Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Модифицированные электроды 12
1.1. Способы модификации электродов 12
1.2. Модифицированные электроды для определения пероксида водорода .. 14
Глава 2. Антиоксидантная активность 22
2.1. Антиоксиданты, входящие в состав крови человека 23
2.1. Методы определения антиоксидантной активности 27
Глава 3. Биосенсоры 34
3.1. Основные определения 35
3.2. Классификация биосенсоров 37
Глава 4. Иммобилизация ферментов при конструировании сенсоров
4.1. Использование ионообменных полиэлектролитов для иммобилизации
фермента 51
4.2. Использование сред с высоким содержанием органического растворителя 53
Глава 5. Экспериментальная часть 56
5.1. Материалы 56
5.2. Оборудование 59
5.3. Методы 61
Результаты и обсуждение 73
Глава 6. Безреагентный биосенсор на основе глюкозооксидазы и медиатора, иммобилизованных в мембрану полиэлектролита 73
6.1. Выбор медиатора
6.2. Гомогенная кинетика взаимодействия азинов с восстановленным активным центром глюкозооксидази 75
6.3. Иммобилизация азинов в мембраны нафиона методом «вымачивания» 80
6.4. Формирование мембран нафиона с иммобилизованным азином путем совместного нанесения из раствора 87
6.5. Совместная иммобилизация азинов и глюкозооксидазы для разработки биосенсоров второго поколения 93
6.6. Выбор потенциала и медиатора для определения глюкозы 93
6.7. Каталитические свойства ферментного электрода 96
6.8. Определение глюкозы в проточно-инжекционном режиме биосенсором на основе фенотиазина 97
6.9. Стабильность глюкозного биосенсора второго поколения на основе фенотиазина 100
6.10. Определение глюкозы в цельной крови 100
Глава 7. Конструирование электроаналитической системы для определения глюкозы в цельной крови 102
7.1. Оптимизация концентрации ПАВ для гидрофилизации верхнего слоя пластика капилляра 103
7.2. Электрохимические измерения для биосенсора в системе с капилляром 104
7.3. Определение глюкозы биосенсорами на основе фенотиазина в системе с капилляром 105
Глава 8. Оценка антиоксидантной активности пищевых продуктов по кинетическим параметрам реакции разложения в них пероксида водорода 107
8.1. Оценка антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода в растворе антиоксидантов 107
8.2. Оценка антиоксидантной активности в экстрактах 1 10
8.4. Выражение антиоксидантной активности через количество эквивалентов тролокса 112
8.5. Определение антиоксидантной активности методом, основанным на спектрофотометрической регистрации максимума спектра поглощения тиобарбитурат-активных продуктов ПОЛ 113
8.6. Антиоксидантная активность соков 116
Глава 9. Оценка антиоксидантной активности сыворотки крови 117
9.1. Адаптация условий проведения измерений 118
9.2. Аналитические характеристики сенсора на пероксид водорода 119
9.3. Оценка антиоксидантной активности сыворотки крови спортсменов до и после нагрузки по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода 121
Глава 10. Определение антиоксидантной активности в коллоидных растворах диоксида церия 125
Выводы 136
Список литературы
- Модифицированные электроды для определения пероксида водорода
- Классификация биосенсоров
- Использование сред с высоким содержанием органического растворителя
- Гомогенная кинетика взаимодействия азинов с восстановленным активным центром глюкозооксидази
Введение к работе
Актуальность темы. Электрохимические методы как нельзя лучше удовлетворяют требованиям современного анализа, таким как чувствительность, избирательность, экспрессность, простота и невысокая стоимость. По сравнению с другими аналитическими методами они просты и удобны в применении, не требуют пробоподготовки, а также позволяют осуществлять непрерывный мониторинг анализируемого вещества. Эти преимущества обеспечивают широкое применение электрохимических сенсоров в клинической диагностике, пищевой промышленности и контроле состояния окружающей среды.
