Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Современные способы определения эндокринных деструкторов в объектах окружающей среды 10
1.2. Методы формирования биочувствительного покрытия пьезокварцевого иммуносенсора 22
2. Экспериментальная часть 31
2.1. Характеристика объектов исследования, химических реагентов, биополимеров и иммунореагентов 31
2.2. Приборы и вспомогательное оборудование. 35
2.3. Подготовка проб для анализа объектов окружающей среды, лекарственных препаратов, полимерных материалов и средств гигиены 37
2.4. Синтез гаптен-белковых конъюгатов для определения линейных алкилбензолсульфонатов
2.5. Определение константы аффинности 39
3. Исследование условий получения рецепторного слоя на поверхности электродов иммуносенсоров 41
3.1 Ковалентная иммобилизация рецепторных молекул 42
3.2. Фотоиммобилизация рецепторных молекул 51
4: Оценка аффинности и специфичности иммунореагентов 53
4.1. Кинетические исследования иммунохимического взаимодействия антиген-антитело 53
4.2. Оценка специфичности иммунореагентов 59
5. Оптимизация условий проточно-инжекционного определения биологически активных веществ 64
5.1. Сравнение форматов иммунохимического анализа 64
5.2. Влияние концентрации иммунореагентов на полноту протекания иммунохимических реакций 66
5.3. Влияние скорости, природы и рН буферного раствора-носителя на величину аналитического сигнала 69
5.4. Влияние природы регенерирующего раствора на воспроизводимость аналитического сигнала 72
6. Применение иммуносенсоров для определения биологически активных веществ 75
6.1. Определение нонилфенола в водных средах 77
6.2. Определение бисфенола А в жидких средах 81
6.3. Определение линейных алкилбензолсульфоиатов в жидких средах 84
6.4. Определение 4-аминофенола в фармацевтических формах... 86
6.5. Определение котинина в биологических пробах 89
Выводы 92
Библиографический список использованной литературы 94
Приложение 110
- Методы формирования биочувствительного покрытия пьезокварцевого иммуносенсора
- Подготовка проб для анализа объектов окружающей среды, лекарственных препаратов, полимерных материалов и средств гигиены
- Кинетические исследования иммунохимического взаимодействия антиген-антитело
- Влияние скорости, природы и рН буферного раствора-носителя на величину аналитического сигнала
Введение к работе
Актуальность. Иммунохимические методы анализа находят применение при анализе объектов окружающей среды, пищевой и фармацевтической промышленности, в клинической диагностике. Они основаны на специфическом гомогенном или гетерогенном связывании определяемого антигена с антителами, что обеспечивает селективное определение целевых компонентов в сложных матрицах. Такие методы характеризуются достаточно высокой чувствительностью и селективностью. Однако, как правило, анализ выполняется в дискретном режиме и плохо поддается автоматизации.
Известно, что проведение иммунохимических реакций на поверхности электродов сенсоров облегчает автоматизацию анализа, снижает его продолжительность. Применение пьезокварцевых резонаторов, чувствительных к изменению массы, и специфических иммунореагентов, иммобилизованных на поверхности электродов, позволяет разработать пьезокварцевые иммуносенсоры, обеспечивающие прямое детектирование токсичных соединений в водных средах без введения дополнительных меток. Такие сенсоры положительно зарекомендовали себя при определении ряда токсикантов, характеризуются высокой чувствительностью, малой инерционностью, что обеспечивает наблюдение за ходом иммунохимических взаимодействий практически в режиме реального времени.
Загрязнение объектов окружающей среды соединениями, оказывающими негативное влияние на эндокринный статус человека (эндокринные деструкторы), явилось следствием широкого применения их при производстве пластмасс, моющих средств, красителей и гербицидов. Зндокрі иные деструкторы (бисфенол А - ВРА, нонилфенол - NP, линейные алкилбензолсульфонаты - LAS; ПДК - 1, 20, 500 нг/мл, соответственно) подобно половому гормону эстрогену влияют на репродуктивные функции человека, блокируют выработку мужских гормонов, характеризуются мутагенным и канцерогенным свойствами, вызывают расстройства половой и эндокринной систем. Присутствующий в качестве примеси в фармацевтических препаратах на основе парацетамола 4-аминофенол (4-АР) обладает пирогенным эффектом и вызывает заболевания кожных покровов, глаз, нарушает работу печени (содержание в препарате не должно превышать 0,01%). Котинин (СОТ) может служить маркером для оценки степени отравления курильщиков никотином при проведения анализа биологических проб.
