Содержание к диссертации
ВВЕДЕНИЕ 8
П. ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРНЫХ ДАННЫХ 14
Н.1. Основы метода капиллярного электрофореза (КЭ) 14
П.1.1. Способы ввода пробы 16
II. 1.2. Методы детектирования в капиллярном электрофорезе 17
II. 1.2.1. УФ-детектирование в КЭ 18
II. 1.2.2. Флуоресцентное детектирование 18
II. 1.2.3. Масс-спектрометрическое детектирование 19
II.2. Различные варианты капиллярного электрофореза 20
11.2.1. Капиллярный зонный электрофорез (КЗЭ) 20
Н.2.2. Мицеллярная электрокинетическая хроматография 21
Н.2.2.1. МЭКХс положительной полярностью (МЭКХ) 22
П.2.2.2. МЭКХс обращенной полярностью (ОН
МЭКХ) 24
П.З. Микроэмульсионная электрокинетическая хроматография (МЭЭКХ) 27
IL3.1. Способы образования микроэмульсии. 29
11.3.2. Механизм разделения в МЭЭКХ. 31
П.З.З. Факторы, влияющие на разделение в МЭЭКХ... 34
П.3.3.1. Природа поверхностно-активного вещества 34 П.
3.3.2. Влияние рН буферного электролита на селективность разделения 35
П. 3.3.3. Влияние органических растворителей на электрофоретические характеристики агалитов 36
11.3.3.3.1. Гидрофобные растворители, образующие фазу «масла» 37
11.3.3.3.2. Органические растворители -стабилизаторы микро эмульсии 37
113.3.3.3. Гидрофильные органические модификаторы элюента 38
II.3.4. Способы приготовления микро эмульсии 40
IL3.5. Применение МЭЭКХ. 40
11.4. Эффективность, разрешение и селективность разделения в методе капиллярного электрофореза 42
11.5. Макроциклические реагенты, используемые в капиллярном электрофорезе 45
11.6. Определение констант комплексообразования в капиллярном электрофорезе 47
11.7. Использование различных режимов капиллярного электрофореза для определения полифенольных антиоксидантов и кофеина в зеленом чае 52
II. 7.1. Общая характеристика полифенольных компонентов чая 52
II. 7.2. Определение биологической активности полифенолов 57
7.7.5. Пробоподготовка реальных объектов для определения полифенолов 58
II. 7.3.1. Жидкостная экстракция 59
П.7.3.2. Твердофазная экстракция 61
II. 7.4. Хроматографические и электрофоретические методы определения полифенольных антиоксидантов 62
11.7.4.1. Определение полифенолов в жидкостной хроматографии 62
11.7.4.2. Электрофоретическое определение основных биологически активных компонентов чая 63
П. 7.4.3. Определение полифенольных антиоксидантов методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ) 68
III. ГЛАВА 2. ОБЩАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ОБЪЕКТОВ И МЕТОДОВ ИССЛЕДОВАНИЯ 70
НІЛ. Аппаратура 70
Ш.2. Реагенты 72
Ш.З. Методы исследования 77
III.3.L Оптимизация условий электрофоретического детектирования 78
111.3.2. Использование капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ) для разделения полифенов 80
111.3.3. Определение катехинов и кофеина в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии 81
Ш.3.4. Мицеллярная электрокинетическая хроматография с обращенной полярностью (ОПМЭКХ) при одновременном определении полифенолов и кофеина 85
III. 3.5. Построение градуировочных зависимостей аналитов для количественного анализа реальных объектов 86
111.3.6. Расчет констант комплексообразования 88
111.3.7. Определение полифенолов методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии... 91
111.3.7.1. Приготовление микроэмульсии 92
Ш.3.8. Использование метода обращенно-фазовой высокоэффективной жидкостной хроматографии (ОФ ВЭЖХ) для определения полифенолов и кофеина. 93
Ш.3.9. Пробоподготовкареальных объектов к электрофоретическому и хроматографическому
анализу 94
Ш.3.10. Определение хроматографических и электрофоретических характеристик аналитов (параметров удерживания, эффективности и факторов селективности разделения и разрешения) 97
111.5.11. Электрофоретическое разделение биогенных аминов в режиме ОПМЭКХ. 100
1113.11.1. On-line концентрирование в режиме
мицеллярной электрокинетической хроматографии 101
IV. ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ПРИРОДНЫХ АНТИОКСИДАНТОВ И КОФЕИНА В РАЗЛИЧНЫХ РЕЖИМАХ КАПИЛЛЯРНОГО ЭЛЕКТРОФОРЕЗА 108
IV. 1. Определение полифенолов в капиллярном зонном электрофорезе 108
IV.2. Факторы, определяющие закономерности одновременного электрофоретического определения полифенолов и кофеина в мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) 112
IV.3. Электрофоретическое разделение полифенолов и кофеина в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП
МЭКХ) 116
IV.3.1. Влияние органических растворителей на разделение катехинов и кофеина в режиме ОП МЭКХ. 122
IV.3.2. Влияние комплексообразующих агентов на селективность разделения в ОП МЭКХ 125
IV.3.2.1. Роль гидроксикислоты в составе рабочего буфера как конкурирующего комплексообразующего агента 125
IV. 3.2.2. Влияние нейтрального и заряженного Р-циклодекстринов на селективность разделения полифенолов 126
