ. Недостатком дансилхлорида является более длительная и сложная модификация аминокислот, чем для ОФА. Важным преимуществом дансилхлорида и ОФА является их доступность и дешевизна. Таким образом, дансилхлорид и ОФА были выбраны в нашей работе для дериватизации аминокислот, эти реагенты более подробно описаны в последующих разделах. Широкое распространение получило использование дансилхлорида в качестве модифицирующего реагента аминокислот. Он занимает восьмое место или 4.5% среди огромного количества других конкурентно способных органических реагентов для дериватизации аминокислот. Дансилирование аминокислот широко используется для аминокислотного анализа напитков, пищевых продуктов, биологически активных добавок. Образование дансильных производных аминокислот идёт по следующей схеме: Видно, что при рН 9.5 скорость дансилирования аминокислот становится максимальной. При рН 9.5 константа скорости реакции гидролиза резко возрастает, и гидролиз протекает очень интенсивно, что приводит к деструкции дансилхлорида уже при рН 10. Таким образом, чтобы максимально уменьшить гидролиз дансилхлорида реакцию проводят при рН 9.5-9.6 [29]. Для поддержания рН реакционной смеси необходим буфер. Литературные данные по этому вопросу противоречивы. Авторы работы [30] предложили использовать боратный (Н3ВО3) 500 мМ буфер с рН=9.0. Другие исследователи [31] использовали 40мМ литий-карбонатный буфер с рН=9.5 и допускали использование 200 мМ натрий гидрокарбонатного буфера с рН=9.5. Авторы исследования [30] сравнили силу всех выше трёх описанных буферов. Боратный буфер был сразу же исключён, так как не поддерживал необходимое рН в течение реакции, значение рН уменьшилось с 8.5 до 5. Для литий-карбонатного рН уменьшилось с 9.5 до 8.5, а для натрий гидрокарбонатного с 9.5 до 9.
Получение производных аминокислот с о-фталевым альдегидом
В качестве реагента для получения производных аминокислот использовали о-фталевый альдегид совместно с различными серосодержащими компонентами. ОФА/2-МЭ реагент получали по методике [25], которая была изменена следующим образом. Растворы компонентов реагента готовили отдельно. 18 мг о-фталевого альдегида растворяли в 0.2 мл метанола. 8 мкл 2-меркаптоэтанола смешивали с 0.5 мл метанола. Оба раствора хранили при температуре - 20 С. Реагент готовили непосредственно в день анализа, смешивая 40 мкл раствора ОФА с 40 мкл раствора 2-МЭ и разбавляя до объема 520 мкл 0.1 М раствором Na2B407 (рН 9.6). Для перевода анализируемых соединений в производные смешивали 200 мкл смеси аминокислот или анализируемого образца, 40 мкл реагента и 250 мкл 0.1 М раствора Na2B407 (рН 9.6) в течение двух минут. Дериватизацию проводили при 10-100 кратном избытке реагента по отношению к суммарному количеству аминокислот. О-фталевый реагент для определения оптических изомеров аминокислот получали, растворяя 11 мг ОФА и 15 мг хирального SH-реагента в 1 мл метанола, использовали свежеприготовленный раствор. Для получения производных аминокислот к 100 мкл смеси аминокислот или раствора образца в виале емкостью 2 мл последовательно добавляли 500 мкл деионизованной воды, 200 мкл реагента, 500 мкл 0.1 М ЫагВ (рН 9.6). Раствор перемешивали в течение 4 минут. Минимальное мольное соотношение ОФА и суммы аминокислот поддерживали равным 3.5:1. 2.3 Получение дансильных производных аминокислот Стандартный раствор (0.75 мг/мл) 5-диметиламинонафталин-1-сульфонилхлорида готовили по точной навеске растворением в ацетонитриле на ультразвуковой бане УЗВ-4.0 («Сапфир», Россия). Затем добавляли деионизованную воду до необходимого объёма, таким образом, чтобы соотношение ацетонитрил : вода в приготовленном растворе дансилхлорида составляло 7:3. Полученный раствор использовали в день приготовления. Дансильные производные готовили непосредственно перед проведением эксперимента и использовали для анализа в течение суток по следующей методике: в виалу вносили последовательно 100 мкл раствора аминокислот и 400 мкл раствора дансилхлорида с концентрацией 0.75 мг/мл и доводили объём раствора до 5 мл боратным буфером с рН 9.6. Реагент добавляли в полуторном молярном избытке по отношению к аминокислоте.