Высокочувствительное и селективное определение таких биологически активных веществ (БАВ) в объектах окружающей среды, лекарственных препаратах и биологических образцах является актуальной задачей аналитической химии.
Цель работы. Исследование закономерностей иммунохимических реакций, протекающих на поверхности электродов пьезокварцевых сенсоров, и разработка методик проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных деструкторов, 4-аминофенола и котинина в жидких средах.
Для достижения этой цели необходимо было решить следующие задачи:
- Изучить и научно обосновать стратегию сайт-направленной ковалентной иммобилизации гаптен-белковых конъюгатов или аналитов на предварительно активированной поверхности пьезокварцевого резонатора;
- Исследовать закономерности гетерогенной иммунохимической реакции антиген-антитело;
- Исследовать кинетику взаимодействия гаптен-белковых конъюгатов, иммобилизованных на поверхности электрода сенсора с антителами;
- Оценить специфичность применяемых иммунореагентов;
- Выявить доминирующие факторы, определяющих чувствительность проточно-инжекционного определения биологически активных соединений; - Разработать методики проточно-инжекционного определения
эндокринных ядов, 4-аминофенола, котинина в различных объектах с
применением пьезокварцевых иммуносенсоров в качестве детектора.
Научная новизна.
- Установлены и реализованы на практике принципы формирования многослойного биорецепторного покрытия пьезокварцевых иммуносенсоров, обеспеччвающие высокую активность биослоя и сохранение его постоянной массы в течение 15-30 циклов измерений.
- Изучено влияние природы рецепторных покрытий и технологии их получения на величину аналитического сигнала сенсора при определении нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов.
- Установлены закономерности иммунохимической реакции, протекающей на поверхности сенсора, позволяющие прогнозировать пути оптимизации условий проточно-инжекционного определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов, 4-аминофенола и котинина в сложи ix по составу смесях с применением пьезокварцевого сенсора.
- Оценено влияние различных форматов иммунохимического анализа (конкурентный, анализ с утяжелением массы) на аналитический сигнал пьезокварцевого иммуносенсора.
Установлены количественные взаимосвязи чувствительности определения фенолов (А) с величинами электронных эффектов заместителя в их молекулах, имеющие прогнозирующие функции.
- Выявлены основные факторы, влияющие на оперативные характеристики пьезокварцевых сенсоров при проточно-инжекционном определ ;нии БАВ в жидких средах.
- Показана возможность конкурентного определения следовых концентрации эндокринных ядов, 4-аминофенола в жидких средах на уровне нг/мл.
Практическая значимость. Предложены способы получения многослойных рецепторных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров, обеспечивающие высокую чувствительность определения биологически активных веществ, широкий диапазон определяемых содержаний и продолжительность эксплуатации.
Разработаны методики высокочувствительного и селективного проточно-инжекционного определения следовых концентраций эндокринных ядов, 4-аминофенола, котинина в жидких средах. Методика определения нонилфенола в жидких средах защищена патентом РФ (Патент № 2287820).
Показана возможность применения пьезокварцевого иммуносенсора для экспрессного определения следовых концентраций эндокринных ядов в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах и котинина в биологических жидкостях.
На защиту выносятся:
- Результаты исследований и выбора способов формирования биорецепторных покрытий пьезокварцевых иммуносенсоров, предназначенных для определения нонилфенола, бисфенола А, линейных алкилбензолсульфонатов.
- Результаты изучения закономерностей иммунохимических реакций антиген-антитело, протекающих на поверхности пьезокварцевого сенсора и лежащих в основе определения биологически активных веществ в жидких средах.
