Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Антиоксиданты как объекты биоаналитической химии Общие замечания 15
1.1 Система антиоксидантной защиты организма человека и ее наиболее важные органические компоненты 19
1.2 Способы определения индивидуальных антиоксидантов в биологических объектах 24
1.3 Низкомолекулярные биоантиоксиданты 24
1.4 Высокомолекулярные антиоксиданты 44
1.5 Оценка антиоксидантной емкости биологических материалов как критерий состояния системы антиоксидантной защиты 47
Глава 2. Экспериментальная часть Приборы 53
2.1 Электроды 53
2.2 Растворы и реактивы 54
2.3 Объекты исследования 55
2.4 Методика и условия проведения эксперимента 58
Глава 3. Электрохимическое определение индивидуальных антиоксидантов в биологических жидкостях и лекарственных формах 63
3.1 Липоевая кислота 63
3.2 Катехоламины 66
3.3 Мексидол 74
3.4 Флавонолы 76
3.5. Глутатион 84
3.5.1. Электрохимическое определение глутатиона в крови человека 88
3.6. Сывороточный альбумин человека 89
3.7. Жирорастворимые антиоксиданты 94
3.7.1. Анодная вольтамперометрия 94
3.7.2. Кулонометрическое определение общего содержания свободных жирорастворимых антиоксидантов в сыворотке крови человека... 99
3.7.3. Вольтамперометрическое определение ретинола и а-токоферола по реакции с супероксид анион-радикалом 102
3.8. Кулонометрическое определение индивидуальных антиоксидантов в присутствии биологической матрицы 108
3.9. Вольтамперометрия растительных и синтетических фенольных антиоксидантов 114
Глава 4. Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости биологических объектов и возможности их применения в клинической практике
4.1. Кулонометрическая оценка антиоксидантного статуса 123
4.1.1. Интегральная антиоксидантная емкость крови при хронической
почечной недостаточности 124
4.1.1.1. Антиоксидантная емкость крови и тип мембраны диализатора ... 132
4.1.1.2. Взаимосвязь антиоксидантной емкости и общих клинико-биохимических показателей крови 133
4.1.1.3. Корреляция антиоксидантной емкости плазмы крови с содержанием металлов переменной валентности 135
4.1.2. Антиоксидантная емкость крови при врожденных патологиях сердца 136
4.1.3. Оценка состояния антиоксидантной защиты организма при наличии воспалительных процессов 142
4 2. Интегральная антиоксидантная емкость крови при детском церебральном параличе 146
Оценка интегральной антиоксидантной емкости плазмы крови по реакции с супероксид анион-радикалом по данным циклической вольтамперометрии 151
Вольтамперометрическое определение интегральной антиоксидантной емкости плазмы крови 156
Выводы 160
Литература 162
- Способы определения индивидуальных антиоксидантов в биологических объектах
- Мексидол
- Вольтамперометрическое определение ретинола и а-токоферола по реакции с супероксид анион-радикалом
- Антиоксидантная емкость крови и тип мембраны диализатора
Введение к работе
& Актуальность темы. Антиоксиданты (АО)- это важнейший объект исследования и анализа в науках о жизни. Причин такого внимания много. Одна из них состоит в профилактике старения организма и свободнорадикальных патологий, таких как, заболевания сердечнососудистой системы, неврологические, онкологические и другие заболевания. Биоантиоксиданты создают систему антиоксидантной защиты, в которой они снижают одновременно как интенсивность свободнорадикального окисления, так и тяжесть клинических симптомов. Поэтому очень важной становится проблема контроля состояния антиоксидантной системы организма человека, а, следовательно, и антиоксидантного статуса при патологиях различного типа с целью дальнейшей терапевтической коррекции. Клиническая диагностика антиоксидантного (оксидантного, так как эти две системы уравновешивают друг друга в рамках гомеостаза) статуса организма затруднена, поскольку в практической медицине отсутствуют лабораторно-биохимические методы, позволяющие дать интегральную оценку этого параметра. Существуют клинические методики, оценивающие отдельные лабораторные показатели (содержание продуктов перекисного окисления липидов (ПОЛ): малонового диальдегида, диеновых коньюгатов; активность супероксиддисмутазы (СОД) , и каталазы), которые не всегда пригодны для доказательной диагностики и терапевтической коррекции патологического процесса.