Реакция проводилась при комнатной температуре в течение 50 минут в затемнённом месте, затем реакционная смесь вводилась в колонку. 2.4 Аппаратура, сорбенты и подвижные фазы В работе использовали жидкостной хроматограф фирмы «Shimadzu» SLC-10A со спектрофотометрическим детектором «Shimadzu» SPD-10AV, флуориметрическим детектором RF-10Axl, насосом «Shimadzu» LC-10AT, для записи хроматограмм использовали программное обеспечение CLASS-VP v.5.0.3 фирмы «Shimadzu» (Япония). Объём вводимой пробы составлял 20 мкл. В работе применяли жидкостной аналитический малогабаритный хроматограф «Цвет-Яуза» (Россия) с амперометрическим детектором и насосом для ВЭЖХ «Марафон -2». Управление режимом и обработка выходной информации проводилась с помощью программы «Экохром». Электрохимическая ячейка - «стенка-сопло». Рабочий электрод -стеклоуглеродный, вспомогательным электродом служил корпус ячейки. Объём вводимой пробы был равен 20 мкл. Для электрохимического детектирования ОФА/2-МЭ производных аминокислот использовали детектор фирмы «Biotronik» со стеклоуглеродным электродом. Для определения о-фталевых производных аминокислот использовали хроматограф HP 1050 фирмы «Agilent Technologies» (США) с автоматическим инжектором, диодно-матричным детектором HP 1050 и флуориметрическим детектором RF-10Axl фирмы «Shimadzu». Для получения дансильных производных аминокислот применяли микроволновую печь «ETHOS touch control» фирмы «Milestone» (Италия) при фиксированной частоте 2450 МГц при температуре 40С. Спектры поглощения снимали в диапазоне 180-500 нм на спектрофотометре фирмы «Shimadzu» UV-2201 с использованием кювет толщиной 1 см. В работе использовали центрифугу мощностью 8000 об/мин. и ультразвуковую башо УЗВ-4.0 л («Сапфир», Россия). Вольтамперометрические исследования проводили на приборе «Экотест-ВА» фирмы «Эконикс» (Россия) с использованием углеситалового электрода. В качестве электрода сравнения использовали хлоридсеребряный электрод, а вспомогательного -платиновый электрод. Для разделения производных аминокислот использовали стальную колонку (125x4 мм), заполненную сорбентом «Hypersil BDS-C18» (5 мкм) фирмы «Agilent Technologies» и стальную колонку (150x4.6 мм), заполненную сорбентом «Mightysil RP-18» (5 мкм) фирмы «Kanto Chemical Co. Inc.» (Япония). В качестве подвижных фаз использовали смеси ацетонитрила, метанола с различными буферными растворами. рН водных растворов контролировали на рН-метре MP 220 (Mettler Toledo, Щвейцария). 2.5 Методика хроматографического эксперимента Перед началом работы и при смене элюента хроматографическую колонку промывали в течение 30 минут используемой подвижной фазой. Согласно рекомендациям по использованию, указанным в литературе [71,72], после использования подвижных фаз, содержащих буферные растворы, колонку промывали в течение 20-30 минут бидистиллированной водой, а затем метанолом или ацетонитрилом. При работе с амперометрическим детектором перед началом работы в течение десяти минут проводили очистку электрода в импульсном режиме по следующей программе: Напряжение рабочего электрода - 1100 мВ Напряжение очистки -1300 мВ Время очистки - 200 мс Напряжение воссстановления - 500 мВ Время восстановления - 300 мс Время задержки - 40 мс. В хроматографическую колонку вводили аликвотную часть дансильных или о-фталевых производных аминокислот различной концентрации. Регистировали время (объем) удерживания.
