Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 6
ВВЕДЕНИЕ 8
ГЛАВА 1 Иммунохимические методы определения физиологически активных соединений 12
1.1. Особенности определения высокомолекулярных и низкомолекулярных антигенов 13
1.2. Методы иммуноанализа некоторых высокомолекулярных соединений 20
1.2.1. Методы иммуноанализа, основанные на преципитации и агглютинации белков 20
1.2.2. Иммуноферментное определение белков 22
1.2.3. Электрохимические методы определения высокомолекулярных соединений с использованием иммунологических взаимодействий 24
1.2.4. Современные варианты био- и иммуносенсоров для определения белков 26
1.3. Методы иммуноанализа некоторых низкомолекулярных соединений 29
1.3.1. Особенности определения пестицидов, лекарственных и наркотических препаратов 30
1.3.2. Метод поляризации флуоресценции для определения низкомолекулярных соединений 33
1.4. Некоторые аспекты определения отдельных лекарственных соединений 38
1.4.1. Свойства рибонуклеаз и методы их определения 38
1.4.1.1. Рибонуклеазы и их свойства 38
1.4.1.2. Методы определения рибонуклеаз 44
1.4.2. Свойства сульфаниламидных соединений и методы определения сульфонамидов 48
1.4.2.1. Действие и метаболизм сульфонамидов в организме 48
1.4.2.2. Методы определения сульфонамидов 55
1.4.3 Специфичность иммуноанализа 62
1.4.3.1 Группоспецифичный иммуноанализ сульфонамидных препаратов 64
ГЛАВА 2 Постановка задачи, приборы, реактивы, объекты исследования и условия эксперимента 68
2.1. Постановка задачи 68
2.2. Материалы и оборудование 70
2.3. Условия и методика эксперимента 74
2.3.1. Синтез иммуногенов, конъюгатов, определение их состава 74
2.3.2. Проведение поляризационного флуоресцентного иммуноанализа: синтез трейсеров, тестирование поликлональных антисывороток 80
2.3.3. Определение аналитических характеристик 82
ГЛАВА 3 Иммунохимическое определение рибонуклеаз 83
3.1. Выбор условий регистрации токов на планарных платиновых электродах 83
3.2. Неконкурентный иммуноанализ РНКаз с помощью амперометрического иммуноферментного сенсора 84
3.2.1. Иммобилизация биореагентов на поверхности платиновых электродов 85
3.2.2. Условия функционирования иммуноферментного сенсора 88
3.2.3. Оценка возможности применения ИФС для определения рибонуклеаз 89
3.2.3.1. Разработка способа определения рибонуклеази А 89
3.2.3.2. Определение рибонуклеазы Bacillus intermedins 91
3.3. Конкурентный иммуноанализ рибонуклеазы А с использованием ферментной метки 93
3.3.1. Синтез конъюгата РНКаза-ХЭ и определение его состава 94
3.3.2. Определение удельной активности ХЭ в конъюгате с РНКазой 96
3.3.3. Проведение конкурентного иммуноанализа РНКазы 97
3.4. Аналитические возможности определения РНКазы в некоторых объектах 101
3.4.1. Определение РНКазы в лекарственных формах 102
3.4.2. Определение РНКазы в сыворотке крови 103
ГЛАВА 4 Иммуноферментный анализ сульфаметазина с помощью амперометрического иммуносенсора 104
4.1. Получение и характеристика конъюгатов гаптен-белок и антитела-фермент 105
4.2. Определение сульфаметазина в формате конкурентного иммуноанализа 108
ГЛАВА 5 Поляризационный флуоресцентный иммуноанализ сульфонамидов 110
5.1. Определение индивидуальных сульфонамидов на примере сульфаметазина с помощью антисыворотки, специфичной к группе нескольких сульфонамидов 110
5.1.1. Выбор условий проведения ПФИА 111
5.1.2. Специфичность иммуноанализа 113
5.2. Определение отдельных сульфонамидов на примере сульфадиазина с помощью антисыворотки с индивидуальной специфичностью 115
5.2.1. Выбор условий определения сульфадиазина: структура трейсеров и их связывание с антителами 116
5.2.2. Использование гомологичных и гетерологичных трейсеров в различных вариантах иммуноанализа 120
5.2.3. Специфичность антисыворотки против сульфадиазина 122
5.3. Аналитические возможности определения сульфонамидов с помощью антител, специфических к группе структурно подобных соединений 124
5.3.1. Применение антител, полученных на синтетический аналог сульфонамидов - Ы-сульфанил-4-аминобутановую кислоту 124
