Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Химически модифицированные пористые монолиты в ВЭЖХ 11
1.1. Предпосылки и история возникновения монолитных колонок 11
1.2. Способы получения пористых монолитов 13
1.2.1.Органоп0лимерные пористые монолиты (молдинг-синтез) 13
1.2.1.1. Влияние температуры полимеризации 15
1.2.1.2. Влияние состава порогена 17
1.2.1.3. Влияние сшивающего агента 18
1.2.1.4. Получение монолитов большого диаметра 20
1.2.1.5. Полимеризация в водном растворе 22
1.2.2. Получение монолитов на основе силикагеля (золь-гель процесс) 23
1.2.3. Спекание микрочастиц 28
1.2.4. Воспроизводимость получения различных монолитов 29
1.3. Свойства монолитных пористых колонок 29
1.3.1. Пористые свойства 29
1.3.2. Механические и гидродинамические свойства 35
1.3.3. Массообмен и динамические свойства 36
1.4. Модифицирование поверхности пористых монолитов 38
1.4.1.химическое модифицирование 39
1.4.1.1. Модифицирование органополимерных колонок 39
1.4.1.2. Модифицирование поверхности колонок на основе силикагеля 42
1.4.2. Динамическое модифицирование 44
1.5. Промышленно выпускаемые монолитные колонки и их применение 45
1.5.1. Монолитные пористые сім диски 45
1.5.2. Макропористые полимерные монолитные колонки 46
1.5.3. Трубчатые монолитные колонки с радиальным течением (СІМ колонки) 47
1.5.4. Колонки на основе сжатого полиакриламидного геля 47
1.5.5. Монолитные колонки на основе силикагеля (chromolith) 48
1.6. Области применения монолитных колонок 51
1.6.1. Ионообменная хроматография 51
1.6.2. Обращеннофазовая жидкостная хроматография 52
1.6.3. Аффинная хроматография 52
1.6.4. Капиллярная электрохроматография 53
1.6.5. Биореакторы и твердофазное детектирование 54
ГЛАВА 2. Экспериментальная часть 57
2.1. Реагенты и растворы 57
2.2. Колонки и сорбенты 58
2.3. Аппаратура 59
2.4. Методика эксперимента 59
2.4.1. Модифицирование поверхности сім диска диэтилентриамином и триэтилентетрамином 59
2.4.2. Гидролиз эпоксидных групп гма-эдма матрицы 60
2.4.3. Модифицирование сім дисков аминокислотами 60
2.4.4. Определение максимальной сорбционной емкости монолитной колонки по ZN2+ 60
2.4.5. Спектрофотометрическое определение ионов металлов 60
2.4.6. Образование комплексов иминодиуксусная кислота - медь (II) на поверхности сорбентов 61
2.4.7. Концентрирование гистидин-содержащих пептидов методом металло-хелатной хроматографии 61
2.4.8. Расчет эффективности колонки 61
2.4.9. Приготовление образцов чая, кофе и других напитков 62
2.4.9.1. Пробоподготовка чая, мате и молотого кофе 62
2.4.9.2. Пробоподготовка растворимого кофе 63
2.4.9.3. Пробоподготовка кофеинсодержащих газированных напитков 63
ГЛАВА 3. Применение монолитных сім дисков для концентрирования 64
3.1. Ионообменные и комплексообразующие свойства монолитных пористых сім дисков, модифицированных олигоэтиленаминами 65
3.1.1. Химия поверхности сім дисков в зависимости от модифицирования 66
3.1.2. Гидродинамические свойства сім дисков 67
3.1.3. Кислотно-основные свойства сім дисков с различными функциональными группами 69
3.1.4. Статическая емкость сорбентов по сорбции переходных металлов 73
3.1.5. Комплексообразующие свойства 76
3.2. Концентрирование гистидин-содержащих пептидов на сім диске методом металло-хелатной хроматографии 82
3.2.1. Свойства сорбентов 85
3.2.2. Выбор условий элюирования 85
3.2.3. Концентрирование гистидин-содержащих пептидов трансферрина на различных сорбентах 87
ГЛАВА 4. Использование градиента потока для оптимизации разделения в жидкостной хроматографии 90
4.1. Использование градиента потока в ионной хроматографии для разделения анионов 94
4.1.1. Ионообменные свойства сім дисков, модифицированных а-аминокислотами 95
4.1.1.1. Влияние природы элюента, его концентрации ирН 96
4.1.2. Анионообменные свойства сім дисков, модифицированных олигоэтиленаминами 100