- Кинетические исследования иммунохимических реакций, рассчитанные значения констант скоростей прямой и обратной реакции, констант аффинности комплементарных иммунореагентов
- Коэффициенты перекрестного реагирования поликлональных антител с эндокринными ядами и их структурными аналогами.
- Результаты исследования условий проточно-инжекционного определения биологически активных веществ и факторы, обеспечивающие оптимальные оперативные характеристики пьезокварцевых сенсоров. - Методики проточно-инжекционного определения следовых
концентраций эндокринных ядов в объектах окружающей среды, 4-аминофенола в фармацевтических препаратах, котинина в биологических жидкостях.
Апробация работы. Основные результаты диссертации доложены на конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Актуальные проблемы современного естествознания» (Иваново, 2003); XII научно-практической конференции молодых ученых, аспирантов и студентов «Наша общая окружающая среда» (Липецк, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых «Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии» (Саратов, 2003); XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); I Международном форуме «Аналитика и аналитики» (Воронеж, 2003); Всероссийской конференции по аналитической химии «Аналитика России» (Москва, 2004); Международной научной конференции студентов, аспирантов и молодых ученых «Ломоносов-2005» (Москва, 2005); II Международном симпозиуме «Разделение и концентрирование в аналитической химии и радиохимии» (Краснодар, 2005); Всероссийской студенческой научно-технической школе -конференции «Инженерные науки - защите окружающей среды» (Тула, 2006); The International Congress on Analytical Sciences ICAS-2006 (Москва, 2006); VI Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды с международным участием «Экоаналитика - 2006» (Самара, 2006); Всероссийской конференции «Фагран-2006» (Воронеж, 2006).
Публикации. Основное содержание диссертации опубликовано в 3 статьях, 14 тезисах докладов, 1 патенте РФ на изобретение.
Структура работы. Диссертационная работа изложена на \Л9 страницах машинописного текста, включает 19 рисунков и 20 таблиц. Состоит из введения, 6 глав, выводов и списка использованных библиографических источников, включающего .125 ссылок на отечественные и зарубе жные работы. Работа выполнялась при финансовой поддержке программ Минобрнауки РФ: «Развитие научного потенциала высшей школы» (тема № 01970006723 «Проточные пьезокварцевые иммуносенсоры: новые возможности для определения физиологически активных веществ»), темплана Минобрнауки РФ (тема «Физико-химические основы формирования и функционирования биосенсорных систем для определения физиологически активных веществ»), регионального гранта РФФИ «Новые методы определения биологически активных соединений, основанные на иммунохимических реакциях на поверхности пьезокварцевых сенсоров» (грант № 06-03-96339_р_центр_а), стипендии Президента РФ.
Методы формирования биочувствительного покрытия пьезокварцевого иммуносенсора
В настоящее время для определения микро- и ультрамикроколичеств токсичных органических соединений все более широкое применение находят иммуносенсоры различной природы. Сенсор включает два основных блока -распознающий биорецептор (на основе иммобилизованных молекул антител, антигенов, гаптен-белковых коньюгатов) и детектор (трансдьюсер), преобразующий иммунохимическое взаимодействие в аналитический сигнал. Особое место среди трансдьюсеров занимают пьезокварцевые резонаторы, чувствительные к изменению массы. Этот тип датчиков, известный как микровесы, обеспечивает уникальную возможность прямой регистрации образования иммунного комплекса по увеличению массы рецепторного слоя сенсора. Такие сенсоры отличаются от аналитических устройств, основанных на косвенном детектировании, требующем дополнительного введения меток (ферментных, флуоресцентных, радиоизотопных и др.). Кроме того, пьезокварцевые сенсоры дают возможность наблюдать развитие биохимической реакции в режиме реального времени и осуществлять кинетические исследования не только всего процесса, но и отдельных его стадий. Чувствительность и воспроизводимость определения высоко- и низкомолекулярных соединений с помощью пьезокварцевого иммуносенсора существенно зависят от способа иммобилизации рецепторных молекул на поверхности его электродов.