Однако следует отметить, что в последнее время все большее внимание уделяется способам определения суммарного содержания АО, которое можно рассматривать как общий показатель состояния объекта анализа в оценке его антиоксидантных свойств, отражающей антиоксидантный статус организма. Существующие способы контроля АО основаны на применении хроматографии, спектрофотометрии и хемилюминесцентных методов, ( являющихся весьма трудоемкими, длительными и дорогостоящими. При этом в ряде случаев определяются или индивидуальные АО, или только отдельные их группы. Полученные результаты исследований часто Ф несопоставимы, поскольку получены с использованием различных модельных систем.
Интенсивные исследования последних лет по созданию способов оценки антиоксидантных свойств биосубстратов свидетельствуют о том, что проблема разработки новых, экспрессных, универсальных и доступных методик для их определения остается актуальной.
Основное свойство АО заключается в их способности легко окисляться и принимать участие в радикальных и окислительно-восстановительных реакциях. Поэтому определенную перспективу представляют способы скрининга антиоксидантной емкости (АОЕ) биосубстратов с помощью f электрохимических методов.
Цель работы: показать возможность применения электрохимических методов для определения широкого круга индивидуальных биологически активных веществ различного строения, объединяемых понятием "антиоксидант", в лекарственных формах и биологических жидкостях и для оценки общего показателя "интегральная АОЕ", по которому можно сделать заключение о состоянии системы антиоксидантной защиты организма человека, а, следовательно, и об его антиоксидантном статусе.
В соответствии с целью исследования в работе поставлены следующие задачи: і • показать возможность применения гальваностатической кулонометрии и вольтамперометрии для определения индивидуальных АО различной природы в модельных растворах, лекарственных формах и биологических жидкостях человека;
• оценить возможность кулонометрического определения индивидуальных АО в присутствии биологической матрицы;
• разработать способы электрохимической оценки интегральной АОЕ ҐМ, биологических жидкостей, пригодные для клинических лабораторий;
• определить интегральную АОЕ крови и ее компонентов с применением электрогенерированных частиц брома и кислорода при различных типах патологичесих процессов в организме;
• выявить взаимосвязь между интегральной АОЕ и основными индивидуальными показателями антиоксидантного статуса: содержанием малонового диальдегида, липопротеинов низкой плотности (ЛПНП) и металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг и Ni) и активностью катал азы.
Научная новизна. Определены стехиометрические коэффициенты в реакциях ряда АО (восемь соединений) с электрогенерированными галогенами и на основе экспериментальных и литературных данных предложены возможные схемы реакций. Установлены потенциалы окисления АО на стационарных электродах из платины, графита и стеклоуглерода в условиях вольтамперометрии, обсуждены соответствующие схемы реакций. Найдены условия электрохимической генерации супероксид анион-радикала. Рассчитаны кинетические параметры его реакций с важнейшими АО. Установлено, что процесс следует ЕС-механизму.
В работе применен подход к оценке интегральной АОЕ биологических жидкостей с использованием электрогенерированных частиц брома и кислорода.
Выбор электрогенерированного брома и его соединений в качестве кулонометрического титранта обусловлен их способностью вступать в радикальные и окислительно-восстановительные реакции, а также в реакции электрофильного замещения и присоединения по кратным связям, что позволяет охватить широкий круг биологически активных соединений, проявляющих антиоксидантные свойства.
Электрохимическая генерация супероксид аинон-радикала позволяет смоделировать процессы, происходящие в живых системах.
Установлено, что компоненты плазмы крови окисляются в условиях вольтамперометрии, ток окисления является мерой АОЕ. Определен круг низкомолекулярных АО, которые вносят вклад в АОЕ в этом случае.
Проведено определение интегральной АОЕ крови и ее компонентов при различных типах патологий, прослежено ее изменение в ходе медикаментозной терапии.
Установлены корреляционные зависимости между величинами АОЕ, полученными кулонометрически и вольтамперометрически.
Выявлена взаимосвязь между величиной интегральной АОЕ и содержанием малонового диальдегида, ЛПНП и металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг) и активностью каталазы.
