Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Литературный обзор 13
1.1. Основные свойства, классификация и распространение соединений фенольной природы 13
1.2. АО защитная система организма. Биологическая активность соединений фенольного типа 22
1.2.1. Антиоксидантная защитная система организма 22
1.2.2. Антиоксидантная активность соединений фенольной природы23
1.2.3. Антиоксидантная и биологическая активность витамина Е 26
1.2.4. Биологическая роль коэнзима 28
1.2.5. Антиоксидантные свойства флавоноидов 30
1.2.6. Антиоксидантные свойства каротиноидов 33
1.2.7. Антиоксидантая активность витамина С 35
1.3. Методы исследования АО свойств фенольных соединений 36
1.3.1. Хемилюминесцентный метод в определении антиоксидантов и их активности 36
1.3.2. Кинетические методы исследования антиоксидантных свойств различных объектов 39
1.3.3. Физико-химические методы исследования антиоксидантной активности объектов 41
1.3.4. Электрохимические методы исследования свойств антиоксидантов 43
1.4. Электрохимические методы в определении некоторых -фенольных соединений 48
1.4.1. Электрохимические методы в анализе токоферолов 50
1.4.2. Методы электрохимии в определении флавоноидов 53
1.5. Метрологическая оценка результатов анализа 55
Глава II. Физико-химические закономерности процесса ЭВ Ог в присутствии антиоксидантові Механизм ЕС в условиях линейной полу бесконечной иффузии с последующей химической реакцией псевдопервого порядка на примере процесса ЭВ 02 в присутствии антиоксидантов 58
2.1. Процесс ЭВ 02, осложненный наличием последующей химической реакции в условиях стационарной диффузии 63
2.2. Процесс ЭВ Ог, осложненный наличием последующей химической реакции взаимодействия с АО в условиях нестационарной диффузии 67
Глава III.Аппаратура и методика эксперимента 77
3.1. Приборы, ячейки, электроды, растворы и реактивы 77
3.3. Методика эксперимента 83
3.3.1. Исследование электрохимических свойств веществ 83
3.3.2. Методика определение антиоксидантной активности образцов84
Глава IV. Исследование Физико-химических свойств некоторых АО фенольной природы 86
4.1. Применение методов планирования эксперимента в оценке оптимальных условий анализа АО фенольной природы 86
4.2. Особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии индивидуальных антиоксидантов фенольной природы 102
4.2.1. Исследование антиоксидантных свойств некоторых флавоноидов по отношению к процессу ЭВ Ог 103
4.2.2. Антиоксидантные свойства производных кумаринов 106
4.2.3. Влияние аскорбатов металлов на процесс ЭВ Ог 111
4.2.4. Исследование суммарной антиоксидантной активности растительного сырья 116
4.2.5. Исследование антиоксидантной активности некоторых фенол-производных веществ в апротонных средах 128
4.3. Электрохимические свойства исследуемых фенольных соединений 133
4.3.1. Электрохимические свойства флавоноидов 133
4.3.2. Электрохимические свойства производных кумаринов 136
4.3.3. Электрохимические свойства коэнзима Q10 139
4.4. Корреляция между антиоксидантными свойствами и электрохимическими параметрами исследуемых соединений фенольной природы 143
Глава V. Метрологические аспекты методики определения суммарного количества антиоксидантов в объектах 150
5.1. Разработка и подготовка В А методики определения суммарного количества антиоксидантов в БАД к аттестации 152
5.2. Спектрофотометрический и вольтамперометрический методы определения АОА. Сравнительные определения 160
5.3. Утверждение типа вольтамперометрического анализатора по определению АОА билогически активных веществ 166
Обсуждение результатов 169
Выводы 175
Литература 177
Приложение 1 196
- АО защитная система организма. Биологическая активность соединений фенольного типа
- Процесс ЭВ Ог, осложненный наличием последующей химической реакции взаимодействия с АО в условиях нестационарной диффузии
- Исследование электрохимических свойств веществ
- Особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии индивидуальных антиоксидантов фенольной природы
Введение к работе
Актуальность темы. Использование антиоксидантов, веществ, прерывающих радикально-цепные процессы окисления в объектах органического и неорганического происхождения, получило широкое распространение в последнее время в различных областях химии, биологии и медицины. На основе индивидуальных антиоксидантов и БАВ создаются новые фармацевтические препараты и БАД, предназначенные для лечения и профилактики ряда заболеваний, нормализации обмена веществ.