По полученным хроматограммам и измеренным временам (объемам) удерживания рассчитывали исправленные времена удерживания (tR1), фактор ёмкости (к ), число теоретических тарелок на метр (N), коэффициент селективности (а) и разрешение (Rs). Для расчёта использовали следующие формулы [73]: tR=VR/F (1) tR = tR - to (2) k = tR7t0 (3) aWt R kjVk, (4) Rs= 2 (tR2R,y(W,+W2) (5) N=16 (tR/W)2 (6) где to - время элюирования несорбируемого вещества («мёртвое» время удерживания; tR - время элюирования анализируемого вещества; W - ширина пика у основания. «Мертвое» время рассчитывали по формуле [74]: 1о=1.2Укол/2Р=1.2лс12Ь/8Р где Укол - объем колонки, мл; d - внутренний диаметр колонки, см; F - расход элюента, мл/мин; L - длина колонки, см; а также определяли экспериментально при использовании в качестве стандартного вещества метанол. Значения to рассчитанные математически и полученные экспериментально, находились в хорошем соответствии. За результат определения времени удерживания принимали среднее арифметическое трех параллельных измерений, расхождение между которыми не превышало 5 %. Глава 3. Предколоночная дериватизация аминокислот с о-фталевым альдегидом в обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии 3.1 Исследование устойчивости ОФА/2-МЭ производных аминокислот в процессе разделения на колонке с гидрофобизированным силикагелем Среди реагентов, используемых для дериватизации аминокислот, наиболее популярным является о-фталевый альдегид. К преимуществам этого реагента относятся быстрое и количественное взаимодействие с аминокислотами при комнатной температуре, отсутствие побочных продуктов реакции. о-Фталевые производные аминокислот обладают сильной флуоресценцией и светопоглощением, а в некоторых случаях электрохимической активностью, что позволяет использовать для их детектирования спектрофотометрический, флуориметрический и электрохимический детекторы. К недостаткам ОФА следует отнести взаимодействие только с первичными аминогруппами аминокислот, а также невысокую устойчивость некоторых производных аминокислот.
Изучение свойств нового хирального модификатора >Ц11)-манделил-(8)-цистеина
В последнее время задача определения оптически активных аминокислот в различных объектах особенно актуальна [81,82]. Как правило, перед исследователем стоит задача определения чрезвычайно малого количества D-изомеров аминокислот на фоне значительных количеств аминокислот, находящихся в L-форме [83, 84]. Кроме того, проводя анализ реальных объектов, следует учитывать влияние матрицы. В этом случае успешно используется предколоночная дериватизация аминокислот о-фталевым альдегидом в присутствии хирального SH-реагента и последующий анализ диастереомерных производных обращенно-фазовой ВЭЖХ. Хиральные селекторы совместно с ОФА используют для определения энантиомеров аминокислот в окаменелостях и морской воде [85], почвах [86]. Важной сферой применения обращенно-фазовой ВЭЖХ с хиральной дериватизацией ОФА является аминокислотный анализ пищевых продуктов и лекарственных средств [47,87]. Анализ литературных данных показал, что в основном на селективность и эффективность разделения и чувствительность детектирования модифицированных аминокислот влияют свойства хирального SH-селектора. Каждый из описанных в литературе оптически активных SH-реагентов имеет свои недостатки, поэтому синтез и исследование свойств новых хиральных модификаторов аминокислот представляется важной задачей. Среди всех реагентов, известных в настоящее время, N-ацетил-Ь-цистеин, N-изобутирил-Ь-цистеин и (І-З-меркапто-2-метил-пропионовая кислота (ММПК) обеспечивают наилучшее разрешение диастереомеров аминокислот. Для определения энантиомеров аминокислот в пищевых продуктах и медицинских препаратах широко применяют НАЦ и ИБЛЦ. Реагент ММПК редко используется в аминокислотном анализе, из-за нестабильности реагента и необходимости синтезировать его непосредственно в лаборатории. Обзор литературы по хиралыюму анализу аминокислот позволяет сформулировать следующие общие требования к хиральному нуклеофилыюму SH-реагенту: -хиральный реагент должен быть недорогим и доступным, не подвергаться рацемизации при хранении; -хиральный реагент должен быстро и количественно реагировать с аминокислотами, образуя хромофоры, флуорофоры или соединения с электрохимической активностью; -хиральный модификатор должен быть оптически чистым, степень оптической чистоты зависит от решаемой задачи. Основным свойством хирального SH-модификатора является энантиоселективность по отношению к аминокислотам. Это означает, что реагент должен образовывать диастереомеры со структурными различиями, которые с высокой селективностью разделяются в условиях обращенно-фазовой ВЭЖХ.