Современный этап создания иммуносенсоров характеризуется использованием все более сложных матриц для закрепления иммунореагентов. Акцент делается на создании многофункцональных слоев с заранее заданными СВОЙСТВРМИ, одновременно связывающих и отделяющих иммунореагенты от поверхности электрода. Происходит объединение различных подходов к закреплению биоматериалов - ковалентной сшивки, включения в полимерные трехмерные матрицы, физической сорбции. Другая тенденция - упрощение самой процедуры иммобилизации. Возвращение к приемам физической сорбции и появление новых способов включения иммунореагентов в пленку полимера, например, в процессе электрополимеризации - основные тенденции совершенствования способов иммобилизации иммунореагентов для создания иммуносенсоров.
Не существует идеального способа иммобилизации, применяемого для всех иммунореагентов, поскольку каждый из методов имеет свои достоинства и недостатки.
Так, физическая сорбция, которая осуществляется за счет неспецифических взаимодействий или водородных связей [68], дает хорошие результаты при использовании иммуносенсоров в неводных средах, но часто не обесьечивает воспроизводимости сигнала в водной среде из-за частичного смыва биослоя с поверхности преобразователя. Этот прием также обеспечивает сохранение активности рецепторных молекул, а также формирование слоя с невысокой плотностью [69], но иногда из-за конформационных изменений молекул отмечают снижение функциональной активности [70-72]. Количество закрепленного белка на поверхности электродов сенсора, а, следовательно, и чувствительность сенсора определяется природой металла и закрепляемого белка, которая зависит от рН, ионной силы раствора и температуры, а также от времени инкубирования сенсора в растворе антител [73].
Формирование покрытия с помощью физической сорбции позволило создать иммуносенсоры для определения рицина, вируса герпеса и т.д. [74-75] Основными недостатками таких сенсоров является малая величина сорбционной емкости и неустойчивость покрытия, что снижает воспроизводимость определения и срок службы сенсора.
Однако физическая сорбция позволяет не только проводить непосредственное формирование биорецепторного покрытия электрода сенсора, но и создавать промежуточный белковый слой, обеспечивающий достаточно прочное связывание, как с металлической поверхностью электрода, так и с молекулами иммунореагентов. В качестве такой белковой прослойки часто используется белок А, образующий достаточно прочные комплексы с золотом в нейтральной среде [76, 77-78]. Применение белка А позволяет достаточно активно связать специфически молекулы иммуноглобуллинов (особенно класса IgG), не затрагивая при этом активных центров антител, что способствует сохранению их активности в иммобилизованном состоянии [79]. Данный способ иммобилизации обеспечивает не только высокую чувствительность и связывающую способность биорецепторного слоя, но и его эластичность, что важно для стабильной работы пьезокварцевого иммуносенсора [80]. Разработанные сенсоры для определения инсулина, некоторых вирусов и бактерий с биорецепторным покрытием, сформированным из молекул белка А, показали высокую чувствительность и стабильность работы даже спустя несколько месяцев [81-82].
Химической сорбцией получают обычно насыщенные плотные, трудно разрушаемые слои, устойчивые при анализе жидких сред в проточном или проточно-инжекционном анализе [83]. При ковалентной иммобилизации происходит более прочное закрепление биослоя на электроде, что снижает потери при длительном контакте его с жидкостью, обеспечивает более высокую воспроизводимость аналитического сигнала и повышает многократность использования иммобилизованной твердой фазы после регенерации.
Разновидностью химической сорбции является метод кросс-сшивки, результат которой зависит от природы сшивающего реагента и носителя [84]. Кросс-сшивку осуществляют с помощью различных моно- и гетеробифункциональных реагентов, например гидразид- и сукцинимидсодержащих производных; чаще других используют глутаровыи альдегид, который легко вступает в реакцию с аминогруппами, образуя дополнительные метиленовые мостики в молекуле белка [85]. Ковалентное связывание при помощи бифункциональных реагентов, таких, как глутаровый альдегид, стабилизирует активность иммобилизованных биоагентов, но ведет к повышенному расходу препарата из-за его побочной полимеризации. Тем не менее, кросс-сшивка глутаровым альдегидом в силу доступности реагента и его дешевизны остается наиболее широко применяемым способом иммобилизации биореагентов при создании иммуносенсоров.