Сахарный диабет является тяжелым заболеванием, которым страдает не менее 10% населения Земли. Известно, что самостоятельное определение концентрации глюкозы пациентом является ключевым аспектом в контроле диабета. За год проводится более 6 миллиардов определений глюкозы в крови человека: фактически, определение глюкозы – это самый распространенный и часто используемый химический анализ.
В большинстве коммерческих тест-систем используются электрохимические биосенсоры на основе фермента (глюкозооксидазы или глюкозодегидрогеназы) и медиаторов (как правило, металлорганических соединений или комплексов переходных металлов). Медиатор – это низкомолекулярное редокс-активное соединение, переносящее электроны от активного центра фермента к поверхности индикаторного электрода.
Недостатком медиаторных биосенсоров можно считать то, что их нельзя использовать для многоразового анализа или для постоянного мониторинга концентрации аналита. Для этих целей подходят «безреагентные» биосенсоры. Для создания безреагентного медиаторного биосенсора необходимо совместно иммобилизовать на поверхности электрода фермент и медиатор. При этом, чтобы медиатор не утратил свою функцию «электронного шаттла», после иммобилизации в мембране он должен оставаться диффузионно-подвижным.
Большое внимание в медицине уделяется проблеме окислительного стресса, являющегося одним из главных факторов риска в развитии сердечно-сосудистых и неврологических осложнений некоторых заболеваний, таких как диабет и почечная недостаточность. Этот факт вызывает огромный интерес к антиоксидантам – веществам, способным снизить скорость окислительных реакций.
Современные методы оценки антиоксидантной активности можно разделить на две группы. Первая группа методов основана на определении окисляемого продукта, например, продукта окисления липидов. Однако такие методы требуют больших временных затрат и использования тканей животных, что негативно сказывается на воспроизводимости. Поэтому большой интерес вызывают методы, основанные на генерации радикалов в образце или добавлении окислителя и изучении их дальнейшего разложения. Но время жизни свободных радикалов пренебрежимо мало, а подавляющее большинство используемых окислителей не встречается в живых организмах, что снижает достоверность полученных таким образом данных. Таким образом, в качестве оксиданта необходимо использовать окислитель, который присутствует в живых организмах, такой, например, как пероксид водорода.
Цель работы состояла в разработке амперометрических биосенсоров на основе фермента (глюкозооксидазы) и медиаторов (азиновых красителей) для определения глюкозы в цельной крови, а также в разработке кинетического метода оценки антиоксидантной активности в биологических жидкостях и в водных растворах физиологически-активных веществ и наночастиц.
Достижение поставленной цели предусматривало решение следующих задач:
выбор оптимального медиатора для фермента глюкозооксидазы по кинетическим параметрам взаимодействия с активным центром фермента, электрохимической активности и способности удерживаться в мембране полиэлектролита;
осуществление совместной иммобилизации глюкозооксидазы и медиатора в мембрану перфторсульфонированного полимера на поверхности электрода;
интеграция полученного биосенсора с тонкослойной ячейкой для создания системы электроанализа малых (1-1.5 мл) объемов образца;
разработка способа оценки антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода с использованием электрохимического сенсора на основе берлинской лазури для контроля концентрации Н2О2;
оценка антиоксидантной активности в реальных объектах: коллоидных растворах наночастиц диоксида церия и сыворотке крови спортсменов.
Научная новизна. Разработан новый способ совместной иммобилизации фермента и медиатора из водно-органических сред с высоким содержанием спиртов в мембрану на поверхности электрода. Достигнута совместная иммобилизация фермента и медиаторов в мембрану полиэлектролита без ковалентного сшивания. Найден новый медиатор для фермента глюкозооксидазы – фенотиазин, способный эффективно осуществлять транспорт электронов между активным центром фермента и электродом. Показано сохранение диффузионной подвижности медиатора после иммобилизации в ферментсодержащую мембрану.
Разработан амперометрический биосенсор на основе глюкозооксидазы и фенотиазина, иммобилизованных в мембрану перфторсульфонированного полимера без образования ковалентной связи. Биосенсор, интегрированный в тонкослойную ячейку для анализа малых (1-1.5 мкл) объемов анализируемого образца, применим для анализа неразбавленной крови.