Лавинообразный рост вновь синтезированных БАД, появляющихся на рынке и не всегда качественных, предъявляет все более серьезные требования к исследованию их свойств. В настоящее время не существует единой меры антиоксидантной активности подобных препаратов, нет единой регламентированной процедуры оценки антиоксидантной активности БАД, а результаты, полученные методами с различными модельными системами, зачастую не совпадают. Для проверки качества при сертификации БАД используются длительные, трудоемкие исследования, опирающиеся иногда на негостированные методики. Необходимость введения новых показателей, методик и приборов, обеспечивающих надежные результаты по исследованию свойств и активности подобных препаратов, становится актуальной задачей, от решения которой зависит эффективность и безопасность предлагаемых на рынке БАД, продукции пищевой, косметической и фармацевтической промышленности.
Антиоксиданты являются в настоящее время объектом весьма интенсивного применения и изучения. Об этом свидетельствует большое количество публикаций в научной отечественной и зарубежной периодической литературе. Однако, в систематизированном виде информация о свойствах антиоксидантов представлена очень ограниченно. Практически полностью отсутствуют сведения об электрохимических свойствах антиоксидантов природного и растительного происхождения, их
.''-.- ' 7 '...'
влиянии.на многостадийные электродные процессы и электровосстановление кислорода в частности;
В- данной работе в качестве метода исследования предлагается, использовать простой в: аппаратурном оформлении, экспрессный и; высокочувствительный метод вольтамперометрии, имеющий большие-потенциальные возможности в областйг электроаналитической химии, исследования і свойств БАВ, разработки методов аналитического контроля сложных объектов. Использование в качестве модельной реакции процесса электровосстановления кислорода^, идущего; по механизму, аналогичному, восстановлению кислорода в клетках организма человека и животного, тканях растений, и являющегося основным окислительным процессом во всех объектах искусственного'и природного происхождения, делает данный метод еще более привлекательным.
Цель работы: Разработка методики определения суммарного
количества^ антиоксидантов в БАД,, продукции, пищевой, косметической,
фармацевтической промышленности на основе процесса
электровосстановлениякислорода.
Задачи:
Рассмотреть закономерности, процесса ЭВ Ог в условиях линейной полубесконечной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций, взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами.:
Определить оптимальные концентрации^ и. время активного действия антиоксидантов на примере флавоноидов, построить математические модели процесса в области оптимума функции.
Исследовать антиоксидантную активность по- отношению к процессу ЭВ 02 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qio, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Ca,- Li и их смесей, экстрактов растений, продукции пищевой
8 промышленности (соки разных производителей) для определения оптимальных условий их применения.
Исследовать электрохимические свойства ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Qi0, определить оптимальные условия получения аналитического сигнала для определения данных веществ методом циклической вольтамперометрии.
Выявить корреляционные зависимости между электрохимическими параметрами и антиоксидантными свойствами исследуемых соединений фенольной природы.
Разработать методику выполнения измерений суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, фармацевтической промышленности. Провести сравнительные испытания антиоксидантной активности индивидуальных препаратов, используя различные методы определения. Провести оценку метрологических характеристик методики.
Научная новизна. Впервые рассмотрены закономерности процесса ЭВ С>2 в присутствии антиоксидантов в условиях как стационарной, так и нестационарной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами по механизму ЕС. Численным методом конечных разностей решена граничная задача для данного процесса. Определены некоторые кинетические параметры процесса.
Впервые проведено определение антиоксидантной активности по отношению к процессу ЭВ О2 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Q]0, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Ca, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей) методом катодной вольтамперометрии.
Получены математические модели первого и второго порядков для определения активности антиоксидантов в зависимости от концентрации и
9 времени их активного действия, используя методы планирования эксперимента.