Практическая значимость. Разработаны способы кулонометрического и вольтамперометрического определения фармпрепаратов: липоевой кислоты, катехоламинов (адреналина и допамина), мексидола, рутина и кверцетина, витаминов А и Е, кальциферолов в модельных растворах и в их лекарственных формах с величинами Sr от 0,01 до 0,09; глутатиона и сывороточного альбумина в модельных растворах и в крови человека с величиной Sr от 0,01 до 0,09. Предложен способ определения суммарного содержания свободных жирорастворимых АО в сыворотке крови человека в пересчете на а-токоферол.
Разработан подход кулонометрического определения индивидуальных АО на фоне, содержащем компоненты биологического происхождения, в частности, сыворотки крови, позволяющий свести к минимуму мешающее влияние матрицы.
Обнаружено взаимное влияние природных полифенолов и синтетического пространственно-затрудненного фенола - ионола, то есть системы полифенол - ионол при различных соотношениях компонентов. При введении ионола наблюдается каталитический эффект. Установлены соотношения, при которых наблюдается максимальное увеличение волны окисления полифенолов, что связано с регенерацией молекулы полифенола.
Проведена оценка интегральной АОЕ крови и ее компонентов при различных типах патологий. На основе экспериментальных данных величина АОЕ предлагается для предварительного скрининга антиоксидантного статуса организма человека и как показатель качества лечения, в том числе и при оперативных вмешательствах, то есть может служить репером в ходе лечения пациентов с различными типами патологий.
Разработанные способы определения интегральной АОЕ характеризуются точностью, хорошей воспроизводимостью и экономичностью и могут быть рекомендованы к применению в клинических лабораториях для первичного скрининга антиоксидантного статуса организма человека и его последующей коррекции. На защиту выносятся:
1. Разработанные способы определения фармацевтических препаратов различной природы в модельных растворах и лекарственных формах методами гальваностатической кулонометрии с помощью электрогенерированных галогенов и вольтамперометрии.
2. Предложенные электрохимические способы определения глутатиона, сывороточного альбумина и жирорастворимых АО в биологических жидкостях.
3. Результаты исследования взаимного влияния природных полифенолов и синтетического пространственно-затрудненного фенола - ионола по данным вольтамперометрии.
4. Результаты определения интегральной АОЕ крови и ее компонентов с помощью электрогенерированного брома и супероксид-анион-радикала и обсуждение корреляции АОЕ с содержанием малонового диальдегида, ЛПНП и металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг) и активностью каталазы.
5. Величины интегральной АОЕ крови и ее компонентов при различных типах патологических процессов в организме, в том числе и генетического характера. Влияние антиоксидантной терапии на интегральную АОЕ. 6. Разработанный вольтамперометрический способ оценки интегральной АОЕ плазмы крови.
Апробация работы. Основные результаты работы представлены в устных докладах на VIII Научно-практической конференции молодых ученых КГМУ (Казань, 2003 г.), Объединенной международной научной конференции "Новая геометрия природы" (Казань, 2003 г.), IX Всероссийской научно-практической конференции "Молодые ученые в медицине" (Казань, 2004 г.), Всероссийской конференции "Аналитика России" (Москва, 2004 г.), Итоговой научной конференции Казанского государственного университета (Казань, 2005 г.) и стендовых докладах на III Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2003 г.), X Российском национальном конгрессе "Человек и лекарство" (Москва, 2003 г.), IV Всероссийской конференции молодых ученых "Современные проблемы теоретической и экспериментальной химии" (Саратов, 2003 г.), XVII Менделеевском съезде по общей и прикладной химии (Казань, 2003 г.), IV Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2004 г.), VI Всероссийской конференции по электрохимическим методам анализа с международным участием (Уфа, 2004 г.), V Научной конференции молодых ученых, аспирантов и студентов научно-образовательного центра Казанского государственного университета "Материалы и технологии XXI века" (Казань, 2005 г.).
По материалам диссертации опубликовано 16 статей и тезисы 15 докладов. Издано методическое пособие и получен патент РФ.
Диссертация выполнена при поддержке программы "Университеты + России" (проект 06.01.004 "Реакции электрохимически генерированных частиц кислорода и галогенов с антиоксидантами и их применение в анализе сложных биологических объектов" и проект 06.01.085 "Возникающие реагенты в электроаналитической химии антиоксидантов") и научно образовательной программы CRDF и Минобразнауки РФ (НОЦ КГУ "Материалы и технологии XXI века" REC-007 "Развитие методов оценки антиоксидантных свойств биологического материала, основанных на электрохимии" и "Вольтамперометрическая оценка интегральной антиоксидатной емкости плазмы крови"), гранта АН РТ № 07-7.3-176 "Создание научных основ определения интегральной антиоксидантной емкости биологических жидкостей и оценки антиокислительного статуса организма человека" и гранта Федерального агентства по образованию № А04-2.11-116 "Электрохимическая оценка антиоксидантных свойств соединений фенольного ряда".