4.1.3. Зависимость эффективности разделения от скорости подвижной фазы 103
4.1.3.1. Эффективность СІМ дисков, модифицированных олигоэтиленаминами и аминокислотами 104
4.1.3.2. Эффективность СШколонки, состоящей из нескольких СІМ дисков 106
4.1.4. Оптимизация условий разделения 107
4.1.4.1. Разделение анионов с применением градиента потока 109
4.1.4.2. Влияние градиента потока на эффективность разделения и разрешение пиков 110
4.2. Использование градиента потока элюента в обращеннофазовой хроматографии для разделения гомологов органических соединений 116
4.2.1. Полиароматические углеводороды 116
4.2.1.1. Выбор условий для разделения ПАУ с градиентом потока 117
4.2.1.2. Разделение ПАУ с градиентом потока 122
4.2.2. Разделение пау на ультракороткой монолитной пористой колонке с градиентом потока элюента 125
4.2.2.1. Выбор условий для разделения ПАУ в изофлюентных условиях и с градиентом потока... 125
4.2.2.2. Разделение ПАУ с градиентом потока 127
4.2.3. Ди-н-алкилфталаты 129
4.2.3.1. Выборусловий для разделения ди-н-алкилфталатов 129
4.2.3.2. Разделение ди-н-алкилфталатов с градиентом потока 132
ГЛАВА 5. Определение алкалоидов группы метилксантинов в напитках 135
5.1. Выбор условий для разделения теобромина, теофиллина и кофеина 136
5.2. Определение тебромина, теофиллина и кофеина в напитках 140
ГЛАВА 6. Особенности жидкостной хроматографии при высоких скоростях элюента на монолитных пористых колонках 150
6.1. Влияние вязкости подвижной фазы на вид кривой ван деемтера 154
6.2. Использование отклонения от кривой ван деемтера классического вида для улучшения эффективности разделения полиароматических углеводородов 161
Выводы 165
Список сокращений 167
Список литературы 168
- Свойства монолитных пористых колонок
- Области применения монолитных колонок
- Гидролиз эпоксидных групп гма-эдма матрицы
- Химия поверхности сім дисков в зависимости от модифицирования
Введение к работе
Актуальность темы. Традиционно используемая в высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ) колонка, представляет собой стальную, стеклянную или полимерную трубку, заполненную частицами сорбента. Наиболее важной характеристикой хроматографической колонки является ее эффективность, которая обратно пропорциональна размеру частиц и прямо пропорциональна длине колонки, а также зависит от однородности набивки колонки и скорости пропускания элюента. Обычно для заполнения колонок используют сорбенты с частицами размером 5-10 мкм. При уменьшении размера частиц с 5 до 1-3 мкм улучшается массообмен, что теоретически позволяет повысить эффективность разделения. Однако уменьшение размера частиц сопровождается ухудшением проницаемости колонки, выражающимся в резком, обратно пропорциональном размеру частиц сорбента во второй степени увеличении давления на входе в колонку [ 1 ]. В свою очередь, оптимальное рабочее давление определяется прочностью матрицы сорбента и, обычно, не превышает 100-150 атм для сорбентов на основе силикагеля и 80-100 атм для органополимерных сорбентов, а также возможностями хроматографических насосов. Поэтому использование колонок, заполненных частицами диаметром менее 3 мкм требует уменьшения длины колонки, и, следовательно, уменьшения ее эффективности (числа теоретических тарелок на колонку). Таким образом, эффективность набивной хроматографической колонки для аналитической ВЭЖХ лимитируется максимальным давлением на входе в колонку, которое определяется размером частиц.
Стремление исследователей получить разделения на колонках, заполненных частицами 1-3 мкм большой длины положило начало развитию такого варианта хроматографии как жидкостная хроматография сверхвысокого давления [ 1, 2], когда разделения проводят при давлении вплоть до 9000 атм. Другое решение проблемы повышения эффективности состоит в использовании принципиально новых сорбционных материалов, обладающих более высокой проницаемостью.