Предложен новый способ оценки антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода. Возможность применения нового способа оценки антиоксидантной активности в водных растворах антиоксидантов доказана сравнением с классическим методом, основанным на регистрации максимума спектра поглощения тиобарбитурат-активных продуктов перекисного окисления липидов, на примере биологических добавок. Впервые оценена антиоксидантная активность наночастиц СеО2. Показано, что антиоксидантная активность наночастиц зависит от условий их синтеза. Показано, что антиоксидантная активность сыворотки крови спортсменов значимо меняется в процессе физической нагрузки, что открывает перспективы применения способа для оценки состояния гипоксии в клинической диагностике.
Практическая значимость. Разработан безреагентный медиаторный биосенсор на глюкозу, обладающий следующими аналитическими характеристиками в проточно-инжекционном режиме: диапазон определяемых концентраций глюкозы 0.5 – 20 мМ, коэффициент чувствительности (1.34±0.06) мАМ-1см-2. Биосенсор интегрирован в тонкослойную ячейку для минимизации объема пробы, полученная система применима для определения глюкозы в цельной крови. Разработанный способ оценки антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода применим для оценки антиоксидантной активности пищевых продуктов и сыворотки крови в целях клинической диагностики. Кинетический способ оценки антиоксидантной активности позволяет определять активность коллоидных растворов наночастиц, что невозможно сделать другими методами.
Положения, выносимые на защиту:
-
Новый способ совместной иммобилизации фермента и медиатора в мембрану без использования ковалентного связывания.
-
Фенотиазин – новый медиатор для фермента глюкозооксидазы.
-
Создание безреагентного медиаторного глюкозного биосенсора с диапазоном определяемых концентраций глюкозы 0.5 – 20 мМ и коэффициентом чувствительности (1.34±0.06) мАМ-1см-2 путём совместной иммобилизации глюкозооксидазы и медиатора на поверхности электрода.
-
Создание системы для анализа малых объемов (1-1.5 мкл) анализируемого образца путем интеграции биосенсора с тонкослойной ячейкой.
-
Новый способ оценки общей антиоксидантной активности по кинетическим параметрам реакции разложения пероксида водорода под действием антиоксидантов.
-
Возможность оценки антиоксидантной активности наночастиц способом, основанным на изучении реакции разложения Н2О2. Зависимость антиоксидантной активности наночастиц от условий их синтеза.
-
Способ оценки общего антиоксидантного статуса сыворотки крови на основе определения кинетических параметров реакции разложения пероксида водорода. Значимое возрастание антиоксидантной активности сыворотки крови спортсменов после физической нагрузки.
Апробация работы. Основные результаты диссертационной работы были опубликованы в 11 работах, в том числе в 2 статьях в зарубежных реферируемых научных журналах и тезисах 9 докладов, представленных на всероссийских и международных научных конференциях.
Структура и объем работы. Диссертация состоит из введения, трех основных разделов (обзор литературы, экспериментальная часть, результаты и их обсуждение), выводов и списка литературы (166 ссылок). Работа изложена на 154 страницах машинописного текста, включая 63 рисунка и 17 таблиц.
Модифицированные электроды для определения пероксида водорода
Наиболее простым методом модификации поверхности является адсорбция модификатора. К преимуществам данного метода следует отнести то, что он не требует специальных реагентов для присоединения модификатора к электроду, к недостаткам - возможность десорбции модификатора.
При использовании ковалентного сшивания молекул модификатора с поверхностью электрода получают более стабильные системы. Чаще всего используют кислородсодержащие соединения с окси-, гидрокси- или карбокси-группами. Преимуществом ковалентного связывания является отсутствие утечки модификатора с поверхности электрода. В то же время, при образовании ковалентной связи существует вероятность повреждения электроактивных функциональных групп модификатора и, как следствие, потеря активности.