Способы определения индивидуальных антиоксидантов в биологических объектах
Водорастворимые АО. Существуют различные источники поступления низкомолекулярных АО в ткани и биологические жидкости. Одни АО синтезируются клетками (глутатион, карнозин [13]), другие являются продуктами метаболизма (мочевая кислота [14], билирубин [15]), третьи поступают в организм с продуктами питания (аскорбиновая кислота [16], токоферолы, полифенолы). Разработано несколько электрохимических способов определения аскорбиновой кислоты (АК) в биологических жидкостях. Так, создан углеродный пастовый электрод, модифицированный комплексом (3-циклодекстрина с ферроценом, который позволяет проводить прямое амперометрическое определение АК на фоне аммиачного буферного раствора [17] в интервале концентраций 1х10 3-т-5х10"7М. Показано, что 1000 кратные количества глюкозы, фруктозы, сахарозы, Na+, К+, Са2+, Mg2+, Ag+, Hg+, NH4+, Fe2+, СГ, S042" и N03 , 500-кратные количества глицина, серина, тирозина, N02 и Cd2+ и 200-кратные количества S032" и РО43 не мешают определению. При изучении вольтамперометрического поведения АК на угольном пастовом электроде, модифицированном азамакроциклами установлено, что в присутствии комплексов цинка (II), образующихся in situ на поверхности электрода, перенапряжение окисления АК уменьшается на 200 мВ и возрастает ток каталитического окисления АК. Градуировочный график линеен в интервале 0,6-500 мкг/мл, предел обнаружения равен 0,1 мкг/мл при использовании дифференциальной импульсной вольтамперометрии [18].
Предложен способ амперометрического определения АК в сыворотке крови с использованием алюминиевого электрода, модифицированного пленкой гексацианоферрата никеля (II) методом простого погружения в раствор [19]. Анодный пик наблюдается при циклической или линейной развертке напряжения. При фиксированном потенциале и перемешивании раствора градуировочный график линеен в диапазоне концентраций АК 2х10"6-т-2х10"4М. Предел обнаружения составляет Описана новая методика определения АК, основанная на неравновесной биохимической реакции пероксидаза - оксидаза [20]. Реакция включает в себя окисление восстановленного никотинамидадениндинуклеотида в присутствии пероксидазы хрена молекулярным кислородом, содержание которого контролировали с помощью кислородного электрода. В присутствии АК происходит линейное изменение периода осцилляции. Определяемый интервал содержаний АК составил 0,175 - 17,5 мМ (г=0,9982). Разработан быстрый вольтамперометрический способ определения АК с применением метиленового синего в качестве медиатора на стеклоуглеродном электроде. Пик тока наблюдается при потенциале -0,04 В (отн. нас. хлоридсеребряного электрода). Градуировочный график линеен в диапазоне концентраций 1,2х10 6-т-1,12х10"3 М АК. Предел обнаружения составил 1хЮ"6М[21]. Известно, что мочевая кислота (МК) наряду с АК, глутатионом и а-токоферолом выполняет роль АО в некоторых свободнорадикальных биологических процессах [22-24].