В конце 1990-х гг. ведущие производители хроматографических колонок освоили производство перспективных для решения этих проблем сорбентов, так называемых монолитных пористых колонок (МПК). МПК представляет собой непрерывную пористую структуру с бимодальным распределением пор. Сквозные транспортные поры обеспечивают низкое давление на входе в колонку, а мезопоры, формирующие развитую поверхность с большой площадью, обеспечивают высокую эффективность и нагрузочную способность [3]. Эффективность кремнеземной монолитной колонки Chromolith RP 18е сравнима с эффективностью набивных колонок, заполненных частицами силикагеля размером 3 мкм, причем высокая скорость массообмена обеспечивает минимальные потери в эффективности разделения при высоких скоростях подвижной фазы [4]. Давление на входе в монолитную колонку Chromolith приблизительно в 6 раз меньше, чем для колонки, заполненной частицами размером 3.5 мкм при одинаковых размерах колонок [5]. Совокупность этих свойств позволяет выделить МПК как отдельную группу неподвижных фаз перспективных для использования в различных вариантах ВЭЖХ.
Цель и задачи исследования. Цель работы заключалась в изучении свойств монолитных пористых СІМ (Convective Interaction Media) дисков, на основе сополимера глицидилметакрилата и этилендиметакрилата, и МПК Chromolith RP 18е на основе силикагеля и реализации их преимуществ в ВЭЖХ. Конкретные задачи исследования включали: - модифицирование метакрилатных СІМ дисков различными ионообменными и комплексообразующими функциональными группами - диольными, олигоэтиленаминами, аминокислотами и иминодиуксусной кислотой; изучение гидродинамических свойств МПК - сопротивления потоку и эффективности в зависимости от скорости пропускания элюента и их сравнение со свойствами набивных колонок; установление зависимости эффективности МПК от вязкости элюента при высоких линейных скоростях; - изучение ионообменных и комплексообразующих свойств монолитных дисков, модифицированных олигоэтиленаминами и аминокислотами; установление возможностей использования монолитных пористых дисков для динамического сорбционного концентрирования неорганических ионов и пептидов; разработка нового варианта элюирования при использовании подвижной фазы постоянного состава с градиентом потока элюента для разделения анионов в варианте ионной ВЭЖХ и для разделения гомологов органических соединений в варианте обращенно-фазовой ВЭЖХ; - разработка методики определения теобромина, теофиллина и кофеина в газированных напитках, чае и кофе в изофлюентном режиме и с градиентом потока элюента.
Научная новизна. Синтезировано 6 типов монолитных пористых дисков, модифицированных диольными группами, олигоэтиленаминами, аминокислотами и иминодиуксусной кислотой. Изучены их ионообменные свойства по удерживанию модельных органических соединений и неорганических анионов.
При разделении анионов на СІМ дисках впервые отмечен эффект улучшения эффективности разделения при увеличении скорости пропускания элюента при скоростях, значительно превышающих значения, соответствующие минимуму кривой Ван Деемтера. При изучении гидродинамических свойств МПК на основе силикагеля установлено, что зависимости эффективности от линейной скорости элюента заметно отличаются от классического вида, описываемого уравнением Ван Деемтера. Установлено, что при высоких скоростях элюента на МПК на зависимости появляется второй минимум. Эффект зависит от размера молекулы сорбата и появляется при более низких линейных скоростях при использовании элюентов с большей вязкостью.
Предложен новый вариант градиентной хроматографии при постоянной концентрации элюента, но с градиентом потока элюента. Показаны преимущества этого метода при разделении сложных смесей -полиароматических углеводородов (ПАУ), ди-«-алкилфталатов и метилксантинов. Наиболее эффективно использование этого приема для
Свойства монолитных пористых колонок
Структура монолитная пористая колонка состоит из структурных кластеров и пустот между ними. На единицу объема это можно записать в виде выражения: где ет - общая пористость колонки (мл/мл), Vs - объем структурных кластеров (мл/мл). Кроме общей пористости характеристиками монолитной колонки является также внешняя пористость єех (мл/мл), т.е. доля макропор на единицу объема и внутренняя пористость E-mt (мл/мл), т.е. доля микро и мезопор. Применение пористых материалов в катализе, адсорбции, ионном обмене, хроматографии, твердофазном синтезе и др. основано на определенном взаимодействии сорбатов с их поверхностью. Большую площадь поверхности обеспечивает большое количество микропор диаметром менее 2 нм, затем скелетные поры или мезопоры размером от 2 до 50 нм. Макропоры с диаметром более 50 нм не вносят существенного вклада в общую площадь поверхности. Однако для того чтобы произошло взаимодействие с максимальным количеством активных центров поверхности, необходима проницаемость фазы для различных соединений. Маленькие молекулы могут проникать даже в некоторые микропоры, тогда как линейные макромолекулы, обладающие молекулярной массой больше 10, могут проникать только в мезо- и макропоры. Поэтому в случае макромолекул основную роль играют мезопоры. Они обеспечивают разделение веществ за счет процессов сорбции-десорбции. Распределение пор по размеру для сополимера СТ-ДВБ представлено в табл. 7.