Выявлены корреляционные зависимости между электрохимическими параметрами и антиоксидантными свойствами на примере ряда флавоноидов, производных кумаринов и жирорастворимых витаминов А и Е.
Практическая значимость. Разработана новая методика определения суммарного количества антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности с помощью метода катодной вольтамперометрии и процесса ЭВ Ог, отличающаяся чувствительностью, простотой в исполнении, экспрессностью, универсальностью.
На основе методики разработан новый анализатор «АОА». Прибор прошел государственные испытания с целью утверждения типа СИ, по результатам которых ему присвоен тип средства измерения - «Анализатор АОА» с приписанными метрологическими и техническими характеристиками. Анализатор сертифицирован Федеральным агентством по техническому регулированию и метрологии РФ (Сертификат RU.C.31.113.A № 28715) и внесен в единый Гос. реестр СИ под номером 35466-07.
Определены потенциалы окисления - восстановления ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Q]0 методом циклической вольтамперометрии, которые могут быть использованы в качестве аналитического сигнала для определения данных веществ.
Проведена оценка антиоксидантной активности по отношению к процессу ЭВ 02 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qio, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Ca, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей). Полученные результаты позволили выявить наиболее активные антиоксиданты, их композиции, способ
10 фракционирования экстрактов растений и дать рекомендации для их дальнейшего использования в фитотерапии. Положения, выносимые на защиту:
Результаты определения антиоксидантной активности по отношению к процессу ЭВ 02 ряда флавоноидов, производных кумаринов, жирорастворимых витаминов А, Е, коэнзима Qi0, соединений фенольной природы (агидол, фенозан, ионол, фенол), витамина С, аскорбатов Mg, Со, Fe, Са, Li, экстрактов растений, продукции пищевой промышленности (соки разных производителей).
Результаты определения электроаналитических свойств ряда флавоноидов, производных кумаринов, коэнзима Qio, которые могут быть использованы в качестве аналитического сигнала для определения данных веществ в БАД.
Новые методика и анализатор определения суммарного количество антиоксидантов в БАД, продукции пищевой, косметической, фармацевтической промышленности, природных объектах.
Результаты сравнительных определений антиоксидантной активности некоторых БАВ, используя метод вольтамперометрии и независимые аналитические методы анализа.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены устными и стендовыми докладами на XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003), European conference on analytical chemistry «Euroanalysis XIII» (Salamanca, Испания, 2004), III Всероссийской научной конференции «Химия и химическая технология на рубеже тысячелетий» (Томск, 2004), Всероссийской научной конференции с международным участием «Электроаналитика» (Екатеринбург, 2005), International Conference «Instrumental Methods of Analysis Modern Trends and Applications» (Iraklion, Греция, 2005), International Conference «International Congress on Analytical Sciences» (Moscow, 2006), The 13-th World Congress «Food in life» (Nantes, Франция, 2006), II Всероссийской конференции по
аналитической химии с международным участием «Аналитика России 2007» (Краснодар, 2007), 4 Black sea basin conference on analytical chemistry (Sunny Beach, Болгария, 2007), VII Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа «ЭМА-2008» (Уфа, 2008).
По материалам диссертации опубликовано 7 статей и 12 тезисов докладов.
Объем и структура диссертации. Диссертационная работа изложена на 200 страницах, содержит 34 таблицы, 40 рисунков и библиографию из 191 наименования. Работа состоит из введения, пяти глав, обсуждения результатов, выводов, списка литературы и приложения.
Во введении раскрыта актуальность темы, определены цели и задачи исследования, сформулированы научная новизна и практическая значимость работы.
В первой главе приведен литературный обзор, посвященный антиоксидантной защитной системе организма и роли фенольных соединений в ее составе, их распространение в природе и жизни человека; современное состояние теории и практики определения антиоксидантных и электрохимических свойств соединений фенольной природы. Рассмотрены общие вопросы метрологической оценки методик выполнения измерений.