Наибольший интерес представляет метод формирования подложки на основе самособирающихся монослоев (SAM). К его достоинствам относятся однородность получаемого слоя, что минимизирует стерические затруднения подхода определяемых соединений к центрам биохимического распознавания, равномерное распределение и пространственная доступность активных центров молекул и функциональных групп для связывания с рецепторными молекулами, высокая механическая прочность и химическая устойчивость [85-87]. Идеальный монослой представляет собой плотно упакованные нити молекул, прочно связанные с гладкой поверхностью (например, металла).
Подготовка проб для анализа объектов окружающей среды, лекарственных препаратов, полимерных материалов и средств гигиены
Приборы для проточно-инжекционного анализа. Лабораторная установка для проточно-инжекционного анализа (рис.1) состояла из перистальтического насоса «Microtechna» (Чехия), дозатора, проточной ячейки детектирования, объемом 15-20 мкл, включающей серийно выпускаемые отечественные пьезокварцевые резонаторы АТ-среза с серебряными и золотыми электродами диаметром 8 мм и собственной частотой колебаний 10 МГц (ЗАО «ЭТНА», ОАО «Квант», Россия), на поверхности которых иммобилизовали иммунореагенты (антитела или коньюгаты). Сенсоры контактировали одной стороной с анализируемой жидкой фазой. Силиконовые трубки диаметром 0,16 мм соединяли микроячейку с перистальтическим насосом и дозатором. Скорость потока жидкости составляла 30 - 120 мкл/мин. Изменение частоты колебаний сенсора регистрировали частотомером 43-54 и для обработки данных использовали персональный компьютер Intel Pentium IV. Измерения проводили при температуре 25±5 С.
Проточная ячейка детектирования (рис. 2а) объемом 15-20 мкл представляет собой две пластины из органического стекла толщиной 10-15 мм, соединяющиеся друг с другом при помощи винтов. В одной из пластин под углом ( 60) располагаются два сквозных отверстия, в которых размещены иглы, обеспечивающие поступление пробы в центр электрода иммуносенсора, где массочувствительность максимальна. В специальных углублечиях на обеих пластинах расположены мягкие силиконовые прокладки для герметичного закрепления иммуносенсора в ячейке. В целом конструкция проточной ячейки обеспечивает контакт только одной его стороны с анализируемым раствором.
Для исследований также применялся серийно выпускаемый фирмой Stanford Research Systems (США) прибор для проточно-инжекционного анализа QCM-200 (Рис. 26).
На поверхности электрода сенсора формировали биорецепторное покрытие на основе иммунореагентов, при этом массу биослоя контролировали методом микровзвешивания. Иммобилизацию гаптен-белковых конъюгатов или карбоксипроизводных аналитов осуществляли на очищенной поверхности серебряных и (или) золотых электродов сенсоров в несколько стадий: модификация поверхности, активация ее функциональных групп и закрепление рецепторных белковых молекул или молекул аналитов.
Вспомогательное оборудование. Для измерения рН буферных растворов использовали рН-метр «Эксперт-001» (Россия). Для отделения нерастворимых компонентов пробы применяли настольную центрифугу ЦПН-2; для встряхивания проб - шейкер «MaxQ Mini 4450» (США). При синтезе гаптен-белковых конъюгатов использовали оборудование для ТС-хроматографии, дозаторы, прибор для лиофильной сушки «FreeZone» (США). Степень модифицирования белков 3-(р-сульфофенил)-бутановой кислотой определяли спектрофотометрически: спектрофотометр «СФ-46» (Россия). Образцы природных и сточных вод анализировали без дополнительной пробоподготовки.