Известно, что образование водородных связей играет существенную роль в создании структурных различий между диастереомерами, увеличивая селективность их разделения. Проведенные исследования показали, что введение объемных групп в молекулу хирального нуклеофила может увеличивать его энантиоселективность. Исходя из требований к энантиоселективности, в работе для хирального анализа аминокислот предложены новые реагенты М-(Ру)-манделил-(8)-цистеин (НМЦ) и Ы-фенилацетил-(Я)-фенилглицил-(8)-цистеин (НФФЦ). Реагенты были синтезированы Д.Т. Гуранда и В.К. Швядасом (Факультет биоинженерии и биоинформатики МГУ им. М.В. Ломоносова) с помощью энантиоселективного ферментативного ацилирования (З)-цистеина [69,70]. Изучение свойств новых хиральных модификаторов проводили в сравнении с доступными и широко используемыми N-ацетил-Ь-цистеином (НАЦ), N-изобутирил-Ь-цистеином (ИБЛЦ), Н-ацетил-О-пеницилламином (НАП). Структурные формулы изучаемых хиральных реагентов представлены в табл. 21. Дериватизацию аминокислот проводили по методике, разработанной для НАЦ и приведенной в главе 2. Разделение аналитов проводили в хроматографических условиях, оптимальных для ОФА/НАЦ производных аминокислот. Детектирование производных аминокислот выполняли с диодно-матричным детектором при длине волны 340 нм. На примере смеси оптических изомеров аспарагиновой кислоты, аргинина, тирозина и фенилаланина проведено сравнение энантиоселективности НМЦ и НФФЦ с известными реагентами (НАЦ, ИБЛЦ, НАП). Разделение аналитов проводили в условиях, оптимальных для ОФА/НАЦ производных аминокислот. Для разделения гидрофобных производных фенилаланина программа градиентного элюирования была изменена так, что концентрация метанола в конце анализа составляла 85 %. Состав подвижной фазы менялся по следующей программе: 0 мин, 22%А, 78%В; 10 мин, 22%А, 78%В; 34 мин, 32%А, 68%В; 47 мин, 44%А, 56%В; 51 мин, 48%А, 52%В; 56 мин, 48%А, 52%В; 67 мин, 56%А, 44%В; 75 мин, 65%А, 35%В, 78 мин, 85%А, 15%В, 100 мин, 85%А, 15%В, где А-метанол, В-0.01 М Л ЯРО , рН 6.0. Хроматограммы разделения модифицированной смеси четырех аминокислот представлены на рис. 20-24. Следует отметить, что полное разделение диастереомеров тирозина достигается при использовании всех SH-реагентов. Можно предположить, что гидроксильная группа в молекуле тирозина образует внутримолекулярные водородные связи с находящейся рядом карбоксильной группой SH-реагента. Интересно отметить, что диастереомеры фенилаланина полностью разделяются только после взаимодействия с ОФА/НФФЦ, ОФА/НМЦ и ОФА/ИБЛЦ. Лучшая энантиоселективность получена для ОФА/НФФЦ-0,Ь-фенилаланина и ОФА/НМЦ-0,Ь-фенилаланина. Этот факт можно объяснить л-л взаимодействиями между бензольными кольцами фенилаланина и хирального селектора (НМЦ и НФФЦ), энантиоселективность проявленная ИБЛЦ возникает из-за гидрофобных взаимодействий метальных групп реагента и бензольного кольца фенилаланина.