Во второй главе рассмотрены теоретические закономерности процесса ЭВ 02 в условиях нестационарной диффузии, осложненного наличием последующих химических реакций взаимодействия активных кислородных радикалов с антиоксидантами по механизму ЕС. Рассчитаны некоторые кинетические параметры процесса, используя численные методы.
В третьей главе описаны условия эксперимента, способы приготовления растворов и электродов, представлены данные об используемом оборудовании и объектах исследования.
В четвертой главе рассмотрена АОА по отношению к процессу ЭВ О? некоторых биологически активных соединений фенольной природы, определены их электрохимические параметры, а также показана корреляция
12 между антиоксидантними свойствами и электрохимическими параметрами исследуемых соединений.
В пятой главе описаны метрологические аспекты методики определения суммарного количества антиоксидантов в различных объектах, рассчитаны метрологические показатели для представленной методики. Показаны результаты сравнительных испытаний вольтамперометрического и спектрофотометрического методов определения АОА. Представлен вольтамперометрический анализатор «Антиоксидант» для определения суммарной АОА и суммарного количества антиоксидантов в различных объектах.
АО защитная система организма. Биологическая активность соединений фенольного типа
Жизнедеятельность организма обеспечивается двумя процессами -ассимиляцией и диссимиляцией, в основе которых лежит обмен веществ между внутренней (клетками организма) и внешней средой. Для нормального течения обменных процессов необходимо поддерживать постоянство химического состава и физико-химических свойств внутренней среды организма (гомеостаз). Однако, неблагоприятные условия окружающей среды провоцируют в клетках неконтролируемый рост числа свободных радикалов и ведут к различным изменениям на клеточном уровне. В организме существует совершенная система антиоксидантной защиты, регулирующая процессы образования свободных радикалов. Но под различными воздействиями окружающей среды естественная система защиты организма не справляется с лавинообразным потоком свободных радикалов. Антиоксиданты встают на защиту клеток и организма в целом, прерывая радикально-цепные процессы окисления, способствуя общему оздоровлению и омоложению организма [8]. Антиоксиданты - это вещества, способные в малых дозах регулировать обменные процессы в организме, прерывать развитие свободнорадикальных паталогий, служить профилактическими средствами для развития многих опасных заболеваний. Таким образом, антиоксиданты, подавляя свободнорадикальное окисление, регулируют степень влияния окисления на большинство метаболических процессов. Конечным итогом действия АО является создание оптимальных условий для метаболизма и обеспечение нормального роста клеток и тканей.
Интерес к исследованию соединений, способных предотвращать процессы свободнорадикального окисления в клетках, возник уже много десятков лет назад. В результате плодотворного сотрудничества биофизиков, химиков, физиологов и медиков на сегодняшний день имеется огромный массив информации об АО, их функциях в живом организме, степени и механизмах воздействия, значительно расширен круг соединений подобного рода. Вот почему препараты с ярко выраженными антиоксидантными свойствами широко используются в настоящее время в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности.
Среди множества известных антиоксидантов важное место занимают соединения фенольного типа. Фенольными антиоксидантами принято называть любые соединения вида Аг(ОН)п в которых одна или несколько гидроксильных групп соединены с ароматическим ядром (Аг), при этом молекулы могут содержать несколько фрагментов Аг(ОН)п [9, 3]. Фенольные антиоксиданты (АгОН) эффективно взаимодействуют с гидроперекисными радикалами жирных кислот и ненасыщенных липидов в реакции (1.1): ArOH+RO 2 ArOT+ROOH (1.1)
По существу в данной реакции не наблюдается исчезновения свободной валентности, а имеет место только замена гидроперекисного радикала RO на феноксильный ArO , однако при этом достигается эффект ингибирования свободнорадикального окисления, обусловленный большей стабильностью ArO", который практически не участвует в реакциях продолжения цепей окисления [2].
Высокая стабильность радикалов, образуемых молекулами фенольных антиоксидантов, обусловлена комплексом термодинамических и кинетических факторов. Термодинамическая устойчивость подразумевает низкую энергию образования фенольных радикалов и связана с делокализацией спиновой (электронной) плотности неспаренного электрона. При этом, чем больше степень делокализации, тем стабильнее радикал и меньше энергия его образования.