5.3.1.1. Сравнение подходов в дизайне гаптенов для получения иммуногенов 124
5.3.1.2. Выбор антисывороток в зависимости от природы белка иммуногена и количества циклов иммунизации для иммуноанализа 127
5.3.1.3. Оценка специфичности антител 130
5.3.2. Применение смеси поликлональных антител: аналитические характеристики и специфичность 133
5.4. Определение сульфонамидов в объектах 136
5.4.1. Определение сульфаметазина в таблетках и природной воде 136
5.4.2. Определение сульфаниламида в молоке 138
ВЫВОДЫ 141
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 143
Введение к работе
Разработка экспрессных, точных и чувствительных вариантов определения физиологически активных соединений - одна из актуальных задач современной аналитической химии. Исследования в этой области стимулируются потребностями медицины, пищевой промышленности, ветеринарии, необходимостью мониторинга окружающей среды. Особый интерес для этих целей представляют биохимические методы, которые в последние годы получают все большее распространение. Среди них, доминирующее положение занимает иммуноанализ, как наиболее подходящий для эффективного, экспрессного и недорогого определения большого количества образцов. Интерес к иммунохимическим методам анализа связан еще и с возможностью относительно простого варьирования селективности определений по отношению к ряду соединений, в основном за счет использования антител с различной специфичностью. Несмотря на существующие варианты иммуноанализа, разнообразие объектов исследования, усложнение аналитических задач требуют дальнейшего усовершенствования подходов к разработке вариантов анализа и схем иммунохимических методов.
Определение высоко- и низкомолекулярных лекарственных соединений представляет как практический, так и теоретический интерес для изучения их свойств, содержания в сыворотке крови и других матриксах, влияния на организм человека и животных, фармакокинетики, структуры синтезированных соединений и биохимических реакций с их участием. Лекарственные соединения, как и многие физиологически активные вещества, способны оказывать положительное или отрицательное воздействие на организм в зависимости от дозы и длительности воздействия. Кроме того, в связи с широким применением высокоэффективных лекарств в других областях жизнедеятельности (например, в сельском хозяйстве) в воде и пищевых продуктах могут содержаться остатки этих препаратов, в количествах, превышающих безопасный уровень. В связи с требованиями повышения качества жизни и увеличением поступлений фальсифицированной продукции на фармацевтический рынок, в последнее время необходимы разнообразные варианты количественного определения широкого круга лекарств, включающих высоко- и низкомолекулярные соединения, для оценки их качества, а также для определения их содержания в организме человека и животных.
Направленность разрабатываемых иммунохимических методов на решение конкретных практических задач обуславливает смещение иммунохимических исследований больше в сторону оптимизации уже существующих методов иммуноанализа. Такая оптимизация включает поиск новых иммунореагентов, способов иммобилизации, условий и схем проведения иммуноанализа, возможность миниатюризации технологии и автоматизации процесса измерения аналитического сигнала, в сочетании с относительной простотой работы, высокой чувствительностью и селективностью определений. Исследования, проводимые в настоящее время, включают разработки в области мультианализа, когда анализируют содержание не только индивидуального соединения, но группу соединений, обладающих родственными структурными особенностями, либо принципиально различные по структуре. Весьма перспективными в этом отношении являются био- и иммуносенсоры, обладающие преимуществом on-site тестирования, а также иммунохимические методы, позволяющие анализировать большое количество образцов в день (иммуноферментный анализ, поляризационный флуоресцентный иммуноанализ). Выбор того или иного метода зависит от конкретной задачи, стоящей перед исследователем.