Лекарственные препараты. Подготовку к анализу образцов готовых лекарственных препаратов («Парацетамол», «Цитрамон» и т.д.) осуществляли в соответствии с требованиями Государственной Фармакопеи [113]: одну таблетку массой 0,5 г растворяли в 1 мл этилового спирта при температуре 25 С ± 0,5 С и непрерывном перемешивании. К аликвоте (50, 100 и 250 мкл) полученного раствора, разбавленного буферным раствором в 1000 par., добавляли 50 мкл раствора антител (разведение 1:50) и доводили общий объем пробы до 1 мл. После инкубирования в течение 2-5 мин 200 мкл раствора использовали для проточно-инжекционного анализа.
Влажные салфетки. Пробоподготовку осуществляли аналогично [25]. Для определения нонилфенола салфетку помещали в коническую колбу, заливали дистиллированной водой и оставляли на 24 часа при 25 С. К аликвоте (50, 100 и 250 мкл) полученного раствора, добавляли 50 мкл раствора антител (разведение 1:50) и доводили общий объем пробы до 1 мл. После инкубирования в течение 2-5 мин 200 мкл раствора использовали для проточно-инжекционного анализа.
Пластиковые бутылочки для детского питания. Пробоподготовку осуществляли аналогично [25]. Полимерный материал предварительно промывали дистиллированной водой, затем заливали фиксированным объемом дистиллированной воды, выдерживали в течение суток при температуре 25 С (проба А) и 40 С (проба Б). К аликвоте (50, 100 и 250 мкл) полученного раствора, добавляли 50 мкл раствора антител (разведение 1:50) и доводили общий объем пробы до 1 мл. После инкубирования в течение 2-5 мин 200 мкл раствора использовали для проточно-инжекционного анализа.
Синтетические моющие средства. Навеску CMC растворяли в дистиллированной воде. К аликвоте (50, 100 и 250 мкл) полученного раствора, добавляли 50 мкл раствора антител (разведение 1:50) и доводили общий объем пробы до 1 мл. После инкубирования в течение 2-5 мин 200 мкл раствора использовали для проточно-инжекционного анализа.
Кинетические исследования иммунохимического взаимодействия антиген-антитело
Поликлональные антисыворотки представляют собой неоднородную смесь частиц антител с разнообразным сродством к различным детерминантам антигена, и поскольку каждый из активированных сайтов связывалия антител вносит свой вклад в кинетику распознавания, это приводит к перекрестным взаимодействиям со структурными аналогами аналитов.
Были рассчитаны значения коэффициентов перекрестного реагирования: (где 1С5о - концентрация, соответствующая 50%-ому ингибированию связывания токсиканта А и его аналога В), позволяющие оценить селективность иммунохимического определения эндокринных ядов в присутствии родственных соединений (Табл. 9).
Антитела к LAS характеризуются групповой специфичностью -значения CR.,% находятся в диапазоне 50 - 100% для всех исследованных структурных аналогов (LAS-1, LAS-2, LAS-3, LAS-4, LAS-42, LAS-43, 4-DBSA). Однако, величина CR,% для DSA - соединения неароматического строения, не превышает 5%, для фенола CR,% 0,2. Следовательно, можно констатировать, что возможно селективное определение суммарного количества алкилбензолсульфонатов в присутствии сульфосоединений неароматического характера и фенолов.
Поликлональные антитела к бисфенолу А обладают высокой специфичностью, что позволяет проводить определение ВРА с в присутствие других соединений: фенола, 4-нитрофенола, 4-крезола (CR,% 6%) и др. Высокое значение CR,% (120 %) для 2-(я-гидроксифенил),2-(я-карбоксифенил)пропана объясняется использованием данного соединения для получения конъюгированного иммуногена, следовательно, поэтому даже в следовых количествах это соединение мешает определению ВРА.