Главным действующим началом, обеспечивающим фенольным антиоксидантам способность тормозить радикальные процессы окисления, является гидроксильная группа, присоединённая к ароматическому ядру. Благодаря наличию в структуре ароматического кольца обобщённой системы л--электронов происходит смещение отрицательного заряда на кислород, результатом чего становится достаточно лёгкий отрыв атома водорода от гидроксила с образованием разных изомерных форм фенокси-радикала. Антиоксидантные свойства фенольных соединений существенно зависят от количества ОН-групп, их положения и степени экранирования [10, 11], а также, как в случае токоферолов и убихинонов, от строения углеводородного «хвоста», обеспечивающего мобильность и ориентацию молекул в структурированных субстратах (липосомы, микросомы, митохондрии): активность токоферолов в этих условиях на 1-2 порядка выше по сравнению с окислением в жидкой фазе, что связано с ориентацией ОН-группы в сторону гидрофильной среды [12].
В настоящее время выделено несколько тысяч фенольных соединений, среди которых выраженным антиоксидантным эффектом обладают витамины Е и К, убихиноны, триптофан и фенилаланин, а также большинство растительных (флавоноиды, фенокарбоксильные кислоты) и животных пигментов [9, 13]. В растениях фенольные антиоксиданты являются обязательным компонентом и присутствуют в значительных количествах (1-2 % биомассы). Как правило, синтез ароматического кольца возможен только у высших растений и микроорганизмов, в то время как животные преимущественно только преобразовывают различные ароматические соединения, за исключением синтеза убихинона и эстрогенов (по этой причине женщины любят цветы и живут дольше мужчин). Поэтому многие из фенольных антиоксидантов входят в группу так называемых «пищевых антиоксидантов», то есть соединений, потребность организма в которых удовлетворяется поступлением с пищей. Недостаток в питании жирорастворимых витаминов Е и К приводит к развитию свободнорадикальной патологии с характерными клиническими проявлениями [9, 14, 15].
Благодаря способности легко отдавать и захватывать электроны фенольные антиоксиданты могут представлять собой восстановители. Так, способность убихинона окисляться молекулярным кислородом с образованием 0J, делает его эффективным прооксидантом в митохондриях [16]. В экспериментах in vitro было показано, что а-токоферол восстанавливает ионы металлов переменной валентности и также выступает в качестве прооксиданта - в частности, при индуцированном ионами железа или меди окислении липосом [17, 18], окислении липопротеинов низкой плотности из сыворотки крови человека в присутствии ионов меди [19, 18] или в отсутствие аскорбата и убихинона. Однако in vivo прооксидантный эффект токоферола может быть незначителен, так как он преимущественно взаимодействует со свободными ионами, которых в организме мало.
Процесс ЭВ Ог, осложненный наличием последующей химической реакции взаимодействия с АО в условиях нестационарной диффузии
В предыдущем случае были взяты за основу условия стационарной диффузии и даны объяснения изменения предельного тока ЭВ 02 при наличии последующих химических реакций взаимодействия антиоксидантов с АФК на качественном уровне. В условиях вольтамперометрии чаще всего реализуются условия нестационарной диффузии. Поэтому для получения количественных характеристик влияния антиоксидантов на процесс ЭВ Ог по механизму ЕС была поставлена граничная задача квазиобратимого электродного процесса ЭВ 02 в присутствии индивидуальных антиоксидантов в условиях линейной полубесконечной диффузии. За основу была взята следующая схема электродного процесса: 0-+Й 0;- + R-OH 5 H&+R = 0 (2.22) В работе [150] было показано, что значение константы скорости обратной реакции образования супероксиданиона радикала - kQ достаточно мало по сравнению с константой скорости прямой реакции. Поэтому при дальнейшей постановке задачи данной величиной можно пренебречь. В общем виде данную схему электродного процесса можно представить следующим образом: Ох+пё s- Red+C— - А (2.23) При этом принимаем следующие допущения: - Антиоксиданты реагируют с активными кислородными радикалами на поверхности электрода преимущественно в прямом направлении. Реакция взаимодействия антиоксидантов с молекулярным кислородом, как на поверхности электрода, так и в глубине раствора не учитывалась. - Концентрация антиоксиданта была достаточно большой, поэтому ее изменениями в ходе электродного процесса можно пренебречь. - Влияние рН раствора нивелировалось использованием буферной системы в качестве фонового электролита.