Изготовление электродов с полимерным покрытием - более простой способ закрепления модификатора, чем получение ковалентно связанных монослоев, т.к. полимерные пленки гораздо проще закрепить на поверхности электрода. Увеличение толщины пленки приводит к увеличению ее прочности, однако при слишком большой толщине пленки может наблюдаться неполное участие редокс-центров в переносе заряда и ухудшение электропроводности пленки. Электропроводящие пленки полимеров наносят на поверхность осаждением мономера из раствора и его последующей полимеризацией под действием тлеющего разряда, радиации, света или протекания электрического тока. Преимуществами электрохимической полимеризации являются получение электропроводящих пленок полимера, локализованных на поверхности электрода, и осуществление контроля над свойствами покрытия в процессе его получения. Для получения пленок электропроводящих полимеров чаще всего используют пиррол, анилин, тиофен, фенилен и их замещенные аналоги. Так, модификация поверхности электрода полианилином позволяет преодолеть порог чувствительности потенциометрического рН трансдьсера, составляющий 59 мВ/рН. Использование в качестве рН-трансдыосера пленок полианилина, допированного камфорсульфоновой кислотой, позволило получить потенциометрический датчик с коэффициентом чувствительности 90 мВ/рН в диапазоне шести единиц рН (от рН 3 до рН 9) [10]. Часто для получения необходимых характеристик электрода (проводимость, селективность) используют сополимеризацию различных мономеров.
В качестве модификаторов также применяют неорганические вещества: цеолиты, глины, оксиды металлов, силикаты и др. При использовании глин и цеолитов появляется возможность избирательного концентрирования определяемых веществ на поверхности электрода в зависимости от сорбционных свойств модификатора и размера его пор. Но вследствие малой электропроводности таких материалов их иммобилизацию проводят за счет включения в пленку электропроводящего полимера или в состав угольной пасты самого электрода. Электроды, модифицированные оксидами переходных металлов, катализируют многие редокс-процессы вследствие переноса кислорода в оксидных пленках.
Включение модификатора в полимерную пленку позволяет решить сразу несколько задач: механическая изоляция поверхности электрода от воздействия электролитов; повышение селективности за счет дискриминации веществ по заряду, размеру, полярности и т.д.; удерживание модификатора на поверхности электрода; механическая защита от повреждений. Полимерные пленки используют как матрицу для инкапсулирования модификатора или как защитную (и часто избирательно проницаемую) пленку на поверхности модифицированного электрода.
Определение пероксида водорода является важной аналитической задачей для клинической диагностики, контроля состояния окружающей среды и в различных областях промышленности. Около 50% мирового производства пероксида водорода используется для изготовления целлюлозы и отбеливания бумаги [11]. В пищевой промышленности растворы пероксида водорода применяются для дезинфекции поверхностей технологического оборудования и упаковки (технология «Tetra Рак»), непосредственно соприкасающихся с продукцией [12]. Возникает необходимость определения пероксида водорода в грунтовых водах и атмосферных осадках, куда он попадает в результате промышленных выбросов [13,14].
Благодаря высокой растворимости и стабильности, содержание пероксида водорода может быть определено в конденсате выдыхаемого воздуха (КВВ) [15]. У здоровых людей содержание пероксида водорода в КВВ не зависит от возраста, пола и легочной функции [16]. В то же время было показано, что концентрация пероксида водорода повышена в КВВ у больных бронхиальной астмой [16-18]. Определение концентрации пероксида водорода в КВВ можно использовать для выявления субъектов с более высоким риском развития болезней легких, связанных с курением [19,20].
Таким образом, пероксид водорода является потенциальным маркером воспаления и оксидативного стресса в легких. Анализ КВВ является ценным неинвазивным методом диагностики различных легочных заболеваний и степени их тяжести, а также может быть использован для определения эффективности лечения.
Показано, что пероксид водорода играет важную роль в иммунной системе. Повреждение тканей хвостового плавника рыбки Данио Рерио приводит к генерации пероксида водорода, который, как полагают, вызывает движение лейкоцитов к ране, активируя тем самым процесс заживления [21]. Блокирование способности продуцировать пероксид водорода подавляет процесс накопления лейкоцитов в месте повреждения. В работе [22] выдвинуто предположение, что в легких больных бронхиальной астмой повышенное содержание пероксида водорода (по сравнению со здоровыми людьми) также связано с высоким содержанием лейкоцитов.