Макропоры обеспечивают высокую скорость перемещения подвижной фазы относительно неподвижной. Однако для большинства сорбционных методов необходима большая площадь поверхности. На рис. 3 показаны зависимости давления на входе в колонку от скорости пропускания тетрагидрофурана (ТГФ) для ГМА-ЭДМА монолитов, полученных в различных условиях. Пористые свойства этих колонок представлены в табл. 2. Для монолитов с порами меньше 500 нм давление на входе достаточно велико уже при небольших скоростях пропускания элюента. Проведение экспериментов при высоких скоростях потока возможно в случае, если колонки имеет поры более 1000 нм. Размер пор монолитных дисков может быть определена в сухом состоянии методом ртутной порометрии [19, 22] или непосредственно в ходе хроматографического эксперимента в обычных условиях [47]. Ртутная порометрия позволяет измерить размер макропор, точность метода для определения размера маленьких пор ограничена из-за сжимаемости полимерной матрицы. Для этих целей обычно используют гель проникающую хроматографию (ГПХ). Основы хроматографической порометрии изложены в работах [48-52]. Метод основан на измерении объема пор, доступных для полимерных стандартов с известным размером молекулы. Исследования нужно проводить в квазиравновесных условиях при отсутствии адсорбционных взаимодействий между полимером и пористым материалом и межмолекулярных взаимодействий в растворе [48]. В случае правильного выбора условий результаты эксперимента не зависят от температуры, состава растворителя, его содержания в ПФ и расхода ПФ, отсутствуют двойные и асимметричные пики. Чтобы удерживание определялось только размером молекул сорбата и диаметром пор, т.е. процессом эксклюзии, должно быть устранено влияние энтальпийных процессов (распределения и адсорбции). Эффект распределения мал, если ПФ и сорбент имеют близкие параметры растворимости [48]. Это условие для СТ-ДВБ сорбентов выполняется при использовании ТГФ. В качестве стандартов в ГПХ чаще всего используют олигомеры линейного СТ, которые элюируются из хроматографической колонки сильными растворителями: СН2С12, СНС13 и ТГФ [48, 53]. Размеры и геометрия колони несущественны. Молекулярную массу стандартного соединения можно связать с диаметром пор сорбента, используя уравнение Мартина и Халаша.
Для олигомеровСТ [48, 53]: Преимущество этого метода является то, что сорбенты изучаются в условиях, близких к условиям их практического использования, так как основаны на одном и том же физическом явлении - проникновении молекул из раствора в поры сорбента. Данные литературы для органополимерных монолитов демонстрируют, что монолиты, полученные в условиях, когда в основном образуются макропоры, не проявляют избирательного удерживания стандартов СТ в широком диапазоне ММ. Следовательно, на поверхности таких колонок отсутствуют мезопоры. Эти результаты хорошо согласуются с данными, полученными методом ртутной порометрии. Калтенбрюнер с сотр. [54] предложили свой метод определения пористости колонок. В этом методе рассматриваются колонки различной длины с одинаковым диаметром. Удерживание связано с объемом колонки следующим уравнением: где ДГд-коэффициент распределения, VR - удерживаемый объем (мл), Vex -экстраобъем колонки (мл), V0 - "мертвый" объем колонки (мл), Vt - объем колонки (мл). Экстраобъем колонки включает в себя объем картриджа и соединений в хроматографической системе.