Данная задача была решена, используя численный метод конечных разностей. При этом использовалась неявная разностная схема (5-й точечный шаблон), метод прогонки с самосогласованием на каждом временном шаге. Язык программирования - Fortran 90 .
В результате решения поставленной граничной задачи получены теоретические вольтамперограммы процесса ЭВ Ог в присутствии достаточно известного из литературных данных антиоксиданта -аскорбиновой кислоты для разных значений скоростей развертки потенциала: 0.02 В/с, 0.08 В/с и 0.29 В/с.
Полученные теоретические вольтамперограммы сравнивались с экспериментальными. На рис. 2.5, 2.6, 2.7 представлены полученные вольтамперограммы при разных скоростях развертки потенциала. Как видно из рисунков, расхождение между результатами незначительные, особенно в области малых скоростей развертки потенциала, которые являются рабочими для методики определения суммарного содержания антиоксидантов, используя в качестве модельной системы процесс ЭВ Ог.
Таким образом, коэффициент детерминации оценивается исходя из отношения суммы квадратов отклонений теоретической и экспериментальной кривых к сумме квадратов отклонений теоретической кривой и среднего значения всех точек на экспериментальной кривой. Результаты расчетов коэффициента детерминации (теоретической и экспериментальной моделей процесса) для разных скоростей развертки потенциала представлены в таблице 2.1. Стремление коэффициента детерминации к 1 подтверждает факт, что полученная методом численного моделирования модель адекватно описывает процесс и заложенный в основу механизм, особенно для малых скоростей развертки потенциала.
Также для подтверждения адекватности полученной модели в узловых точках вблизи теоретического и экспериментального максимума на кривой ЭВ Ог был рассчитан критерий Фишера: S2 вос Если соблюдается неравенство: Fp FT, то модель считается адекватной. Fp - рассчитанное значение критерия Фишера, FT — табличное значение критерия Фишера с заданными степенями свободы. Дисперсия воспроизводимости рассчитывалась для экспериментальных вольтамперограмм процесса ЭВ ( в присутствии антиоксиданта в одинаковых условиях эксперимента (параллельные определения).
Из полученных данных видно, что наиболее адекватно теоретическая модель описывает экспериментальную при малых скоростях развертки потенциала. Это косвенно подтверждает заложенный в основу механизм протекания процесса с наличием последующей химической реакции взаимодействия АО с кислородными радикалами. Данные скорости развертки потенциала являются рабочими и для аналитического сигнала определения суммарного содержания антиоксидантов в объектах. Наличие отклонений математической модели от экспериментальных значений тока ЭВ ( в присутствии АО при больших скоростях развертки потенциала можно объяснить большой емкостной составляющей тока и ограниченностью диффузионного процесса.
Исследование электрохимических свойств веществ
Методика получения вольтамперных зависимостей не отличалась от принятой в постоянно-токовой вольтамперометрии. Раствор фонового электролита, объемом 10 см, помещали в электрохимическую ячейку, которую ставили на магнитную мешалку и перемешивали раствор в течение 2ч-3 мин со скоростью 800-г900 оборотов/мин. Затем закрывали ячейку крышкой, вставляли рабочий и вспомогательный электроды, электрод сравнения и газовую трубочку для подачи азота. Производили продувание раствора азотом, до полного удаления кислорода. Давали 20 сек. для успокоения раствора, далее снимали вольтамперограмму тока исследуемого вещества в постоянно-токовом дифференциальном режиме на полярографе ПУ-1 или вольтамперометрическом анализаторе ТА-2. Диапазон потенциалов варьировался от 0 до -1.2В для РПЭ, от + 2 до -2 В для СУЭ, скорость развертки потенциала W=40 мВ/с. Далее исследуемый раствор снова перемешивали в течение 20 сек., 20 сек. проводили его успокоение и повторяли съемку вольтамперограммы тока. Всю операцию повторяли не менее 3 раз. Для уменьшения-ошибки эксперимента строго выдерживалось время и скорость перемешивания и успокоения раствора. После этого делали добавку исследуемого раствора и проводили заново, описанную выше операцию. По данным анализа строили графики зависимости: I = f(C).