IV.3.3. Исследование возможностей микроэмульсионной электрокинетической хроматографии
(МЭЭКХ) для определения полифенолов 127
VI.3.4. Сравнительные оценочные характеристики режимов МЭКХ, ОП МЭКХ и МЭЭКХ с УФ детектированием при электрофоретическом определении катехинов и кофеина в природных
объектах 132
IV.3.4.1. Использование микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ) для определения стероидных гормонов 134
V. РАЗДЕЛЕНИЕ БИОГЕННЫХ АМИНОВ МЕТОДОМ МИЦЕЛЛЯРНОЙ ЭЛЕКТРОКИНЕТИЧЕСКОЙ ХРОМАТОГРАФИИ В ОТСУТСТВИИ
ЭЛЕКТРООСМОТИЧЕСКОГО ПОТОКА (ОП МЭКХ) 147
V.I. Влияние комплексообразующих и ион-парныхагентов на селективность разделения биогенных аминов методом ОП МЭКХ 156
VI. ПРАКТИЧЕСКОЕ ПРИЛОЖЕНИЕ 166
VI.l. Электрофоретическое определение полифенолов в зеленом и черном чае 166
VI.2. Определение катехоламинов в моче методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью 170
ВЫВОДЫ 172
СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 174
ПРИЛОЖЕНИЕ 196
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ 205
Введение к работе
В последние годы методы капиллярного электрофореза (КЭ) широко используются для определения биологически активных соединений в природных объектах. Варианты микроэмульсионной и мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ и МЭКХ) с обращенной полярностью наименее изучены. При этом использование их для гидрофобных соединений должно было бы привести к росту эффективности, сокращению времени анализа и снижению пределов обнаружения аналитов.
Интересными и информативными моделями для выяснения возможностей малоизученных вариантов КЭ - мицеллярного режима с обращенной полярностью и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии - являются следующие системы:
1. Природные антиоксиданты полифенольного типа ((-)-эпикатехин, (-)-эпикатехин галлат, (-)-эпигаллокатехин, (-)-галлокатехин галлат, (-)-эпигаллокатехин галлат и (+)-катехин) и кофеин, обладающие антиаллергенными и радиопротекторными свойствами и являющиеся основными компонентами зеленого чая.
2. Биогенные амины (дофамин, норадреналин, адреналин) и их метаболиты (метанефрин и норметанефрин) - диагностические маркеры различных заболеваний с нарушением работы центральной нервной системы.
В молекулах указанных веществ содержатся легко ионизируемые и способные к комплексообразованию с органическими и неорганическими соединениями 1,2-фенольные гидроксилы (катехольный фрагмент).
Логически обоснованная стратегия выбора условий электрофоретического разделения (рН рабочего буфера, природа и концентрация комплексообразующих агентов, режим on-line концентрирования и т.д.) с учетом специфики аналитов могла бы позволить предложить высокоселективный и чувствительный способ их определения и выявить новые возможности обсуждаемых вариантов капиллярного электрофореза.
Работа поддержана Фондом содействия развитию малых форм предприятий в научно-технической сфере («СТАРТ 2005», проект №5911).
Цель работы. Выявить новые возможности и получить оценочные характеристики различных вариантов метода капиллярного электрофореза с УФ-детектированием (зонного капиллярного электрофореза (КЗЭ), мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОП МЭКХ), микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ)) для определения катехинов и катехоламинов в природных объектах.
В связи с поставленной целью необходимо было решить следующие задачи:
1. Установить закономерности одновременного электрофоретического разделения полифенолов и кофеина в режимах капиллярного электрофореза (КЗЭ, МЭКХ и МЭЭКХ) с УФ-детектированием.
2. Выяснить доминирующие факторы (состав и рН рабочего электролита, органические модификаторы, макроциклические агенты), определяющие селективное разделение катехинов чая и кофеина методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОПМЭКХ).
3. Выявить критерии, определяющие стабильность микроэмульсионной системы, и установить закономерности разделения полифенольных антиоксидантов в режиме микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ). 4. Изучить возможности обсуждаемых электрофоретических вариантов для определения катехоламинов и их метаболитов в биологических жидкостях.
5. Предложить электрофоретический способ селективного определения полифенольных соединений и кофеина в реальных объектах растительного происхождения (различные образцы зеленого и черного чая).
Научная новизна
Выявлены доминирующие факторы (состав и рН буферного электролита, концентрация додецилсульфата натрия), влияющие на электрофоретическое разделение органических соединений, содержащих в своей структуре фрагмент вицинальных дигидрокси-групп (катехины и катехоламины) методами МЭКХ с нормальной и обращенной полярностью. Показано, что последний вариант предпочтителен.