Были исследованы моноклональные и поликлональные антитела к нонилфгнолу, поликлональные антитела к 4-аминофенолу. Коэффициенты перекрестного реагирования для 4Н6 не превышают 5% для родственных фенолов, содержащих заместители в пара- и орто- положениях. Антитела IgG Myg 2 характеризуются максимальным значением CR,% для 4-аминофенола (150%). Достаточно высокие значения коэффициентов CR,% для пара-замещенных фенолов с электронодонорными заместителями (70-100%), свидетельствует о том, что поликлональные антитела узнают специфическую электронную конфигурацию, образующуюся при взаимодействии л-электронов ароматического кольца с заместителем (-ОН, -С9Н19), которая придает сходство пара-замещенным фенолам с 4-аминофенолом. Коэффициенты CR,% для фенолов с электроноакцепторным заместителем (-NO2) существенно ниже.
Важной характеристикой сенсора является чувствительность определения - параметр А, которую устанавливали по тангенсу угла наклона линейного участка зависимости Аг /(СфС10л). Максимальное значение параметра А при применении поликлональных антител IgG Myg-2 отмечено для 4-нитрофенола, а минимальное для 4-аминофенола (табл. 9), т.е. чувствительность определения минимальна для соединений с высоким значенном CR,%. Следовательно, поликлональные антитела могут быть использованы для определения с более высокой чувствительностью замещенных фенолов в отсутствие других родственных соединений. Значение параметра А существенно зависит от природы и количества заместителей в молекуле определяемого вещества и коррелирует с константой с, характеризующей электронные эффекты заместителей в молекуле фенола. Эта зависимость удовлетворительно описывается уравнением Гамета [120]: IgA = lgA„ + op, где А, А0 - чувствительность определения замещенного и незамещенного фенола; р - коэффициент, характеризующий реакционную серию.
Получены уравнения для следующих реакционных серий: IgA = 0,28а + 0,57 - для napa-замещенных фенолов; IgA = 0,28о + 0,55 - для моно-, ди-, тринитрофенолов; IgA = 0,05а + 0,60 - для тризамещенных фенолов. Выведенные уравнения могут быть использованы для прогнозирования чувствительности определения с помощью поликлональных антител других замещенных фенола. Например, для нонилфенола, рассчитанное по уравнению для пара-замещенных фенолов и полученное экспериментально значение А (Гц/нг) (2,6 и 2,5, соответственно), практически совпадают, относительная погрешность прогнозирования составляет 3,8 %. Также были рассчитаны коэффициенты перекрестного реагирования для структурных аналогов нонилфенола при применении антител к NP (Табл. 10): 9-и-гидроксифенилнонановая кислота, 7-я гидроксифенилгептановая кислота, нонилфенолэтоксилат-7, нонилфенолэтоксилат-12. Антитела Anti-HHA характеризуются высоким значением CR,% (100%) для соединений, имеющим в своем составе линейный алкильный радикал; антитела Anti-NP(STI), Anti-NP(BSA)R-8, наоборот, реагируют с соединениями, имеющие разветвленную структуру алкильного радикала АРЕ-9-7, АРЕ-9-12 (CR,% 120%). При использовании поликлональных антител Anti-HHA, Anti-NP(STI), Anti-NP(BSA)R-8 перекрестные реакции с близкими по структуре соединениями 9-p-OHPh-поп, 7-p-OHPh-hept или АРЕ-9-7, АРЕ-9-12 могут быть причиной ложных положительных ответов сенсора, что недопустимо, особенно при определении низких концентраций нонилфенола в многокомпонентных пробах.
Влияние скорости, природы и рН буферного раствора-носителя на величину аналитического сигнала
Возможны два варианта применения пьезокварцевых иммуносенсоров как тест -средств и детекторов для проточно-инжекционного анализа. Более перспективно применение пьезокварцевых иммуносенсоров в проточно-инжекционном анализе. В этом случае значительно сокращается время единичного определения (до нескольких минут) и регистрация сигнала осуществляется в режиме реального времени. Кроме того, существенно повышается воспроизводимость определения (регистрируется относительное изменение частотного сдвига), снижается влияние неспецифических взаимодействий (соединения, сорбированные покрытием, удаляются с поверхности сенсора буферным раствором-носителем), появляется возможность многократного использования сенсора после регенерации биочувствительного слоя в конце каждого этапа измерения.