В электрохимическую ячейку помещали 10 см3 раствора фонового электролита. В качестве фонового электролита для неводных сред использовали 0.1 М NaClCU растворенный в диметилформамиде или ацетонитриле. Для работы в неводных средах собирали трехэлектродную ячейку, состоящую из рабочего РПЭ, ХСЭ используемого в качестве электрода сравнения и вспомогательного электрода. Электроды опускали в раствор фонового электролита и подключали к полярографу ПУ-1 или анализатору ТА-2. Использовался постоянно-токовый режим катодной вольтамперометрии, скорость развертки потенциала составляла W = 40 мВ/с, рабочий диапазон потенциалов от 0 до -1В. Перемешивали раствор с помощью магнитной мешалки или вибрации электродов 20 сек., затем 10 сек. - успокоение раствора. Далее снимали первую волну катодного восстановления кислорода, растворенного в фоновом растворителе, в указанной области потенциалов. Повторяли съемку вольтамперограммы не менее пяти раз. Делали добавки приготовленного раствора испытуемого соединения, каждый раз снимая вольтамперограммы первой волны катодного восстановления кислорода. По полученным результатам строили график зависимости относительного тока электровосстановления кислорода (—) от концентрации вещества в растворе (С).
Принципы, положенные в основу теории планирования эксперимента, направлены на повышение эффективности экспериментирования, т.е. на получение максимума информации при минимуме опытов [155]. Экспериментальные исследования многообразны, но в большинстве своем они сводятся к трем математическим задачам: 1) статистическая обработка результатов химического эксперимента, отбор значимых факторов (дисперсионный, регрессионный анализы). 2) постороение математической модели процесса и определение ее параметров (факторный эксперимент). 3) оптимизация процесса, т.е. определение условий, обеспечивающих оптимальный режим какого-либо процесса или оптимальные свойства какого-либо продукта (методы оптимизации: метод крутого восхождения, симплексное планирование). При использовании методов планирования и организации эксперимента эти задачи реализуются при минимуме опытов и с наибольшей производительностью.
Отношение токов кислорода в отсутствии и присутствии антиоксидантов зависит, от ряда факторов, основными из которых являются время активного взаимодействия антиоксиданта с кислородными формами, а также его концентрация. Поэтому, для оценки наиболее активной концентрации и времени активного действия АО для данного процесса использовали методы планирования эксперимента. Все расчеты приведены для природного антиоксиданта из группы флавоноидов — кверцетина. Оценку строгой зависимости между откликом и влияющими факторами осуществляют с помощью регрессионного анализа. При этом исследуемая система должна удовлетворять следующим четырем допущениям: 1) только параметр (У) является статистически значимой величиной, т.е. Sy » Sx. 2) все опыты равноточны. Они дают достаточно одинаковую воспроизводимость измерения Y. Дисперсии в каждой серии опытов должны быть однородны. 3) погрешность измерения Y имеет случайный характер и не имеет систематической составляющей. 4) погрешность измерения Y не зависит от опыта и имеет нормальное распределение.
Особенности процесса электровосстановления кислорода в присутствии индивидуальных антиоксидантов фенольной природы
Свободные радикалы (частицы с неспаренным электроном) играют огромную роль в регуляции нормального метаболизма в организме человека и животных. При воздействии неблагоприятных факторов окружающей среды (радиация, загрязненная атмосфера, химические соединения, попадающие в организм с пищей, старение организма и т.п.) число свободных радикалов лавинообразно увеличивается. Нарушается нормальный метаболизм, что ведет к развитию ряда заболеваний: оксидативный стресс, сердечно-сосудистые, онкологические заболевания и т.д. [2, 8].