Электрохимическое поведение МК исследовано методом циклической вольтамперометрии на стеклоуглеродном электроде, модифицированном пленкой полиглицина [25]. На основе ее электрохимической активности разработан селективный вольтамперометрический способ определения МК на предварительно аноднополяризованном стеклоуглеродном электроде, покрытом нафионом [26]. Мешающее влияние АК устраняется за счет выбора рН (при рН 5,0 МК существует в катионной, а АК в анионной форме) и повышенной селективности пленки нафиона к МК вследствие образования водородных связей. Предел обнаружения составляет 10 нМ. Возможен анализ мочи без предварительной пробоподготовки. Удовлетворительные результаты дает методика проточно-инжекционного амперометрического определения МК и АК в моче человека с детектированием при помощи золотого микроэлектрода, модифицированного электрохимически нанесенным палладием. Измерения проводят раздельно при потенциалах +0,75 В для МК и +0,55 В для АК. Градуировочные графики линейны в интервалах 0,34+1,68 и 0,44+2,64 мг/л соответственно [27]. Методом циклической вольтамперометрии изучено электрохимическое поведение МК и АК на вращающемся дисковом электроде и одновременное окисление их на поликристаллическом платиновом электроде [28]. Электрохимические методы активно используют и для определения другой группы водорастворимых АО, в структуре молекул которых присутствует атом серы в различных состояниях окисления. В организме человека серосодержащие аминокислоты участвуют в процессе обмена веществ, выполняют функцию АО, защищая SH- группы белков цитоплазмы от окисления. Восстановленные тиолы можно определять на модифицированных тирозиназой электродах из углеродной пасты. Иммобилизованная внутри электрода тирозиназа переводит катехин в о-хиноны, которые восстанавливаются на поверхности электрода до катехина при потенциале - 0,050 В (отн. нас. хлоридсеребряного электрода). Детектирование восстановленных тиолов основано на эффекте уменьшения скорости электронного обмена между тирозиназой и медиатором (катехином).
Принципы работы этого устройства подобны наблюдаемым для некоторых биосенсоров на основе конкуренции за субстрат. Поскольку сигнал тока регистрируется при низких потенциалах, мешающее влияние со стороны других способных к окислению соединений типа АК минимально. Благодаря так называемой амплификационной природе работы медиатора повышается чувствительность определения. В стационарных условиях при определении глутатиона градуировочный график линеен в интервалах 1-8 и 5-30 мкМ при концентрациях катехина, служащего субстратом, 10 и 20 мкМ соответственно. Описанная система пригодна для анализа образцов плазмы и цельной крови [29]. Для определения цистина в крови человека предложены методы дифференциальной импульсной и анодной инверсионной вольтампермоетрии. В растворе, содержащем 0,001 М СоС12, 0,1 М NH4OH и 0,1 М NH4CI, при рН 8,5 цистин в пробе крови дает двухступенчатую каталитическую волну восстановления водорода с выраженными пиками при потенциалах -1,22 и -1,46 В (отн. н.к.э.). Высота второй волны пропорциональна концентрации цистина [30]. На основании того, что обычные хиноновые индикаторы усиливают отклик электрода по отношению к тиольным соединениям, может быть создан простой сенсор для определения содержания восстановленных тиолов
Мексидол
В настоящее время убедительно доказана роль активных форм кислорода в патогенезе нарушений функций почек, онкологических, сердечно-сосудистых, неврологических и целого ряда других заболеваний. Это является причиной использования в клинике различных природных и синтетических ингибиторов свободнорадикального окисления в качестве антиоксидантной терапии. Примером таких АО являются производные 3-оксипиридина, нашедшие широкое применение в клинической практике, в частности, 3-окси-6-метил-2-этилпиридина сукцинат (мексидол). Мексидол обладает широким спектром биологической активности. Он эффективен при различных видах гипоксии, предложен для лечения острых нарушений мозгового кровообращения, вегетососудистой дистонии атеросклеротических нарушений функций мозга и при других состояниях, сопровождающихся гипоксией тканей [143]. Выявлено, что антиоксидантные свойства производных 3-оксипиридина обусловлены двумя факторами. Прежде всего, взаимодействием с ионами железа (II), направленным на уменьшение эффективной концентрации катализатора свободнорадикальной реакции за счет окисления ионов Fe (II) в Fe (III), либо за счет хелатирования ионов Fe (II).