Классификация биосенсоров
Методика основана на ингибировании образования радикальных катионов 2,2 -азинобис(3-этилбензтиазолин)-6-сульфоновой кислоты (ABTS) [68] и не требует использования субстрата. ABTS обладает высокой растворимостью в воде а также химической стабильностью и дает пик поглощения при 342 нм. Субстрат пероксидазы, окисляясь в присутствии пероксида водорода, образует метастабильный радикальный катион с характеристическим спектром поглощения и высоким поглопдением при 414 нм. В спектре присутствуют также вторичные пики поглощения при 645, 734 и 815 нм. Его использование основано на образовании ферримиоглобинового радикала, который затем реагирует с ABTS с образованием радикального катиона, как показали Райс-Эванс и Миллер [68]. Накопление ABTS + может быть остановлено в присутствии антиоксидантов. Сравнительная способность антиоксидантов разрушать ABTS + может быть определена спектрофотометрически по поглощению вблизи 734 нм, чтобы снизить интерференцию с другими поглотителями и мутностью образца.
Дифенилпикрилгидразин (DPPH) радикал Метод основан на контроле концентрации DPPH-радикала, который используют в качестве оксиданта. DPPH-радикал поглощает при 517 нм и во вторичной системе, в отсутствие субстрата, антиоксидантная активность может быть определена по уменьшению этого поглощения при уменьшении концентрации DPPH-радикала за счет его разрушения антиоксидантами. Результаты выражаются в виде ЕС5о, т.е. количества антиоксиданта, необходимого, чтобы снизить начальную концентрацию радикалов в 2 раза. Также рассчитывалось время, необходимое, чтобы достичь устойчивого состояния с концентрацией ЕС5о (Тксзо)- Был определен новый параметр, включающий оба вышеперечисленных, называемый антирадикалы-юй эффективностью [69].
Оба последних метода, основанные на кинетических параметрах реакций разрушения ABTS- и DPPH-радикалов, не используют субстрат. Их популярность объясняется простотой и экспрессностыо, но к данным, полученным этими методами, нужно относиться с осторожностью, вследствие отсутствия этих оксидантов в реальных системах и зависимости АОА от выбора оксиданта. 2.2.6. Метод FRAP
Метод FRAP (Ferric reducing antioxidant power) [70,71] основан на восстановлении антиоксидантами комплекса трехвалентного железа с трипиридилтриазином Fe(TPTZ)J+ в кислой среде. При этом образуется ярко окрашенный комплекс Fe(TPTZ)2+, об антиоксидантной активности судят по возрастанию пика при 593 нм. Результат выражается микроэквивалентах Fe"" или в долях активности стандартного антиоксиданта. Авторы заявляют, что метод прост и экспрессен.
Метод TRAP (Total radical- trapping antioxidant parameter), разработанный Вэйнером с коллегами [72], основан на определении поглощения кислорода в течение контрольной окислительной реакции, индуцируемой термическим разрушением 2,2 -азобис(2-амидинопропан)гидрохлорида (ААРН). Вэйнер с коллегами исследовал поглощение кислорода в термостатируемой ячейке с кислородным электродом во время окисления линолеата свободными радикалами. Главным недостатком этого метода было измерение конечной точки по кислородному электроду, который не был стабилен в течение требуемого периода времени (больше 2 часов на образец), поэтому метод был модифицирован [73] - для измерения конечной точки начали использовать хемилюминесценцию, что дает больше возможностей для автоматизации. Метод требует длительного времени измерений и имеет много других недостатков [74], но идея полезна для сравнения антиоксидаптных активностей.
Антиоксидантная активность может быть определена многими способами. При этом определение антиоксидантной активности отдельных компонентов сложной смеси является долгим и дорогостоящим процессом. Кроме того, данные, полученные таким путем не могут характеризовать общую антиоксидантную активность системы в целом, так как эффект системы антиоксидантов не является аддитивным (например, в такой системе возможен синергизм) [75]. В связи с этим интересно определение общей антиоксидантной активности системы.