Цель исследования заключалась в разработке новых вариантов иммуноанализа высоко- и низкомолекулярных лекарственных соединений на примере двух форм высокомолекулярного белка рибонуклеазы (панкреатической и микробной рибонуклеазы) и низкомолекулярных антимикробных препаратов сульфаниламидного класса, выборе параметров аналитических систем для определения, как индивидуальных соединений, так и группы родственных соединений, с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров, а также поляризационного флуоресцентного иммуноанализа.
Научная новизна работы. Разработаны варианты конкурентного и неконкурентного электроиммуноанализа высокомолекулярных соединений - двух форм рибонуклеаз (барназы и биназы) и низкомолекулярного лекарственного соединения сульфаметазина, основанные на использовании амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров, и варианты конкурентного поляризационного флуоресцентного иммуноанализа низкомолекулярных лекарственных соединений сульфонамидного ряда (сульфаметазина, сульфадиазина, сульфаниламида). Впервые синтезированы конъюгаты панкреатической рибонуклеазы и бутирилхолинэстеразы, а также конъюгаты бычий сывороточный альбумин-сульфаметазин и антитела против сульфаметазина-холинэстераза. Показана возможность определения удельной активности фермента в полученных конъюгатах. Получены различные по структуре и составу конъюгаты соединений сульфонамидного ряда с производными флуоресцеина (трейсеры). Выявлено влияние структуры конъюгатов гаптенов на специфичность антител, оценена специфичность иммунореагентов по отношению к структурно подобным соединениям. Предложены наилучшие пары антитела-меченый антиген для наиболее чувствительного определения, как индивидуальных соединений, так и группы структурно родственных соединений.
Практическая значимость работы. Предложены варианты иммуноанализа для определения РНКазы А и сульфонамидных препаратов (сульфаметазина, сульфаниламида) в лекарственных формах, сыворотке крови, пищевых продуктах (молоко), природной воде. Разработаны методики пробоподготовки таблеток сульфаметазина с использованием метанола, ацетонитрила, гидроксида калия и хлороводородной кислоты, а также способы пробоподготовки молока с помощью щавелевой и трихлоруксусной кислот для определения содержания сульфаниламида.
На защиту выносятся:
• Новые варианты иммуноанализа высоко - и низкомолекулярных лекарственных соединений на примере двух форм рибонуклеаз и сульфонамидных препаратов с помощью амперометрических иммуно- и иммуноферментных сенсоров и поляризационного флуоресцентного иммуноанализа;
• Получение иммунореагентов и их характеристика, определение молярного соотношения компонентов;
• Выбор условий функционирования иммуноаналитических систем и определение их аналитических характеристик;
•Параметры аналитических систем для определения индивидуальных соединений или группы родственных соединений.
Апробация работы. Материалы диссертации докладывались и обсуждались на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003); V Всероссийской конференции по анализу объектов окружающей среды "Экоаналитика-2003" с международным участием (Санкт-Петербург, 2003); IV Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 2003); VIIth International Conference on Agri-Food Antibodies (Uppsala, 2003); Всероссийской конференции, посвященной 100-летию со дня рождения академика И.П. Алимарина "Аналитика России" (Москва, 2004).
Публикации; По теме диссертации опубликовано 8 работ. Из них 2 статьи в международном и отечественном рецензируемых научных журналах и 6 тезисов докладов на Всероссийских и международных конференциях. Одна статья принята к печати.
Научный консультант по вопросам электрохимии биологически активных соединений - д.х.н., профессор, академик МАНВШ, академик РАЕН Г.К. Будников, научный консультант по вопросам, связанным с методом поляризации флуоресценции - К.Х.Н., в.н.с. С.А. Еремин.