Уравнение (8) можно представить в следующем виде: где г = (Vt-VJ/Vo - общая пористость колонки. Построение графической зависимости VR от Vb то есть от длины колонки дает значение пористости и экстраобъема колонки. Эти значения представлены в табл. 8. В работе [55] пористость ГМА-ЭДМА дисков оценивали по времени выхода неудерживаемых соединений. В качестве маркеров были выбраны вещества, сильно различающиеся по размеру - Н202, ацетон, овальбумин. В табл. 9 представлены значения объемов пор, рассчитанные по временам удерживания разных маркеров и для сравнения значение общего объема пор диска, измеренное методом ртутной порометрии в сухом состоянии. Известно, что для полимерных материалов такого типа плотность равна 3 мл/г. Т.е. объем пор 0.6 мл/мл, определенный для Н202 или ацетона соответствует 1.8 мл/г. Это значение хорошо коррелирует с данными ртутной порометрии. Особое внимание стоит уделить свойствам монолитных колонок на основе силикагеля. Расположение каркасных единиц и соразмерных им транспортных пор в силикагелевом монолите упорядоченно в отличие от органополимерного [44]. Отношение размера транспортных пор (єех) к размеру каркасных структур
Области применения монолитных колонок
Ионообменная хроматография - один из распространенных вариантов хроматографии, в котором монолитные колонки всех видов нашли свое применение. В первую очередь, монолитные колонки стали использоваться в анионообменной хроматографии (АО) для разделения биологических макромолекул. В АО используются монолитные колонки с закрепленными четвертичными аммониевыми группами или группами диэтиламина в качестве лигандов. Такие сорбенты используются как в аналитических, так и в препаративных целях [6, 10, 92-95]. Основное применение этих сорбентов -разделение белков и энзимов. Кроме того, они используются для разделения комплексов биополимеров, таких как нуклеиновые кислоты. В катионообменной хроматографии биомолекул монолитные сорбенты пока не нашли широкого применения. Однако этот метод является эффективным и перспективным. Пока работы в этой области связаны с изоляцией моноклональных и поликлональных антител и рекомбинантных протеинов [ 6 ]. Работы по разделению небольших органических анионов и неорганических анионов и катионов появились только в последние несколько лет. Для этих разделений в основном используют монолитный пористый силикагель Chromolith Performance RP 18е, благодаря его высокоразвитой площади поверхности. Монолитный силикагель доступен только в гидрофобном виде, поэтому ионогенные группы вводятся динамическим модифицированием катионных, анионных и цвиттерионных модификаторов. Хатсис и Люси [74] получили разделение 8 неорганических анионов за 15 с при скорости 16 мл/мин на колонке Chromolith Speed ROD RP-18e 100 x 4.6 мм в варианте ион-парной ВЭЖХ. Использование модификаторов с двумя алкильными цепочками приводит к очень стабильным ионообменникам [81]. Этот прием с успехом был реализован на колонках Chromolith различной длины для разделения анионов [4, 75, 96]. Примеры разделения маленьких молекул приведены в табл. 14. Гидродинамические свойства монолитных колонок дает новые возможности в многомерной хроматографии.
Одновременное использование нескольких колонок с разной химией поверхности позволяет решить несколько задач всего за один хроматографический анализ. Конструкция СІМ дисков и их картриджа позволяет совмещать до 5-ти дисков с различными функциональными группами в варианте ЮКХ. На СІМ колонке, состоящей из 2-х катионообменных SIMGEL S03-16 и 2-х анионообменных CIMGEL DEAE-16 дисков получили разделение 5-ти белков за 5 мин. Полл и др. использовали параллельное соединение колонок Chromolith (первая - анионообменная 25x4.6 мм, динамически модифицированная ДДАБ, вторая - катионообменная 50x4.6 мм, динамически модифицированная диоктилсульфосукцинатом (ДОСС) для одновременного разделения неорганических анионов и катионов [96]. Существует также примеры разделения небольших биомолекул на коротких монолитных колонках. Например, разделение 7-ми карбоновых кислот всего за 8 мин на колонке, представляющей собой 4 анионообменных монолитных СІМ QA диска (общая длина колонки -12 мм) в изократических условиях [97]. Обычно в этой области хроматографии используют монолитные колонки в виде дисков и стержней. Гидрофобность неподвижной фазы зависит от плотности расположения алкильных радикалов на поверхности и от числа атомов углерода в цепи радикала. На колонке SilicaRod в варианте ОФ ВЭЖХ было получено [98] разделение витаминов Kl, К2 и КЗ и разделение лекарственных препаратов -парацетамола, кофеина и бромфенирамина. Для разделения протеинов в варианте ОФ ВЭЖХ используют СТ-ДВБ сорбенты [ 9, 22 ]. Монолитные сорбенты широко используются в аффинной хроматографии для разделения биополимеров.