При определении антиоксидантной активности ключевую роль играет выбор оксиданта. Большинство современных методик анализа использует в качестве оксиданта различные окислители. Но время жизни природных радикалов (таких, как супероксид-радикал и гидроксид-радикал) пренебрежимо мало, что не позволяет полностью проследить за кинетикой их разложения. Основным недостатком использования стабильных искусственных радикалов (ABTS-радикал и DPPH-радикал) и окислителей (СЬ, Вг2, Ь, комплексы трехвалентного железа, бихромат-анион) является то, что таких окислителей нет в человеческом организме, что негативно сказывается на корреляции полученных таким образом данных in vitro с АОА анализируемого вещества in vivo. Единственным достаточно сильным и стабильным природным окислителем является пероксид водорода. Ранее в нашей лаборатории был разработан сенсор на пероксид водорода на основе берлинской лазури - самого эффективного электрокатализатора восстановления пероксида водорода [7], с помощью которого возможно осуществлять постоянный мониторинг концентрации Н2Ог [46]. В данной работе предлагается использовать эти датчики для контроля реакции разложения пероксида водорода под действием антиоксидантов и разрабатывается новый способ оценки АОА по кинетическим параметрам данной реакции.
Использование сред с высоким содержанием органического растворителя
Одним из достоинств мембран на основе нафиона, применяемых при конструировании биосенсоров, является то, что благодаря наличию отрицательно-заряженных сульфогрупп в составе Нафиона, данные мембраны выступают эффективным барьером для анионов легко окисляемых соединений, оказывающих мешающее влияние на отклик биосенсора. С помощью мембран нафиона удалось добиться существенного уменьшения влияния кофеина [120], урата [121], аскорбата [122], а в последствии и парацетамола [90] на отклик глюкозных биосенсоров при физиологических концентрациях данных веществ.
Главным преимуществом нафиона перед остальными полимерами при конструировании ферментных электродов является его биосовместимость. С использованием Нафиона был создан имплантируемый глюкозный биосенсор, содержащий глюкозооксидазу в качестве биочувствительного элемента [123]. При конструировании биосенсора мембрана нафион наносилась поверх слоя фермента, адсорбированного на поверхности платинового электрода.
В целях сведения к минимуму числа операций при приготовлении глюкозных биосенсоров на основе ГОД, в дальнейших работах предпочтение исследователей было отдано механическому включению ГОД в полимерную мембрану [124,125]. В 1993 году в литературе появились данные о создании амперометрического глюкозного сенсора на основе платиновых электродов, содержащего иммобилизованные в мембране нафион ГОД и медиатор [126]. Образованные из таких смесей мембранные покрытия обладали малой воспроизводимостью отклика и низкой операционной стабильностью в связи с вымыванием частиц фермента в процессе анализа глюкозы. Большой интерес исследователей вызывает вопрос о влиянии соотношения содержаний компонентов мембран на характеристики покрытий на основе полиэлектролита.
Из литературы можно заключить, что полимерные мембраны на основе водонерастворимых полиэлектролитов, в частности нафиона, являются перспективным материалом для иммобилизации ферментов на поверхности электродов. Такие мембраны характеризуются отсутствием набухаемости в воде, высокой степенью адгезии к поверхности электродов, а также позволяют создавать биосовместимые датчики на их основе.
Максимальной воспроизводимости изготовления ферментных электродов можно достичь, если формировать фермент-содержащие пленки на основе уже готового полимера. Последний, очевидно водонерастворимый, способен формировать равномерные и стабильные пленки только из его истинных растворов. Отсюда следует необходимость экспонирования ферментов в органические растворители [127].