Такие взаимодействия придают жесткость молекуле производного аминокислоты и увеличивают разницу в гидрофобности между диастереомерами. Разница в структурах новых хиральных селекторов (НМЦ и НФФЦ) значительно сказывается на удерживании и селективности разделения диастереомеров. Лучшей энантиоселективностью обладает НМЦ, вероятно, дополнительная фенильная группа в молекуле НФФЦ ухудшает хиральное разделение производных аминокислот. Производные аминокислот с ОФА/НФФЦ реагентом чрезвычайно гидрофобны и сильно удерживаются на обращенно-фазовой колонке (рис. 23), что увеличивает время анализа, кроме того не разделены пики 0,Ь-аргинина и L-тирозина. На хроматограмме ОФА/НФФЦ производных аминокислот заметен пик со временем удерживания 47.5 мин. Это может быть пик реагента или продуктов распада производных. Таким образом, из синтезированных новых хиральных селекторов для определения энантиомеров аминокислот лучше подходит НМЦ. Этот модификатор был выбран в работе для дальнейшего изучения. Из ранее исследованных хиральных селекторов, оптимальная энантиоселективность получена для НАЦ, который был выбран в работе для разделения сложных смесей аминокислот и анализа реальных объектов. Оптическую чистоту Ы-(К)-манделил-(8)-цистеина определяли по соотношению пиков диастереомеров, полученных после дериватизации оптически чистого L-изомера глутаминовой кислоты. Сигнал производных регистрировали на флуориметрическом детекторе. Содержание ОФА/НМЦ-О-глутаминовой кислоты составляет 0.2 %, что свидетельствует об отсутствии рацемизации при получении производных аминокислот и оптической чистоте используемого модификатора 99.8 %. Для подтверждения количественного выхода реакции дериватизации по четырем уровням концентраций были построены градуировочные графики для ОФА/НМЦ производных аминокислот. В табл. 23 приведены зависимости площади пика производного от концентрации (мг/л) аминокислоты в стандартном растворе для градуировки. Детектирование аналитов проводили с диодно-матричным детектором. Из данных приведенных в таблице видно, что для всех модифицированных аминокислот наблюдается линейная зависимость между площадью хроматографического пика и концентрацией аминокислоты в растворе (R 0.995). То есть дериватизация аминокислот происходит с одинаковым выходом продукта для разных концентраций и стадия дериватизации не вносит систематическую погрешность в анализ. Выбор условий спектофотометрического детектирования проводили, получив с помощью диодно-матричного детектора спектры поглощения ОФА/НМЦ производных аминокислот. Все спектры поглощения имеют максимум в диапазоне 330-345 нм.
Амперометрическое детектирование дансильных производных минокислот в обращенно-фазовой ВЭЖХ
Последнее время все больше внимания уделяют использованию в ВЭЖХ амперометрического детектирования, благодаря его простоте, дешевизне, высокой чувствительности и селективности. В литературе отсутствуют данные по электрохимическому детектированию дансильных производных аминокислот, между тем наличие электроактивных групп (амино-группы и нафтильного фрагмента) в структуре дансильных производных делает возможным их окисление и последующее амперометрическое детектирование на твердых электродах по току окисления. Цель исследования было изучение электрохимических свойств дансильных производных аминокислот, а также выбор оптимальных условий разделения и амперометрического детектирования производных. Для успешного определения дансильных производных аминокислот методом обращенно-фазовой ВЭЖХ с электрохимическим детектированием важно изучить электрохимические свойства дансилхлорида, так как пик реагента может мешать определению аминокислот. Молекула дансилхлорида содержит две электроактивные функциональные группы - сульфо-группу и амино-группу. Сульфо-группа способна к электровосстановлению, так как сера находится в максимальной степени окисления +6, а амино-группа - к окислению, так как азот находится в минимальной степени окисления -3. Для того чтобы убедится в электроактивности дансилхлорида, было изучено его поведение с использованием вольтамперометрии с быстрой циклической развёрткой потенциала. Методы анализа, основанные на расшифровке поляризационных кривых, полученных в электролитической ячейке с поляризующимся индикаторным электродом и неполяризующимся электродом сравнения, называются вольтамперометрическими. Вольтамперограмма позволяет одновременно получать качественную и количественную информацию о веществах восстанавливающихся или окисляющихся на микроэлектроде, а также о характере электродного процесса. Изучено электрохимическое поведение органического реагента дансилхлорида на углеситаловом электроде. В качестве рабочего электрода сравнения использовали хлоридсеребрянный электрод, а роль вспомогательного электрода выполнял платиновый электрод. Методом вольтамперометрии с быстрой циклической разверткой потенциала установлено, что дансилхлорид необратимо окисляется на углеситаловом электроде. Наибольший отклик был получен при потенциале ячейки равном 1200 мВ. Окисление дансилхлорида на поверхности электрода возможно из-за наличия в его структуре электроактивной амино-группы.