Проведенные исследования позволили установить оптимальные условия протекания иммунохимических реакций как в прямом (регистрация аналитического сигнала сенсора), так и в обратном (регенерация биорецепторного покрытия) направлениях. Результаты были использованы при разработке методик проточно-инжекционного определения следовых концентраций бисфенола А, нонилфенола, линейных алкилбензолсульфснатов в объектах окружающей среды и тестировании полимерных материалов; определения 4-аминофенола в фармацевтических препаратах и котинина в биологических жидкостях. При этом созданы условия для автоматизации анализа, что особенно привлекательно при проведении рутинных измерений. Для определения ксеноэстрогенов (нонилфенол, бисфенол А, линейные алкилбензолсульфонаты), 4-аминофенола и котинина в жидких средах с помощью пьезокварцевых иммуносенсоров в проточно-инжекционном режиме применяли конкурентный вид анализа с учетом выше проведенных исследований. Поскольку аналитический отклик учитывает только специфическое взаимодействие, то для снижения вклада неспецифической сорбции и удаления с рецепторного слоя примесных компонентов перед регистрацией сигнала поверхность сенсора промывали буферным раствором носителем (КН2Р04 - Na2HP04 или NaH2P04 - Na2HP04, рН 7,2). После этого вводили пробу в поток раствора-носителя и регистрировали изменение частоты колебания сенсора (величину Af рассчитывали по разности частот колебания до введения пробы в проточную систему и после достижения стационарного режима). Величина Af обратно пропорциональна концентрации аналита в пробе. Для восстановления числа активных центров на поверхности электрода сенсора и обеспечения возможности повторного измерения на одном и том же рецепторном покрытии в поток раствора носителя вводили регенерирующий раствор (0,035 тМ раствор KCNS,), вызывающий диссоциацию гетерогенного иммунокомплекса. Скорость потока раствора-носителя выбирали с учетом природы специфичных антител (для наиболее полного связывания поликлональных антител скорость потока составляла 60 мкл/мин, для моноклональных антител - 80 мкл/мл). Таким образом регламент проточно-инжекционного определения БАВ в жидких средах включал следующие стадии : пропускание буферного раствора через ячейку детектирования, включающую пьезокварцевый иммуносенсор, до стабилизации частоты колебания сенсора (30 - 40 мин). Отклонение частотного сигнала от баз звой линии не должно превышать 2 Гц, т. е. сигнала шума; ввод анализируемой пробы (200 мкл) в поток раствора-носителя, сопровождающийся снижением частоты колебания сенсора (Af) вследствие образования иммунокомплекса на поверхности электрода (3 мин). Продолжительность этой стадии анализа не превышает 2 мин при применении моноклональных антител и 3 мин при использовании пох иклональных антител; ввод буферного раствора (200 мкл) до стабилизации сигнала сенсора. Дрейф частотного сигнала не должен превышать величины шума (3 мин); пропускание регенерирующего раствора (100 - 200 мкл) для разрушения иммунного комплекса (2-3 мин) и восстановления первоначального числа активных сайтов на поверхности электрода сенсора; ввод буферного раствора (3-4 мин) до возвращения частоты колебаний сенсора к исходному значению fm (частота колебания сенсора не должна отличаться от значения f на подготовительной стадии анализа более чем на 5 %).
Широкое применение нонилфенолэтоксилатов в качестве детергентов и эмульгаторов при производстве моющих средств, красителей, антиоксидантов, гербицидов и дубильных веществ привело к загрязнению окружающей среды продуктами их деструкции, в особенности нонилфенолом, который характеризуется высокой токсичностью. Нонилфенол проявляет канцерогенную и эстрогенную активность, способен аккумулироваться в организме, вызывая заболевания эндокринной системы животных и человека, блокирует выработку мужских гормонов - андрогенов, негативно влияет на репродуктивную функцию организма [112]. Мониторинг рек Португалии показал, что в природных водах содержится до 10 - 200 нг/мл нонилфенола [121]. Поэтому в ряде стран Европейского сообщества и США [122] были введены ограничения на использование алкилфенолэтоксилатов в производстве.