Высокие значения каталитической активности и субстратной специфичности ферментов определяются нативной конформацией белковой глобулы, на формирование которой большое влияние оказывает вода. Уменьшение активности фермента при внесении в органический растворитель связывают с нарушением водородных и гидрофобных связей в глобуле фермента. Для описания механизма денатурации фермента в органической среде наиболее часто применяют концепцию «гидратационной воды»: при взаимодейсттвии фермента с органическим растворителем происходит вытеснение из глобулы «гидратационной» воды и связывание молекул растворителя с гидрофобными областями белка [128]. Основываясь на данной гиппотезе, можно бы было предположить, что увеличение концентрации органического растворителя в водноорганической среде повлечет за собой дальнейшее уменьшение активности фермента.
Вопреки ожиданиям, график зависимости каталитической активности ферментов алкогольоксидазы и полифенолоксидазы от содержания органического растворителя (ацетонитрила и диметилсульфоксида) в водноорганической смеси имеет три разных участка [129]. На первом из них (0-20% органического растворителя) существенного изменения ферментативной активности не наблюдается. Затем, при увеличении содержания растворителя в системе (30-70%) активность фермента резко падает. На третьем участке (80-90% растворителя) наблюдается увеличение каталитической активности фермента.
Объяснение такого вида зависимости активности фермента от содержания органического растворителя в системе можно объяснить следующим образом. При низкой концентрации растворителя в смеси гидратационный слой вокруг белковой молекулы не нарушается и нет взаимодействия органического растворителя с ферментом. При среднем содержании органического растворителя в смеси (участок 2) происходит усиление взаимодействий растворителя с белковой глобулой, нарушающее нативную конформацию белка. При помещении фермента в среду с высоким содержанием органического растворителя образуется суспензия белка, состоящая из коллоидных частиц. При этом предполагается, что внешние денатурированные молекулы фермента в коллоидных частицах защищают внутренние от денатурации [129].
Благодаря сохранению высокой активности фермента в смесях с высоким содержанием органического растворителя иммобилизация упрощается до суспендирования фермента в растворитель со стабилизирующим мембранообразующим полимером или гелем с последующим нанесением на поверхность модифицированного электрода и высушиванием.
Преимущества новых подходов в области биосенсоров обычно демонстрируют на примере глюкозного датчика. Комбинация наиболее эффективного электрокатализатора (Берлинской лазури) и нового способа иммобилизации фермента (глюкозооксидазы) привели к созданию биосенсора на глюкозу с лучшими аналитическими характеристиками среди известных датчиков [130].
Гомогенная кинетика взаимодействия азинов с восстановленным активным центром глюкозооксидази
Для оценки общей антиоксидантной активности определяли кинетику разложения пероксида водорода в присутствии исследуемого образца. Измерения проводили в периодическом режиме тестирования (batch - режим). В ячейку объемом 15 мл, заполненную раствором исследуемого образца в фосфатном буфере 1(10 мг/мл) или неразбавленным образцом, при постоянном перемешивании помещали планарный печатный электрод, модифицированный берлинской лазурью и гексацианоферратом никеля, полученный по методике, описанной в разд. 5.3.12. Измерения проводили при рабочем потенциале 0 В. В течение 5-7 минут фиксировали значение базового тока до выхода его на постоянный уровень. Затем в образец инжектировали пероксид водорода до конечной концентрации 5-10М и следили за изменением его концентрации по падению отклика электрода. Кинетическую константу скорости реакции разложения пероксида водорода считали по уравнению: lnl = 1п10 - kt где I - ток в текущий момент времени, IQ — ток в начальный момент времени (сразу после добавления пероксида водорода в ячейку), к - константа скорости реакции, t - время. Константу рассчитывали для начального участка кинетической кривой (первые 150 с). АОА образца характеризовали значением константы скорости разложения Н202 в образце.
Индукция свободнорадикального окисления in vitro и определение продуктов перекисного окисления липидов (lipidperoxidation) по реакции с 2 тиобарбитуровой кислотой Замороженные образцы ткани коры головного мозга перед гомогенизированием взвешивали для определения точного объема среды. Ткань мозга измельчали гомогенизатором тефлон-стекло в течение 1 мин в стандартной среде гомогенизирования, содержащей 20 мМ tris-HCl (рН 7.4 при 4С) при соотношении ткань-среда, равном 10 (по массе). Для удаления неразрушенной ткани гомогенаты центрифугировали при 3600g в течение 10 мин при 4С. Гомогенат коры головного мозга готовился из образцов, предоставленных научно-исследовательской лабораторией адаптационной медицины (ФФМ).