Биологические взаимодействия основаны на образовании специфических комплексов комплементарных молекул: антиген-антитело, энзим-субстрат, энзим-ингибитор, гормон-рецептор. Чаще всего используют комплекс антиген-антитело. На этом основана иммуноаффинная хроматография и иммуномониторинг (контроль накапливания антител в живых организмах) [64]. В этом варианте хроматографии используют сополимер ГМА-ЭДМА, так как на его поверхности присутствуют реакционноспособные группы, которые можно модифицировать различными лигандами. Разделения обычно проводят с использованием градиента подвижной фазы. Капиллярная электрохроматография - метод разделения незаряженных молекул, сочетающий в себе высокую селективность ВЭЖХ и эффективность капиллярного зонного электрофореза. Появление монолитных колонок решает ряд проблем, ограничивающих применение этого метода. Решается проблема набивания капилляров, так как капилляр заполняется жидкой полимеризационной смесью и проводят полимеризацию прямо в капилляре. Капилляры на основе монолитной неподвижной фазы более стабильны, чем набивные. Отпадает необходимость использования фритов, что предотвращает образование пузырьков воздуха. В капиллярной электрохроматографии используются как органополимерные (в основном полиакриламидные [16-18, 31] и полиметакрилатные [19, 31, 99], реже СТ-ДВБ [23, 100]), так и капилляры на основе силикагеля [31, 43, 101]. Для создания электроосмотического потока в полимеризационную смесь добавляют мономеры с сульфогруппами, обычно 2-акриламидо-2-метил-1-пропансульфоновую кислоту (0.3 %) [16, 17, 19, 99].
Для обращения потока используют мономеры, содержащие аминогруппы. Использование в качестве мономера метакрилата с хиральным центром приводит к получению колонки для разделения энантиомеров [ 102]. Объектами исследования являются небольшие нейтральные органические молекулы и полипептиды. Эффективность разделения для полимерных колонок составляет от 120 000 до 400 000 теоретических тарелок на метр [103]. Для капилляров на основе силикагеля эффективность немного меньше. Некоторые примеры разделений представлены в табл. 14. Например, на СТ-ДВБ, модифицированном Л іУ-диметилоктиламином, было получено разделение полиароматических углеводородов [23]. В работе [45] получено разделение ароматических соединений: бензальдегида, бензофенона, диметилфталата, а также полиароматических соединений нафталина, фенантрена и флуорена. Пористые свойства монолитных колонок и высокая скорость массообмена обусловливает перспективность их использования как биореакторов. При создании биореакторов на твердых подложках существует проблема уменьшения активности иммобилизованного энзима, по сравнению с его индивидуальной формой из-за медленной диффузии макромолекул к активным центрам биореактора. Однако, сравнение макропористых частиц и монолита, иммобилизованных трипсином (при одинаковой природе матрицы), показали, что активность энзима, привитого на монолитную колонку выше, чем на пористых частицах [104]. Высокая скорость массообмена позволяет значительно сократить время реакции. Существуют примеры использования монолитных колонок для твердофазного детектирования. Хемилюминесценция пероксиоксалата - один из наиболее эффективных методов определения пероксида водорода. Использование монолитной колонки в качестве носителя для закрепления 3-аминофлуорантена приводит к повышению чувствительности определения в 2 раза по сравнению с реактором, заполненным частицами размером 50 мкм [ 105 ].