Обычно здоровый организм сам справляется со свободными радикалами, возникающими в процессе естественного метаболизма клеток, однако неблагоприятные внешние факторы приводят к ситуации, когда защитные силы организма уже не в состоянии нейтрализовать избыток агрессивных частиц, причем риск многократно повышается при физических и эмоциональных нагрузках.
Поэтому терапия с включением АО находит все большее применение при лечении заболеваний, связанных с развитием радикально-цепных процессов окисления в клетках организма. Одновременно расширяется выпуск различных антиоксидантных препаратов, включающих разнообразные компоненты природного и синтетического происхождения. Применение природных АО для лечения и профилактики свободно-радикальных патологий показало ряд преимуществ. Для большинства из них характерно отсутствие побочных эффектов, они обладают низкой токсичностью даже при длительном использовании, лекарственные формы на их основе являются доступными для пациентов. Поэтому в последние годы повышается интерес к методам выделения БАВ и оценки их активности в природных объектах. На их основе создаются различные пищевые БАД, лекарственные препараты, призванные стимулировать обменные процессы в организме [6, 12].
Флавоноиды представляют собой самую многочисленную группу природных полифенольных соединений. Структурная основа большинства флавоноидов соответствует структуре хроманового ядра токоферолов, однако, в отличие от последних, вместо боковой изопреноидной цепи они имеют подвижное ароматическое кольцо, наличие ОН-заместителей в котором во многом определяет антиоксидантные свойства соединений (рис. 4.2). Флавоноиды являются очень мощными антиоксидантами; способными «ставить ловушки» для наиболее агрессивных свободных радикалов, что позволяет использовать их для лечения и профилактики рака и сердечнососудистых заболеваний. В этой связи изучение активности флавоноидов, широко используемых в пищевой, фармацевтической и косметической промышленности, представляется весьма актуальным. В данном параграфе рассмотрено влияние некоторых флавоноидов (кверцетин, катехин, рутин и дигидрокверцетин) на процесс ЭВ 02 (рис. 4.3.). Для оценки влияния исследуемых флавоноидов на процесс ЭВ Ог рассмотрены зависимости предельного тока ЭВ Ог от времени активного действия и концентрации флавоноидов в объеме раствора. При добавлении исследуемых образцов наблюдалось уменьшение величины катодного тока и смещение потенциала волны ЭВ ( в положительную область (рис. 4.4.). По результатам полученных вольтамперограмм строились зависимости относительного уменьшения тока ЭВ 02 от времени протекания процесса в присутствии исследуемых флавоноидов (рис. 4.5.). Ингибирование катодных волн кислорода и сдвиг потенциала волны ЭВ Ог в положительную область позволяет предположить, что в данном случае вероятный ЕС механизм электродного процесса ЭВ Ог в присутствии АО включает последующую химическую реакцию взаимодействия АО с активными кислородными радикалами. Таким образом, можно говорить о том, что исследуемые вещества, находясь в растворе, влияют на процесс ЭВ Ог, проявляя антиоксидантные свойства.
Антиоксидантная активность объектов определялась по относительному уменьшению тока ЭВ Ог, используя кинетический критерий антиоксидантной активности — kmmem, рассчитанный по выражению (4.28). Результаты оптимальных диапазонов концентраций и времени активного действия исследуемых флавоноидов представлены в табл. 4.8. Как видно из таблицы эффективные концентрации флавоноидов различны, как и время их активного действия. Наибольшую активность по отношению к процессу ЭВ Ог из рассмотренных флавоноидов проявил кверцетин. Таким образом, исследованы антиоксидантные свойства по отношению к процессу ЭВ 02 ряда флавоноидов, широко используемых в пищевой и фармацевтической промышленности. Наибольшую активность из исследуемых веществ проявил кверцетин [156]. В связи с вышесказанным достаточно актуальной проблемой является синтез уже известных кумаринов, а также синтез кумаринов с новыми функциональными группами для фармацевтических целей.