Для активации свободнорадикального окисления гомогенат мозга инкубировали при 37 в среде 20 мМ tris-HCl (рН 7.4) в конечном объеме 2 мл (концентрация белка при инкубации не превышала 2.5 мг/мл). Реакцию проводили при постоянном перемешивании на магнитной мешалке Biosan MS 3000 при температуре 37С (термостат NESLab Ex 10 Thermo). После предварительной инкубации в течение 5 мин в каждой ячейке активировали процессы перекисного окисления липидов (ПОЛ) in vitro добавлением пероксида водорода (50 мкМ). Отбор проб производили непосредственно перед индукцией ПОЛ и через определенное время от начала процесса. Общее время реакции составляло 50 минут. Отбор проб (по 400 мкл) производился в пробирки, содержащие 1.5 мл воды и 2.5 мл ТБК-реагента - 0.4% тиобарбитуровой кислоты (ТБК), 0.54% ДСН, 10% ледяной уксусной кислоты, рН3.5.
Концентрацию продуктов ПОЛ оценивали по реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой (ТБК) по классическому методу [133] с учетом изменений, предложенных [134] в модификации, принятой в лаборатории адаптационной медицины ФФМ (рук. проф. Ю.В.Архипенко) [135]. Одним из основных взаимодействующих с ТБК продуктов ПОЛ является малоновый диальдегид (МДА) и его производные - вторичные продукты ПОЛ. Малоновый диальдегид образуется в результате расщепления гидроперекисей, возникающих при окислении жирных кислот с тремя и более двойными связями. При реакции с ТБК малоновый диальдегид образует окрашенный триметиновый комплекс, в котором на одну молекулу малонового диальдегида приходится 2 молекулы ТБК. Поскольку с ТБК реагирует в большей степени малоновый альдегид, то во многих работах указывают концентрацию МДА, рассчитывая ее с помощью коэффициента молярной экстинкции при длине волны 532 нм є5з2=1-56 105 ІУГ см"1 (С=ОД/є, нмоль/мг белка). Однако это не совсем верно, поскольку с ТБК реагируют различные продукты ПОЛ, поэтому в дальнейшем мы будем использовать термин ТБК-реагирующие продукты ПОЛ и активность выражать в прямых единицах оптической плотности/мг белка или в % от максимального накопления продуктов окисления в контрольном опыте, не содержащем добавок антиоксидантов.
Для выявления окрашивания пробы инкубировали в термостате ThermoBlock TDB-120 (Biosan) при температуре 100С в течение 60 минут. Затем отобранные пробы центрифугировали (Eppendorf 5702R при 18С в течение 15 минут со скоростью 800 об/мин) и регистрировали оптическую плотность при 532 нм, по максимуму спектра поглощения ТБК-активных продуктов в диапазоне 500-570 нм на спектрофотометре С intra 10е GBS с компьютерной регистрацией on line.
В качестве образцов, обладающих антиоксидантной активностью, использовались соки свеклы, клюквы, моркови, облепихи сублимационной сушки производства ИП Чекрыгин В.Н. «Виктория - Ч» и экстракт бадана ПКП «Провансаль», предоставленные научно-исследовательской лабораторией адаптационной медицины (ФФМ).
Для определения антиоксидантной активности в ячейку с индуцированным перекисным окислением липидов ткани мозга добавляли 200 мкл 10 мг/мл растворов соков сублимационной сушки в буферном растворе 20 мМ tris-HCl (рН 7.4). Параллельно ставился контрольный опыт: в ячейке с тем же составом среды индуцировали окисление в отсутствие антиоксидантов. Измерения проводились как описано выше, в п. 5.3.14 данного раздела. Об антиоксидантной активности судили по степени подавления накопления продуктов ПОЛ в присутствии образцов с антиоксидантной активностью.