Причем, активность мексидола в этом отношении приближается к способности известного хелатора ионов Fe (II) десферала элиминировать Fe (II) из системы. Во-вторых, способностью вступать в реакции с водорастворимыми радикалами и, возможно, с супероксид анион-радикалом. Таким образом, в основе антиоксидантного действия производных 3 оксипиридина лежит их способность ингибировать начальную стадию свободнорадикальной реакции перекисного окисления липидов, обусловленную образованием активных форм кислорода и появлением каталитически активных ионов железа [159]. Для вольтамперометрического определения мексидола были испытаны стационарные электроды из платины, графита и стеклоуглерода на фоне 0,1 М H2SO4 и 0,1 М КОН. На платиновом и графитовом электродах волна окисления не наблюдается. Установлено, что мексидол окисляется лишь на стеклоуглеродом электроде на фоне 0,1 М H2SO4. На вольтамперограмме мексидола на стеклоуглеродном электроде проявляется пик окисления при потенциале 0,5 В (рис. 5). Рис. 5. Вольтамперограммы окисления мексидола различной концентрации (М) на стеклоуглеродном электроде на фоне 0,1 М H2SO4: 1-0; 2- 4,8x10 , 3- 9,3x10 , 4- 1,8x10", скорость изменения потенциала 20 мВ/с. Предельный ток линейно возрастает с повышением концентрации мексидола в интервале концентраций: 4,8х10"3-т-1,8х10"2 М. При дальнейшем увеличении концентрации мексидола ток пика выходит на предельное значение. / Уравнение регрессии имеет следующий вид: Нижняя граница определяемых содержаний мексидола (по За критерию) составила 1,9х10"3М. Экспериментально установлено, что сукцинатный остаток не проявляет себя в условиях опыта. Результаты вольтамперометрического определения мексидола представлены в таблице 10. Правильность полученных результатов оценена по способу "введено" - "найдено".
Флавонолы являются важными природными антиоксидантами, поступающими в организм человека с продуктами питания. Одним из механизмов их антиоксидантного действия считается способность поглощать свободные радикалы. Полифенолы активно подавляют перекисное окисление липидов в биологических тканях и субклеточных структурах, таких как митохондрии, микросомы, липосомы, липопротеиды низкой плотности и мембраны Ш эритроцитов [160-162]. Как антиокислительные протекторы они обладают другим свойством, которое состоит в способности окисляться на электроде. Знание электрохимических свойств полифенолов позволяет прогнозировать их антиоксидантную активность. На вольтамперограммах рутина на платиновом электроде на фоне 0,1 М H2S04 проявляются две ступени окисления с четко выраженными пиками при потенциалах 0,6 и 1,1 В (рис. 6).
Вольтамперометрическое определение ретинола и а-токоферола по реакции с супероксид анион-радикалом
Как уже отмечалось выше, в последнее время возрос интерес к изучению антиоксидантов, важного класса биологически активных соединений, необходимых для поддержания так называемого антиоксидантного статуса организма человека. Основная их функция состоит в уменьшении концентрации АФК в клетках живых организмов. Вследствие формирования активных интермедиатов радикальной природы при восстановлении кислорода может возникнуть окислительный стресс в организме. Существуют различные источники образования свободных радикалов, связанные с окислением эндогенных субстратов (например, гемоглобина) и чужеродных веществ, с одноэлектронным восстановлением кислорода в дыхательной цепи митохондрий и т.д. АФК являются побочными продуктами важнейших метаболических реакций с участием молекулярного кислорода. Они взаимодействуют с нерадикальными соединениями и образуют новые свободные радикалы [7]. На стеклоуглеродном электроде на фоне 0,05 М (СгК М в диметилформамиде кислород восстанавливается с образованием супероксид анион-радикала. На циклической вольтамперограмме наблюдается обратимый пик восстановления при -0,9 В (рис. 17). Известно, что кислород воздуха восстанавливается в катодной области потенциалов ступенчато с образованием различных АФК: 104 На первой стадии образуется супероксид анион-радикал (Ог"")- источник всех АФК в живых системах. АО взаимодействуют с 02"", обрывая тем самым цепные радикальные процессы.
Поскольку в биологических системах "поглотителями" свободных радикалов являются АО, представляет интерес изучить их влияние на процесс восстановления кислорода. АО проявляют слабые кислотные свойства. Донорами протонов были жирорастворимые АО: ретинол и сс-токоферол, содержащие в структуре молекул ОН-группировки. При введении АО электрохимические характеристики пика восстановления 02 изменялись. Он увеличивался по высоте и смещался в область более положительных потенциалов. С увеличением концентрации АО ток при потенциалах образования 02 " линейно растет (рис. 18). Рис. 18. Вольтамперограммы восстановления кислорода на стеклоуглеродном электроде на фоне 0,05 М (C2H5)4NI в диметилформамиде в присутствии ретинола; С(М): 1 - 0; 2 - 2,4x10 4; 3 - 7,11x10"4; 4 - 1,17x10 3, скорость изменения потенциала 200 мВ/с. Восстановление кислорода в присутствии АО протекает обратимо, о чем свидетельствует наличие анодного пика на циклических вольтамперограммах и разность потенциалов анодного и катодного пиков, близкая к 60 мВ (рис. 19). Рис. 19.