Гидролиз эпоксидных групп гма-эдма матрицы
Из литературных данных известно, что амин закрепляется в количестве 0.3-0.4 ммоль/диск. По методике, приведенной в источнике [113] максимальную сорбционную емкость определяли в статических условиях. Диск помещали в водный раствор, содержащий 30-ти кратный избыток металла по отношению к предполагаемой емкости колонки (9 ммоль Zn(II)) на 12 часов. Затем промывали водой и проводят десорбцию 0.01 М НС1 в течение 2-х часов. Концентрацию цинка в растворе определяли спектрофотометрически по реакции сПАР [114]. Для построения градуировочных графиков в мерные колбы объемом 25 мл вводили от 1 до 5 мл растворов солей металлов с содержанием металла 5 мкг/мл, вводили 2.5 мл 0.025%-ного раствора ПАР в 0.05 М боратном буферном растворе (рН 9.18) и 2.5 мл 0.05 М боратного буферного раствора, разбавляли водой до метки. Измеряли оптическую плотность растворов относительно раствора ПАР, приготовленного аналогично, и строили зависимости оптической плотности А от концентрации металла с [114].
Колонку, модифицированную группами иминодиуксусной кислоты (ИДК) последовательно промыли 50 мМ раствором ЭДТА в 0.5 М NaCl (рН 8) и дистиллированной водой. Затем уравновесили колонку 0.1 М ацетатом натрия (0.5 М NaCl, рН 4). Далее пропускали 50 мМ раствор CuS04. Избыток меди удаляли промывкой 0.1 М ацетатом натрия (0.5 М NaCl, рН 4). Исследование проводили для трансферрина, подвергнутого ферментативному гидролизу трипсином (выполнено научной группой проф. Ф. Ренье, Purdue University, США). Разделение проводили при скорости 1 мл/мин. Колонку уравновешивали 50 мМ ЭДТА (рН 7, 0.5 М NaCl), затем 20 мМ фосфатным буферным раствором (рН 7, 0.5 М NaCl). Проводили ввод пробы и промывали колонку еще 3-мя объемами фосфатного буфера. Для десорбции пептидов с колонки использовали 2-х стадийное элюирование. Первая стадия -пропускание 0.1 М ацетата натрия (рН 4, 0.5 М NaCl), вторая - элюирование имидазолом (50 мМ, рН 7). Между этапами элюирования колонку уравновешивали 20 мМ фосфатным буфером (рН 7, 0.5 М NaCl). Фракции собирали вручную и затем анализировали методом LC-MS (выполнено научной группой проф. Ф. Ренье, Purdue University, США).
Детектирование пептидов осуществляли спектрофотометрически (к = 280 нм). Вычисление линейной скорости пропускания элюента проводили по формуле: где и — линейная скорость (см/мин), F - объемная скорость потока (мл/мин), г -радиус колонки, єт - пористость (мл/мл). Для колонок для колонок типа Chromolith RP-18e использовали значение єт равное 0.8, для для СІМ дисков -0.5. При построении зависимостей высоты, эквивалентной теоретической тарелке (ВЭТТ, Н), в каждой точке рассчитывали эффективность колонки по формуле: где N— число теоретических тарелок, fo- время удерживания аналита в мин, w\tl - ширина хроматографического пика на половине высоты в мин. ВЭТТ рассчитывали следующим образом: где L - длина колонки. В случае градиентного разделение эффективность рассчитывали по формуле: где VR - объем удерживания в мл, wy2 - ширина хроматографического пика на половине высоты в мл. Разрешение хроматографических пиков Rs рассчитывали по формуле: где к = (VR-VM)/VM, коэффициент селективности a = к2/к\\ Vu - "мертвый" объем системы. Все значения объемов были рассчитаны интегрированием площади фигура, образованной профилем градиента потока за данный период времени: где F— скорость пропускания элюента в мл/мин. Определяли коэффициенты уравнения Ван Деемтера и линейных зависимостей и проводили статистическую обработку при помощи программы SigmaPlot2001 версия 7.101. (Systat Software Inc., США). Пробоподготовку проводили согласно методике, описанной в литературе [115]. Точные навески 0.5-1 г чайных листьев, мате или молотого кофе и помещали в коническую колбу объемом 150 мл, добавляли 80 мл горячей воды (80С).
Раствор нагревали на водяной бане в течение часа и затем фильтровали. Колбу промывали горячей водой и тоже пропускали через этот фильтр. Повторяли это промывание дважды, собирали все фильтраты и объединяли в колбе на 100 мл. Затем охлаждали до комнатной температуры и разбавляли дистиллированной водой до метки. Непосредственно перед анализом раствор фильтровали через мембранный фильтр Whatman 0.45 мкм. г растворимого кофе переносили в колбу на 50 мл и добавляли горячей дистиллированной воды, охлаждали до комнатной температуры и разбавляли водой до метки. Перед анализом раствор фильтровали через мембранный фильтр Whatman 0.45 мкм. Газированные напитки на основе чая и энергетические напитки дегазировали 5 минут в ультразвуковой бане для дегазации [ 116]. Затем раствор фильтровали через мембранный фильтр Whatman 0.45 мкм.