Впервые, обнаружен эффект влияния комплексообразующих добавок ((3-циклодекстрина, сульфо-[3-циклодекстрина, лимонной кислоты) в составе рабочего электролита на увеличение селективности разделения полифенолов в МЭКХ с обращенной полярностью и сокращение времени анализа.
Определены возможности микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (рН рабочего буфера 2,0) для электрофоретического разделения смеси, содержащей природные антиоксиданты (эпикатехин, эпигаллокатехин, эпикатехин галлат, галлокатехин галлат и эпигаллокатехин галлат; ПО 0,5 мг/л; N=1000-103-2000-Ю3 т.т./м.
Впервые предложен способ определения катехоламинов и их метаболитов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП МЭКХ), и показано, что селективность разделения и эффективность в данном режиме выше в 1,5 раза, чем в традиционно используемом для этой цели методе капиллярного зонного электрофореза (КЗЭ).
Выявлено влияние комплексообразующих добавок (18-краун-6, 4,13-диаза-18-краун-6), смешанных мицелл (додецилсульфат натрия/октансульфонат натрия) и первичных аминов в составе рабочего электролита на электрофоретические характеристики катехоламинов в режиме МЭКХ с обращенной полярностью.
Установлено, что при рН рабочего электролита 7 азотсодержащий макроцикл, взаимодействуя с мицеллой, увеличивает селективность разделения и общее время анализа; 18-краун-6 изменяет электрофоретические характеристики аналитов, образуя с ними комплексы разной устойчивости.
Предложен новый вариант on-line концентрирования для биогенных аминов и их метаболитов в режиме ОП МЭКХ: свипинг с добавкой 18-краун-6 (4 мМ) и циклогексиламина (5 мМ) в матрицу пробы. Факторы концентрирования составили 900- 1500.
Практическая значимость работы
Предложены варианты определения полифенольных антиоксидантов и кофеина в различных образцах зеленого и черного чая методами традиционной мицеллярной электрокинетической хроматографии и МЭКХ с обращенной полярностью с УФ-детектированием. Пределы детектирования полифенолов составили: 0,3 -1 мг/л.
Показана возможность электрофоретического определения биогенных аминов (дофамин, адреналин, норадреналин, метанефрин, норметанефрин) методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (буферный электролит содержит ацетат натрия и муравьиную кислоту, рН 2,0) в биологических жидкостях (моча) после твердофазной экстракции на модифицированном додецилсульфатом натрия сорбенте Cjg.
Предложен вариант электрофоретического определения стероидных гормонов (прогестерон, 17-гидроксипрогестерон, 11-дегидро-кортикостерон, 11-дезокси-кортикостерон, кортизон, кортизол, тестостерон, кортикостерон, кортизон ацетат, дексаметазон) методом микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (рН 2,0). Пределы обнаружения составили 0,8 - 1 мг/л без стадии концентрирования и 0,04 - 0,06 мг/л с использованием on-line концентрирования (свипинг, 30 мбар, 100 с).
Разработаны варианты on-line концентрирования {свипинг с добавкой 4 мМ 18-краун-6 и 5 мМ циклогексиламина в матрицу пробы) биогенных аминов в режиме мицеллярной электрокинетической хроматографии (ОП МЭКХ), позволяющие концентрировать пробу в 900 -1500 раз. Предел обнаружения составил 20-30 нг/мл.
Положения, выносимые на защиту
1. Результаты исследования влияния состава, концентрации и рН буферного электролита, концентрации мицеллообразующего реагента (додецилсульфат натрия), органических модификаторов (ацетонитрил, метанол, изопропиловый спирт, мочевина) в составе рабочего электролита на одновременное электрофоретическое определение полифенолов и кофеина методами мицеллярной электрокинетической хроматографии с нормальной (МЭКХ) и обращенной полярностью (ОП МЭКХ) с УФ-детектированием.
2. Влияние и количественная оценка комплексообразующих добавок ((З-циклодекстрина, сульфо-р-циклодекстрина, 18-краун-6 и 4,13-диаза-18-краун-6) в мицеллярных системах на эффективность и селективность электрофоретического разделения катехинов и катехоламинов методом МЭКХ с обращенной полярностью.
3. Влияние температуры, типа и концентрации поверхностно-активного вещества, природы «масла» на стабильность микроэмульсии и на электрофоретические подвижности флаван-3-олов и стероидных гормонов в режиме микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ).
4. Сравнение возможностей и обоснование преимуществ использования различных вариантов мицеллярного и микроэмульсионного электрофоретического определения катехинов и катехоламинов в природных объектах.
5. Практические приложения выявленных закономерностей:
- одновременное определение основных полифенольных антиоксидантов и кофеина в зеленом и черном чае методами мицеллярной электрокинетической хроматографии (МЭКХ) с разными вариантами полярностей и микроэмульсионной электрокинетической хроматографии (МЭЭКХ);
- определение катехоламинов и их метаболитов методом мицеллярной электрокинетической хроматографии с обращенной полярностью (ОП МЭКХ) в моче с on-line концентрированием (свипинг) и пределом детектирования катехоламинов и их метаболитов 20-30 нг/мл.