Циклические вольтамперограммы восстановления кислорода на стеклоуглеродном электроде на фоне 0,05 М (СгЬ М в диметилформамиде в присутствии (1) 0 и (2) 1.2x10" М а-токоферола. Сопоставление полученных и литературных данных позволяет говорить о том, что восстановление кислорода в присутствии АО протекает по ЕС-механизму, и имеет место протонизация супероксид анион-радикала. Как известно, образующийся свободный радикал АО менее активен, чем исходный Ог"". По полученным вольтамперограммам рассчитаны константы скорости взаимодействия АО с супероксид анион-радикалом по величине относительного прироста тока восстановления кислорода в присутствии протонирующего агента [177]. Они составили 2,97х103 л/моль-с для ретинола и 2,1 Ох 10 л/моль-с для ос-токоферола. Полученные результаты позволили предложить методику определения АО по относительному приросту тока восстановления кислорода в их присутствии. Параметры градиуровочных зависимостей приведены в таблице 23. Таблица 23. Параметры градуировочных зависимостей относительного прироста тока восстановления кислорода на стеклоуглеродном электроде на фоне 0,05 М (C2H5)4NI в диметилформамиде от концентрации ретинола и ос-токоферола. Результаты определения ретинола и а-токоферола в модельных растворах представлены в таблице 24. Правильность оценивали по методу "введено" - "найдено". По разработанной методике определено содержание действующего вещества (ретинола и а-токоферола) в фармпрепаратах (таблица 25). Обращает на себя внимание кажущаяся противоречивость понятий восстановленная форма кислорода (Ог ) как реагент на антиокислитель, который, если исходить из названия, скорее должен реагировать с окислителем. Видимо, биологические АО - это группа органических соединений, "работающих" против АФК, то есть как "антикислородники". Последний термин ближе отражает химические свойства АО в реакциях с АФК.
Антиоксидантная емкость крови и тип мембраны диализатора
В условиях эксперимента для гемодиализа применяли полисульфоновые мембраны двух типов F6 и F60(S). При использовании мембраны с иными качественными характеристиками (F60(S)) наблюдается уменьшение Поскольку материал мембраны и рабочая поверхность остаются неизменными, то наблюдаемая закономерность для цельной крови, вероятно, связана с размерами пор мембраны, а именно с их увеличением, что приводит к выведению не только низкомолекулярных соединений, но и молекул средней величины. Это, в свою очередь, способствует более интенсивному удалению креатинина, фосфатов, инулина, мочевой кислоты, и даже альбумина (до 0,001 мл/мин), последние из которых проявляют ярко выраженные антиоксидантные свойства, взаимодействуют с электрогенерированным бромом. АОЕ плазмы крови остается неизменной независимо от типа используемой мембраны. Поэтому можно сделать вывод, что большой вклад в интегральную АОЕ по брому вносят высокомолекулярные соединения, реагирующие с электрогенерированным бромом, в частности, Fe-содержащие порфирины, так называемый пул которых находится в цельной крови. Помимо АОЕ, у пациентов определялись клинические (гематокрит, гемоглобин, СОЭ, эритроциты, лейкоциты) и биохимические (мочевина, креатинин, содержание К+, Na+, Са2+) показатели крови. Проведенный корреляционный анализ показал, что существует линейная зависимость между АОЕ цельной крови и некоторыми клинико биохимическими показателями крови. Результаты представлены в таблице 33. Корреляция с гемоглобином, вероятно, связана с содержанием порфиринов, которые вносят вклад в интегральную АОЕ. Аналогично можно объяснить и зависимость от гематокрита, тоже отражающего количество Fe-содержащих порфиринов, так как представляет собой соотношение содержания форменных элементов крови к ее жидкой части. Наблюдаемую прямо пропорциональную зависимость между АОЕ крови и мочевиной, а также креатинином сложно объяснить однозначно. Креатинин и мочевина - эндогенные продукты метаболизма - появляющиеся в результате клеточного распада, сопровождающегося повышением содержания ферментов и эндогенных прооксидантов, что, возможно, является толчком к выработке эндогенных АО для сохранения равновесия в системе оксиданты-антиоксиданты.