Химия поверхности сім дисков в зависимости от модифицирования
СІМ диски характеризуются высокой проницаемостью и малым сопротивлением массопереносу. Это связано с тем, что в отличие от колонок заполненных обычными сорбентами, монолитная фаза обладает большими каналоподобными транспортными порами размером 1500 нм, которые пронизывают монолит по всей длине. Такие поры обеспечивают беспрепятственное течение подвижной фазы относительно неподвижной с малым давлением на входе в колонку. Модифицирование поверхности монолитных пористых дисков может приводить к изменению их пористой структуры и гидродинамических характеристик, за счет возможных электростатических взаимодействий ионогенных групп, приводящих к набуханию полимерной матрицы монолита. С целью оценки влияния модифицирования олигоэтиленаминами на изменение структуры монолитных пористых дисков была изучена проницаемость CIM-ДЭТА и CIM-Диол. Зависимости давления на входе в колонку от линейной скорости подвижной фазы (рис. 11) линейны во всем изученном интервале скоростей и описываются следующими уравнениями: где р - давление на входе в колонку (атм), и — линейная скорость подвижной фазы (мм/с). Взаимосвязь линейной и и объемной F скоростей описывается уравнением (14). Для СІМ дисков и (мм/с) =0.295 F (мл/мин). Тангенс угла наклона прямой (коэффициент h (атм-с/мм) пропорционален сопротивлению колонки. Для CIM-ДЭТА и СІМ-Диол тангенс угла наклона одинаков в пределах погрешности. Рассчитанные значения тангенсов угла наклона говорят о том, что модифицирование поверхности диэтилентриамином достоверно не снижает проницаемость монолитных дисков. Кислотно-основные свойства CIM-ДЭТА, ОМ-ТЭТА и СІМ-Диол в диапазоне рН от 2.5 до 6.7 оценивали [117] по относительному удерживанию модельных ионогенных органических соединений в условиях хроматографического эксперимента. В качестве модельных соединений были выбраны две органические кислоты (бензойная и толуолсульфокислота), два основания (анилин и хлорид триметилфениламмония), два амфолита (аминобензойная кислота и аминобензолсульфокислота) (табл. 16). Производные бензола были выбраны для удобства фотометрического детектирования. В качестве элюента использовали растворы лимонной кислоты (рКі=3.13, рКг=4.66, рКз=6.40), [118] обеспечивающие постоянство буферной емкости во всем изучаемом диапазоне рН. На рис. 12 показаны зависимости коэффициентов емкости (к) модельных соединений от рН элюента для различных сорбентов. Удерживание органических кислот.
Как сказано в п. 3.1 Л., свойства СІМ-Диол отражают свойства матрицы сополимера ГМА-ЭДМА. Для СІМ-Диол (рис. 12, а) при низких значениях рН бензойная кислота практически не удерживается. Интересно, что при рН больше 4.5 удерживание бензойной кислоты увеличивается, вероятно, из-за образования водородных связей между карбоксильной группой кислоты и сложноэфирными, карбоксильными и гидроксильными группами сорбента. Удерживание толуолсульфокислоты постоянно во всем изучаемом диапазоне рН. При низких значениях рН элюента аминогруппы CIM-ДЭТА и СГМ-ТЭТА запротонированы. С увеличением рН уменьшается положительный заряд аминогрупп и, одновременно, возрастает элюирующая сила элюента, вследствие диссоциации лимонной кислоты и увеличения заряда элюирующего цитрат-иона, следовательно, удерживание анионов органических кислот будет уменьшаться. Такой характер зависимости наблюдается на CIM-ДЭТА (рис. 12, б) и ОМ-ТЭТА (рис. 12, в) для толуолсульфокислоты кислоты, которая в изученном диапазоне рН практически полностью диссоциирована. Для бензойной кислоты (рКа=4.2) с ростом рН удерживание сначала возрастает, что соответствует диссоциации карбоксильных групп и увеличению к