После дансилирования аминокислот аминогруппа переходит в молекулу производного без изменения степени окисления, что делает возможным детектирование дансильных производных аминокислот по току окисления. Изучено электрохимическое поведение дансильных производных следующих семнадцати аминокислот: серина, валина, лейцина, фенилаланина, триптофана, изолейцина, метионина, аспарагина, аргинина, глицина, р-аланина, тирозина, цистина, гистидина, треонина, лизина, глутаминовой кислоты. Из этих семнадцати производных аминокислот только четырнадцать дали отклик: производные гистидина, цистина и глутаминовой кислоты детектировать не удалось. Для выбора оптимальных условий детектирования изучали влияние величины потенциала рабочего электрода (стеклоуглеродпого) на величину аналитического сигнала дансилхлорида и производных аминокислот. Величину потенциала варьировали в диапазоне 700-1300 мВ. На рис. 37 приведена зависимость интенсивности отклика (площади хроматографического пика) дансильных производных аминокислот от величины приложенного потенциала. Из представленных зависимостей видно, что при значении потенциала меньше 800 мВ на поверхности стеклоуглеродного электрода окисляются только дансильные производные триптофана, тирозина и аргинина. При более высоком значении потенциала происходит окисление и других производных аминокислот. Интенсивный аналитический сигнал дают производные триптофана, фенилаланина, метионина и тирозина. Следует отметить, что вышеперечисленные аминокислоты и в несвязанном состоянии обладают электрохимической активностью. Можно предположить, что окисление дансильных производных этих аминокислот на поверхности электродов связано как с окислением дансильного остатка, так и электроактивных групп самих аминокислот. Однако, для более четкого представления о механизме окисления этих производных необходимы дополнительные исследования. Из рис. 37 видно, что для большинства изучаемых аминокислот возможно амперометрическое детектирование, и оптимальное значение потенциала рабочего электрода составляет 1100 или 1200 мВ. Так как шум базовой линии был меньше, а величина отклика детектора для большинства аминокислот была больше при 1100 мВ, именно этот потенциал использовали для детектирования. На примере метионина, лейцина, триптофана, фенилаланина, треонина, аргинина проведено сравнение чувствительности трех видов детектирования дансильных производных аминокислот: амперометрического ("Цвет-Яуза", Россия), СПеКТрофоТОМетрИЧеСКОГО (Л,=325 НМ) И флуорИМеТрИЧеСКОГО (Х,ВОзб=365 НМ, регистр=510 нм) ("Shimadzu", Япония). Для этого исследована зависимость площади пика от о л концентрации аминокислоты в диапазоне концентраций 0.05 10 - 1.36 10 М для трех детекторов. Установлено, что во всех случаях взаимосвязь между площадью хроматографического пика дансилированных аминокислот и концентрацией аминокислоты в растворе хорошо описывается линейной зависимостью (R 0.995).
Пределы обнаружения, рассчитанные по ЗБ-критерию, приведены в табл. 32. Полученные результаты свидетельствуют о том, что чувствительность амперометрического детектора на два порядка выше, чем спектрофотометрического, и близка к чувствительности флуориметрического детектора. Условия разделения дансильных производных аминокислот подбирают исходя из набора изучаемых аминокислот и используемого детектора. В фармацевтических препаратах на основе комбинации аминокислот и лекарственных трав наиболее часто содержатся следующие аминокислоты: треонин, глицин, лизин, аргинин, тирозин, валин, метионин, изолейцин, лейцин, триптофан, фенилаланин, поэтому нами исследованы условия разделения именно этих аминокислот. Селективное и эффективное разделение дансильных производных смеси более 10 аминокислот возможно лишь в градиентном режиме элюирования, но это затрудняет амперометрическое детектирование разделяемых веществ. К преимуществам изократического элюирования относятся стабильность базовой линии, что обеспечивает низкий уровень шумов, а также лучшая воспроизводимость получаемых результатов по сравнению с градиентным режимом. В работе для разделения дансильных производных аминокислот использовали изократический режим подачи подвижной фазы через колонку «Hypersil BDS-C18» (150x4.6 мм, 5 мкм). Согласно литературным данным [28] для разделения дансилированных аминокислот используют подвижные фазы, содержащие ацетонитрил и фосфатный буферный раствор (рН 7.0). Изучение влияния ионной силы фосфатного буферного раствора в подвижной фазе на удерживание дансильных производных выполняли на примере модифицированных серина, аргинина, валина, лейцина, триптофана и фенилаланина. Зависимости фактора емкости шести дансилированных аминокислот от концентрации фосфатного буфера в элюенте приведены на рис. 38. Полученные зависимости показывают, что концентрация фосфатного буферного раствора в подвижной фазе незначительно влияет на удерживание и селективность изучаемых соединений. Для разделения использовали подвижную фазу с концентрацией фосфатного буферного раствора 2 мМ, так как именно в этих условиях обеспечивается и лучшее разрешение дансильных производных аминокислот и более оптимальный режим работы насоса (более низкое давление, обусловленное меньшей вязкостью среды).