Металлы переменной валентности, такие как железо, медь, марганец и т.д., активно участвуют в реакциях одноэлектронного переноса в качестве катализаторов, что приводит к образованию радикальных частиц, например, по реакции Фентона (схема 26), в ходе которой генерируется высокореакционный гидроксильный радикал: Fe2+ (Cu+) + Н202 Fe3+ (Cu2+) + НО + НО" (26). Поэтому содержание металлов переменной валентности в плазме крови представляет интерес, поскольку несет прогностическую функцию о потенциальной интенсивности генерации активных форм кислорода. Совместно с лабораторией аналитической спектроскопии физического факультета КГУ под руководством профессора Гильмутдинова А.Х. проведено определение металлов переменной валентности в плазме крови методом атомно-абсорбционной спектроскопии.
Установлено, что содержание металлов переменной валентности (Fe, Си, Мп, Сг и Ni) в плазме крови пациентов с ХПН достоверно выше, чем в контрольной группе. Проведенный корреляционный анализ показал обратно пропорциональную зависимость интегральной АОЕ плазмы крови от концентрации Fe, Си, Мп, Сг (таблица 34). Для Ni такой корреляции не выявлено. Процессы свободнорадикального окисления играют важную роль в развитии заболеваний сердечно-сосудистой системы. Определенный интерес представляет изучение состояния антиоксидантной системы организма при врожденных патологиях сердца. Врожденные пороки сердца - врожденные патологические изменения в строении сердца и отходящих от него магистральных сосудов, нарушающих нормальную деятельность сердца и всего организма в целом. Они возникают в период внутриутробного развития плода в результате неправильного формирования сердца и крупных сосудов. Причины возникновения врожденных пороков сердца различны, как правило, это - заболевания, перенесенные матерью во время беременности (наиболее часто - краснуха, грипп). Наиболее часто встречающиеся врожденные пороки сердца - это дефекты межжелудочковой и межпредсердной перегородок сердца, незаросший артериальный проток. Сущность этих пороков состоит в наличии сброса крови под большим давлением из левых отделов в правые, что приводит к переполнению малого круга кровообращения (легких), повышению в нем давления, легочной гипертензии. А также часто встречаются транспозиция магистральных сосудов, тетрада Фалло и некоторые другие. Для установления точного диагноза необходим целый ряд диагностических процедур. В первую очередь снимается электрокардиограмма (ЭКГ), с ее помощью можно судить о наличии гипертрофии различных отделов сердца, различных нарушениях ритма. Для каждого порока сердца характерны определенные изменения ЭКГ.
По ЭКГ так же зачастую можно судить о выраженности изменений гемодинамики, наличии осложнений. Далее выполняется рентгенография грудной клетки. По рентгенограмме можно довольно точно судить об изменениях в сосудах легких, форме сердца и многом другом. Наиболее информативной и простой методикой их выявления является эхокардиография. С помощью ультразвуковых волн возможно визуализировать внутренние структуры сердца, увидеть наличие дефектов перегородок сердца, изменения клапанов, другие аномалии развития структур сердца. К сожалению, не всегда точный диагноз порок сердца можно установить с помощью этого метода. В таких случаях для уточнения диагноза приходится прибегать к помощи инвазивных методов обследования, к которым относится чрезвенное и чрезартериальное зондирование сердца. Сущность методики состоит в том, что в сердце и магистральные сосуды вводится зонд, с помощью которого измеряется давление в полостях сердца и вводится специальное рентгенконтрастное вещество. В это время снимается фильм в рентгеновских лучах, в результате чего на фильме видно подробное внутреннее строение сердца и магистральных сосудов [197]. Проведено исследование уровня АОЕ крови у пациентов с врожденными патологиями сердца. Определена интегральная АОЕ артериальной и венозной крови в ходе зондирования из разных отделов сердца. Установлено, что АОЕ венозной и артериальной крови достоверно отличаются. Результаты представлены в таблице 35. Параллельно определялась оксигенация крови. Проведенный корреляционный анализ показал, что существует обратно пропорциональная зависимость между АОЕ крови и содержанием в ней кислорода (таблица 36).
Похожие диссертации на Электрохимические методы оценки интегральной антиоксидантной емкости медико-биологических объектов
